基于GEO數(shù)據(jù)庫的產(chǎn)后抑郁癥關(guān)鍵差異表達基因分析

賈 穎，卓 頻，趙 爽，胡文燕

天津倍科為醫(yī)學(xué)檢驗實驗室，天津 301799

產(chǎn)后抑郁癥(PPD)是指女性在產(chǎn)褥期發(fā)生的一種嚴重的情緒障礙疾病，其臨床發(fā)病率為10%～15%[1-2]。其癥狀包括負面情緒(如悲傷、焦慮、絕望等)，思維遲緩，睡眠障礙，精力不足，迫害妄想，甚至出現(xiàn)傷害嬰兒或自殺行為等[1]。PPD不僅嚴重影響產(chǎn)褥期女性的健康，同時還會損害正常的母嬰關(guān)系，影響到后代的正常生長發(fā)育[2]。

研究表明，免疫系統(tǒng)參與了重性情緒障礙疾病的發(fā)生發(fā)展。對于產(chǎn)褥期女性而言，從妊娠期到產(chǎn)褥期的過渡伴隨著復(fù)雜的免疫適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)[3]，產(chǎn)后階段的特征是細胞因子水平升高，免疫細胞浸潤增多[4-5]，與妊娠晚期相比，產(chǎn)褥期T調(diào)節(jié)細胞(Treg細胞)亞群顯著增加[5]。PPD的病理生理機制復(fù)雜，免疫調(diào)節(jié)功能障礙可能與PPD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。盡管有研究表明，抗/促炎細胞因子白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、C反應(yīng)蛋白和皮質(zhì)醇等可以作為PPD外周血生物標志物[6]，還有研究表明，PPD的發(fā)生與雌激素受體α基因(ESR1)、5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白(5-HTT)等基因表達有關(guān)[4]，但PPD與免疫相關(guān)的病理生理機制仍不清楚，還需要進行更多深入的系統(tǒng)研究。

近年來，基因測序技術(shù)與生物信息學(xué)分析相結(jié)合的研究策略為從分子水平識別生物標志物和理解精神障礙疾病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)提供了強有力的工具[7]，本研究旨在利用生物信息學(xué)分析方法從PPD患者的轉(zhuǎn)錄本表達層面來探明產(chǎn)褥期女性體內(nèi)可能發(fā)生的與PPD相關(guān)的免疫相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)與生物學(xué)變化，并尋找外周血中PPD潛在的生物標志物，以期為闡明PPD的疾病生理機制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1材料來源 登錄NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，選擇GEO Data Sets，輸入“postpartum depression”檢索相關(guān)數(shù)據(jù)，根據(jù)研究樣本及類別篩選出符合條件的芯片。選取編號為GSE45603的芯片數(shù)據(jù)及其注釋文件進行下載(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45603)。數(shù)據(jù)來自GPL10558 Illumina Human HT-12V4.0 expression bead chip。選取GSE45603中的16例產(chǎn)褥期PPD患者樣本以及5例健康對照樣本進行分析。

1.2篩選差異表達基因 利用R語言(V3.6.2)對原始基因進行二次分析，選取limma包對芯片數(shù)據(jù)的差異表達基因進行分析，為了得到更多的差異表達基因，將顯著差異表達基因的篩選條件設(shè)定為P<0.05，差異倍數(shù)|logFC|>0.5，其中，logFC>0.5的基因作為上調(diào)基因，logFC<-0.5的基因作為下調(diào)基因，得到差異表達基因文件后運用plot包繪制火山圖。

1.3差異表達基因的功能富集分析 利用metaspace軟件對篩選出的差異表達基因進行基因注釋，并進行基因本體論(GO)中的生物學(xué)過程和代謝通路的功能富集分析。選取注釋到GO功能富集的前10位進行柱狀圖展示，選取注釋到代謝通路富集的前10位進行氣泡圖展示。

