不同濃度游離脂肪酸對HA-VSMC增殖活性的影響*

楊興文，馬小芳，李德紅，顏 麗，袁秀梅，楊曉燕，楊 陽，司玉春

1.甘肅省人民醫(yī)院檢驗中心，甘肅蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院麻醉手術(shù)科，甘肅蘭州 730000

游離脂肪酸(FFA)又稱非酯化脂肪酸，大部分FFA與清蛋白結(jié)合存在于血液中，正常情況下血清FFA含量很少。血清中FFA水平與脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關(guān)。在某些病理狀態(tài)(如糖尿病、代謝綜合征和脂代謝紊亂)下，血清FFA水平升高。過高的FFA水平引起的高FFA血癥與代謝綜合征、動脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征、心力衰竭等疾病的發(fā)生和發(fā)展顯著相關(guān)[1]。FFA是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的物質(zhì)之一[2]，其水平升高引起的氧化應(yīng)激是心血管疾病尤其是糖尿病大血管病變的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA通過多種途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增生，促進(jìn)血管疾病的發(fā)生發(fā)展[3-4]。本研究通過培養(yǎng)的人主動脈血管平滑肌細(xì)胞(HA-VSMC)，了解不同濃度FFA和不同作用時間對HA-VSMC增殖活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料來源 正常HA-VSMC購買自美國ATCC細(xì)胞庫；胎牛血清購買自杭州四季青生物公司；DMEM培養(yǎng)基、棕櫚酸和MTT試劑購買自美國Sigma公司；0.25%胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液(PBS)購買自北京索萊寶生物公司；無游離脂肪酸胎牛血清清蛋白購買自上海生工生物公司；5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)熒光染色試劑盒購買自廣州銳博生物公司；DMSO購買自碧云天生物公司。Thermo?RMK3型酶標(biāo)儀購買自上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司;RIX71-A12FL/PH型熒光倒置顯微鏡購買自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1HA-VSMC的體外培養(yǎng) 將HA-VSMC接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃、50%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況每1～2天更換培養(yǎng)液1次，當(dāng)細(xì)胞在對數(shù)生長期時，用于實驗。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞存活率 (1)0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的HA-VSMC；(2)PBS吹打，收集于15 mL離心管中以1 000 r/min離心5 min；(3)棄去PBS后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液后細(xì)胞計數(shù)；(4)以1.4×105個/毫升密度接種于96孔板，空白組只加培養(yǎng)液和DMSO，對照組和實驗組加培養(yǎng)液、MTT、DMSO，每組設(shè)5個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，在實驗組中加含不同濃度FFA(25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)的DMEM完全培養(yǎng)液孵育24、48 h；(5)每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT溶液后繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min；(6)用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測吸光度(A)值，計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)。以上步驟1～4均在無菌條件下進(jìn)行。

1.2.3EdU熒光染色法檢測細(xì)胞增殖活性 (1)96孔板接種和處理細(xì)胞同1.2.2所述；(2)每孔加入100 μL 50 μmol/L的EdU培養(yǎng)基孵育2 h，棄培養(yǎng)基；(3)PBS清洗2次，每次5 min；(3)每孔加入50 μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄固定液；(4)每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5 min，棄甘氨酸液；(5)每孔加入100 μL滲透劑(0.5%Triton X-100的PBS)滲透10 min；PBS洗1次，5 min；(6)每孔加入100 μL 1×Apollo?488熒光染料避光、室溫、孵育30 min后，棄染色反應(yīng)液；(7)每孔加入100 μL滲透劑(0.5%Triton X-100的PBS)脫色搖床清洗3次，每次10 min，棄滲透劑；(8)每孔加入100 μL甲醇清洗2次，每次5 min；PBS清洗1次，每次5 min；(9)每孔加入100 μL Hoechst33342反應(yīng)液避光、室溫孵育30 min，棄染色反應(yīng)液；(10)每孔加入100 μL后PBS清洗1～3次后用熒光顯微鏡(藍(lán)光激發(fā))觀察并拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度FFA對HA-VSMC形態(tài)學(xué)的影響 不同濃度FFA對HA-VSMC形態(tài)學(xué)的影響見圖1，100、200和400 μmol/L組較對照組HA-VSMC濃密，緊貼細(xì)胞瓶底，細(xì)胞間連接緊密且有劑量依賴性；500、600 μmol/L組較對照組HA-VSMC稀疏，開始出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變。

