沉默OGFR基因?qū)Ψ切〖毎伟〢549細胞株增殖、遷移和侵襲能力的影響

石碩，陳銘伍

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科，廣西南寧 530021

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，全世界每年報道約180萬例肺癌新發(fā)病例，占所有新發(fā)癌癥病例的12.9%[3]。三分之一的肺癌新發(fā)和致命病例發(fā)生在中國，對人類健康構(gòu)成巨大威脅[4]。大多數(shù)肺癌病例是惡性上皮腫瘤，包括非小細胞肺癌（NSCLC，85%）和小細胞肺癌（15%）[5]。NSCLC臨床癥狀具有隱匿性，大多數(shù)患者在確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，很大一部分患者不能耐受以手術為主的傳統(tǒng)治療[6-7]。此外，手術成功的患者經(jīng)常出現(xiàn)腫瘤耐藥性，導致放化療失敗，腫瘤復發(fā)甚至死亡[8]。目前免疫治療和以抗血管形成為主的靶向治療雖已廣泛應用，但多數(shù)患者使用靶向藥物治療后9～13個月會產(chǎn)生耐藥[9]。因此探討新的廣譜的分子靶向藥物已成為當代醫(yī)學研究的熱點。有研究表明，麻醉和手術期間的可改變條件可能會影響癌癥復發(fā)，其中一個因素是阿片類藥物的用量，接受大量阿片類藥物全身麻醉的患者比接受局部麻醉或阿片類藥物量較低的患者表現(xiàn)出更多的癌癥進展或復發(fā)[10]。阿片生長因子受體（OGFR）是一種廣泛存在于多種細胞的細胞調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)細胞分裂和分化[11]，具有促血管生成的作用[10]。GOLDENBERG等[12]研究證實，OGFR可促進肝癌、胃腸道腫瘤等多種癌細胞增殖，同時發(fā)現(xiàn)多種疾病存在OGFR表達差異。筆者前期通過基因芯片TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)，OGFR基因與NSCLC發(fā)生發(fā)展密切相關。因此，本研究探討了在體外沉默OGFR基因?qū)SCLC常用細胞系——人肺腺癌細胞系A549細胞株生物學行為的影響，期待為NSCLC的靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細胞株購自廣西醫(yī)科大學生命科學院細胞庫?？俁NA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和cDNA擴增試劑盒均購自日本TaKaRa公司，小干擾RNA由湖州河馬生物科技有限公司合成，蛋白標記（Marker）、兔多抗GAPDH、兔多抗OGFR一抗以及抗兔二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司，CCK-8細胞增殖試劑盒購自美國MCE公司，胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、胰蛋白酶EDTA（0.25%）及酚紅均購自美國Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 在37℃、5% CO2環(huán)境條件下，將A549細胞株培養(yǎng)在含10%滅活胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。顯微鏡下觀察A549細胞株生長狀態(tài)，當細胞融合度達到70%～80%時，用胰酶進行消化，對A549細胞株進行培養(yǎng)傳代，選擇對數(shù)生長期的A549細胞株進行實驗。于轉(zhuǎn)染前24 h，將處于對數(shù)生長期的A549細胞株接種于6孔板中，細胞融合度達到70%時進行細胞轉(zhuǎn)染。將細胞分為對照組、實驗組，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染si-NC陰性對照、OGFR特異性的小干擾RNA，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h換液，18～48 h后檢測目的基因的表達情況。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，發(fā)出明亮的綠色熒光者為陽性細胞。轉(zhuǎn)染效率（%）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細胞中OGFR mRNA檢測 采用RT-qPCR。收集轉(zhuǎn)染48 h后兩組細胞，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA并擴增進行qPCR檢測。反應條件：預變性95℃30 s，1個循環(huán)；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。OGFR引物正義序列：5'-UAGAACUCAGUUGGCGTT-3'，反 義 序 列 ：5'-GCCAACAGUUUUUCUATT-3'；內(nèi)參GAPDH引物正義序列：5'-TCAAGAAGACGGTGAAGCAGG-3'，反義序列：5'-TCAGAAGGTAGGGGACAGGT-3'。 用 2-ΔΔCt法 分 析各組細胞中OGFR mRNA相對表達量。