1.4構(gòu)建差異表達基因編碼的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)及篩選關(guān)鍵基因 通過metaspace軟件對差異表達基因進行PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析，按照默認參數(shù)值(physical score > 0.132，STRING)篩選出互作蛋白對。先將所有的差異表達基因進行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，之后采用MCODE算法識別蛋白質(zhì)緊密相連的鄰近區(qū)域，將網(wǎng)絡(luò)進行聚類，對得到的差異表達基因進行注釋，并選取校正后P值最小的前3位代謝通路放入列表進行展示。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)聚類中差異表達基因的得分值(Cluster-Score>1)篩選參與免疫相關(guān)生物學(xué)過程及代謝通路的核心關(guān)鍵基因。

2 結(jié) 果

2.1差異表達基因的篩選 獲得了714個差異表達基因(圖1)，包括149個上調(diào)基因及565個下調(diào)基因。

注：淺灰色部分為上調(diào)基因，黑色部分為下調(diào)基因。

2.2差異表達基因的GO功能富集分析和代謝通路富集分析 應(yīng)用metaspace軟件對得到的差異表達基因進行GO功能富集分析(圖2)和代謝通路富集分析(圖3)。GO功能富集分析結(jié)果表明，差異表達基因主要集中在細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、樹突狀細胞分化的調(diào)節(jié)、樹突狀細胞分化、適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、免疫效應(yīng)過程、參與免疫反應(yīng)的白細胞激活、白細胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)、白細胞分化、T細胞活化等生物學(xué)過程中。代謝通路分析結(jié)果表明，差異表達基因在中性粒細胞脫粒、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)、淋巴細胞和非淋巴細胞之間的免疫調(diào)節(jié)相互作用，抗原加工和呈遞等通路中顯著富集。

圖2 GO功能富集(前10位)

圖3 代謝通路富集(前10位)

2.3差異表達基因的關(guān)鍵MCODE模塊及關(guān)鍵差異表達基因篩選 分析得到4個關(guān)鍵MCODE模塊及其對應(yīng)的功能與代謝通路信息(表1)。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)聚類中差異表達基因的得分值(Cluster-Score>1)篩選出11個參與免疫相關(guān)生物學(xué)過程及代謝通路的關(guān)鍵差異表達基因，其中，CD3G、CD8A、CD8B、ABL1、CCR7、CXCR6表達顯著上調(diào)(P<0.05，logFC>0.5)，而HLA-G、HLA-C、CCR1、SSTR2、LPAR2表達顯著下調(diào)(P<0.05，logFC<-0.5)。

表1 差異表達基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖對應(yīng)注釋信息

3 討 論

PPD是產(chǎn)褥期女性常見的精神系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升趨勢。PPD的發(fā)病因素多樣，與產(chǎn)褥期女性的遺傳、心理、社會、生理以及免疫等因素相關(guān)，會給個人、新生兒以及家庭和社會帶來一系列不良后果[2]。隨著國家二孩、三孩政策的實行，妊娠期產(chǎn)褥期女性越來越多，為防止更多的產(chǎn)褥期女性發(fā)展成為PPD，及時的診斷和干預(yù)十分重要。

從生物因素的角度，目前已有研究揭示了PPD與女性產(chǎn)褥期激素異常波動以及體內(nèi)產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)功能障礙有關(guān)[3]，但是未闡明PPD的具體發(fā)病機制，還需要更多更深入的研究進行分析。

本研究對得到的差異表達基因進行GO功能富集分析并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，PPD患者體內(nèi)免疫功能失調(diào)，白細胞、T細胞活化，樹突狀細胞成熟，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)增強，但抗原呈遞功能減弱。有研究指出，抑郁癥患者體內(nèi)免疫功能障礙的來源可能與感染、微生物組的改變、疾病、壓力和其他因素相關(guān)[6]，本研究顯示，PPD患者體內(nèi)細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)活動增強，提示患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)增強，其可能來源于患者產(chǎn)褥期虛弱、經(jīng)受病原微生物感染或其他壓力性因素。