注：A～F分別表示對照組及100、200、400、500、600 μmol/L組HA-VSMC培養(yǎng)48 h形態(tài)。

2.2不同濃度FFA處理后HA-VSMC存活率 采用不同濃度FFA處理HA-VSMC 24和48 h后檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，處理24 h后，100、200、300、400、500、600 μmol/L組存活率均高于對照組(P<0.01)；處理48 h后，50、100、200、300、400、500、600 μmol/L組存活率均高于對照組(P<0.01)。兩個時間段400 μmol/L組存活率均最高。見表1。

表1 不同濃度FFA處理后HA-VSMC存活率(%)

2.3EdU熒光染色法檢測不同濃度FFA對HA-VSMC增殖活性的影響 EdU熒光染色法結(jié)果顯示，100、200和400 μmol/L組較對照組HA-VSMC增殖活性明顯增強；500和600 μmol/L組較對照組HA-VSMC增殖活性明顯減低；各實驗組中400 μmol/L組HA-VSMC增殖活性最強。見圖2。

注：A、B、C、G、H、I分別為對照組及100、200、400、500、600 μmol/L組Hoechst染色結(jié)果；D、E、F、J、K、L分別為對照組及100、200、400、500、600 μmol/L組EdU染色結(jié)果。

3 討 論

心腦血管疾病已成為危害中國及世界人口健康的“第一殺手”,如何提高心腦血管疾病的診治和預(yù)防水平已成為迫切需要解決的重大醫(yī)學(xué)和社會問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA與血管病變的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)[5]，F(xiàn)FA在誘導(dǎo)血管炎癥和動脈粥樣硬化中起重要作用，脂代謝紊亂產(chǎn)生大量FFA參與動脈粥樣硬化的形成[6-7]，2型糖尿病、糖耐量減低、肥胖、代謝綜合征等患者血清FFA水平顯著升高[8]。FFA水平的升高刺激血管壁細(xì)胞發(fā)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，其中引起的內(nèi)皮細(xì)胞活化和VSMC增殖和遷移是最顯著的[9]。VSMC開始增殖并朝著血管內(nèi)腔遷移，從而引起血管壁的增厚及狹窄產(chǎn)生動脈粥樣斑塊，可導(dǎo)致冠心病及中風(fēng)等嚴(yán)重臨床后果[10]。

本實驗采用不同濃度的FFA處理HA-VSMC，嘗試在體外建立FFA對血管作用模型，用MTT法和EdU熒光染色法來觀察HA-VSMC存活率和增殖活性。MTT法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其炔羥基團在天然化合物中很少見，在細(xì)胞增殖時能夠插入正在復(fù)制的DNA分子中，基于EdU與染料的共軛反應(yīng)可以進(jìn)行高效快速的細(xì)胞增殖檢測分析，可以有效地檢測處于S期的細(xì)胞數(shù)。EdU熒光染色法可直接通過DNA復(fù)制檢測細(xì)胞增殖，該方法簡單、靈敏、快速、準(zhǔn)確，適合各種細(xì)胞系和動物體內(nèi)組織器官的細(xì)胞增殖檢測，目前在細(xì)胞增殖方面的應(yīng)用逐漸增多[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的FFA(≤400 μmol/L)能誘導(dǎo)HA-VSMC增殖，且有時間和劑量依賴性，隨著濃度的增高和時間的延長，細(xì)胞增殖活性增強；高濃度的FFA(>500 μmol/L)能使HA-VSMC增殖減弱并出現(xiàn)凋亡的形態(tài)改變。

近幾十年中，心臟病學(xué)家在研究動脈粥樣硬化、冠心病機制及冠心病預(yù)防的臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)參與了動脈粥樣硬化和血栓形成[10]。研究認(rèn)為，血管病變是一種慢性炎癥反應(yīng)性疾病。炎癥過程中涉及多種因素以不同的形式參與血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[10]。高嘯波等[12]也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA能引起HA-VSMC表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)，TLR4/核因子(NF)-κB信號通路介導(dǎo)了軟脂酸誘導(dǎo)的HA-VSMC的MCP-1基因表達(dá)。以上研究結(jié)果說明，F(xiàn)FA引起的HA-VSMC增殖可能與FFA引起的血管無菌性炎癥有關(guān)，這為臨床通過抗炎治療動脈硬化等血管疾病提供了新思路和實驗依據(jù)，具體機制有待進(jìn)一步研究。