對于得到的11個關(guān)鍵的差異表達基因，研究表明，CD3G是CD3分子的一種亞型，CD3分子在轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞受體(TCR)識別抗原所產(chǎn)生的活化信號中起重要作用[8]；CD8+T細胞主要參與抗病毒免疫、抗腫瘤免疫及移植排斥反應(yīng)。CD8分子主要表達于細胞毒性T細胞表面，能與MHCⅠ類抗原結(jié)合，增強TCR識別靶細胞(如病毒感染細胞、腫瘤細胞等)表面的p-MHCⅠ類分子復(fù)合物。CD4與CD8分子比例下降提示免疫系統(tǒng)受到損傷[9]。鄔賢鳳等[10]的研究結(jié)果顯示，PPD患者CD3、CD4表達水平顯著下降，而CD8表達水平顯著上升，同時相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PPD與CD3、CD4表達水平及CD4/CD8呈負相關(guān)，而與CD8表達水平呈正相關(guān)。該結(jié)果與本研究中CD8基因表達顯著上調(diào)結(jié)果一致，提示PPD患者體內(nèi)T細胞免疫功能下調(diào)。ABL1蛋白主要參與細胞的分化、分裂與應(yīng)激反應(yīng)等，ABL1蛋白的SH3結(jié)構(gòu)域的缺失會使ABL1成為原癌基因，從而導(dǎo)致細胞發(fā)生癌變。HLA-G與HLA-C均屬于非經(jīng)典HLA-Ⅰ類分子，有研究報道HLA基因的下調(diào)可能導(dǎo)致抗原提呈減少，從而促進腫瘤免疫逃逸[11]。也有研究表明，一些病毒，如EB病毒(EBV)可以通過抑制抗原提呈而有效逃避免疫系統(tǒng)細胞毒性T細胞的識別，避免免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[12]。CCR7基因編碼的蛋白質(zhì)是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，該受體被認為是EBV感染B細胞的介質(zhì)[13]，在各種淋巴組織中表達并激活B和T細胞，可以控制記憶T細胞向炎癥組織的遷移，并刺激樹突狀細胞成熟。趨化因子CCR1及其受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于效應(yīng)免疫細胞招募到炎癥部位至關(guān)重要，與多種人類疾病有關(guān)，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、多發(fā)性骨髓瘤和相關(guān)的溶骨性疾病[14]。研究顯示，CCR1持續(xù)表達于嗜中性粒細胞、單核細胞、T和B細胞等免疫細胞表面[15]。CXCR6主要在幾個T細胞亞群和骨髓基質(zhì)細胞中表達，參與調(diào)節(jié)T細胞向各種外周器官組織(肝、脾紅髓、腸、肺和皮膚)遷移的信號通路，并促進細胞與樹突狀細胞和成纖維細胞網(wǎng)狀細胞的相互作用[16]。本研究中CCR7與CXCR6表達上調(diào)，而CCR1表達下調(diào)，提示PPD患者體內(nèi)可能存在由于病毒感染引起的炎癥反應(yīng)。SSTR2可介導(dǎo)生長抑素的釋放，從而抑制內(nèi)皮細胞增殖以及誘導(dǎo)細胞凋亡，此外，SSTR2參與機體內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)，其低表達有可能促進腫瘤細胞增殖、遷移作用[17]。LPAR2蛋白作為溶血磷脂酸(LPA)受體，可能在LPA促進腫瘤細胞遷移的過程中起主要作用[18]。本研究中，SSTR2和LAPR2顯著下調(diào)，表明PPD患者體內(nèi)免疫功能低下。鑒于EBV是一種人群易感病毒，感染率高達90%，而在PPD患者體內(nèi)可能存在EBV逃逸免疫識別，同時增殖活化T細胞，引起免疫系統(tǒng)損傷的路徑，進而導(dǎo)致PPD的發(fā)生，但還需更多研究來證明該機制的可能性。

本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE45603芯片數(shù)據(jù)，得到與免疫相關(guān)的4個關(guān)鍵MCODE模塊以及11個關(guān)鍵差異表達基因，這11個關(guān)鍵差異表達基因可作為PPD早期檢測的潛在分子標志物。此外，本研究從分子功能與生物過程及代謝通路的角度進一步闡述了PPD可能的發(fā)病機制，為PPD的發(fā)生發(fā)展尋找新的作用靶點提供了新的思路。但是PPD的病理生理機制復(fù)雜，本研究僅關(guān)注PPD與免疫相關(guān)的差異表達基因及其代謝通路，研究結(jié)果還需要進一步的臨床試驗進行驗證。