1.4 細胞中OGFR蛋白檢測 采用Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染48 h后兩組細胞，加入細胞裂解液，抽提蛋白后用BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，后使蛋白變性。取30 μg蛋白上樣行凝膠電泳，電泳結(jié)束后使用濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，封閉2 h（5%的脫脂奶粉），在4℃下分別孵兔源一抗OGFR，GADPH 4℃孵育過夜（稀釋倍數(shù)1∶2 000）。24 h后，取出細胞室溫下復溫1.5 h，用等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3次，加入通用型羊抗兔二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次。用凝膠成像系統(tǒng)進行顯影，ImageJ軟件測灰度 值，隨后記錄統(tǒng)計分析組織中蛋白的測定。

1.5 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。取轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h的兩組細胞，以5×103/孔的密度轉(zhuǎn)移到平板上。各孔均加入CCK-8染色劑，添加染色劑后，將細胞在37℃下培養(yǎng)6 h。隨后，收集細胞懸浮液，采用酶標儀在450 nm處測定光密度（OD）值。

1.6 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。取轉(zhuǎn)染48 h后兩組細胞，調(diào)整細胞密度為1～5×105個/孔，向每組 Transwell小室上室中加入 100 μL相應細胞懸液，下室中加入800 μL含有青霉素鏈霉素的培養(yǎng)基。37°培養(yǎng)箱溫育20～24 h，用棉簽去除小室上層細胞，用結(jié)晶紫溶液室溫下染色后，室溫中放置20 min，以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）浸洗。在顯微鏡下觀察拍照，每個樣本隨機選擇5個視野計數(shù)，取平均值。

1.7 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。取轉(zhuǎn)染48 h后兩組細胞，接種于6孔板，Marker筆在培養(yǎng)板后均勻劃間距為0.5 cm的橫線，每孔中鋪1×105個細胞，細胞融合度≥80%時用無菌移液槍槍頭在單層細胞沿底部劃出“一”字劃痕，PBS沖洗3次，培養(yǎng)24 h后于固定位置用顯微鏡拍照，并計算劃痕愈合率。細胞遷移率=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.8 細胞克隆形成能力檢測 采用平板克隆形成實驗。收集轉(zhuǎn)染48 h后兩組細胞，制備細胞懸液，分別以300個/孔接種到6孔板中。將6孔板置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，直至細胞克隆形成。用4%多聚甲醛固定15 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去染液，風干后在倒置顯微鏡下隨機取5個視野觀察，判斷細胞克隆形成情況并計數(shù)大于50個克隆數(shù)的集落，實驗重復3次取平均值。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件及Graph Pad軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student'st檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細胞中OGFR mRNA表達比較 實驗組、對照組細胞中OGFR mRNA相對表達量分別為0.16±0.03、1.00±0.03，兩組比較P＜0.05。

2.2 兩組細胞中OGFR蛋白表達比較 實驗組、對照組細胞中OGFR蛋白相對表達量分別為0.18±0.05、0.53±0.03，兩組比較P＜0.05。

2.3 兩組細胞增殖能力比較 實驗組培養(yǎng)0、24、48、72 h細 胞 增殖 OD 值分別為 0.139±0.015、0.347±0.005、0.372±0.004、0.425±0.003，對照組分別為 0.134±0.018、0.501±0.019、0.676±0.023、0.714±0.022，兩組24、48、72 h細胞增殖OD值比較P均＜0.05。

2.4 兩組細胞侵襲能力比較 實驗組、對照組遷移穿膜細胞數(shù)分別為（18±2）、（30±2）個，兩組比較P＜0.05。

2.5 兩組細胞遷移能力比較 實驗組、對照組細胞遷移率分別為（30.13±6.33）%、（61.86±5.32）%，兩組比較P＜0.05。

2.6 兩組細胞克隆形成能力比較 實驗組、對照組克隆形成細胞集落數(shù)分別為（115±1）、（211±6）個，兩組比較P＜0.05。

3 討論

OGFR是一種含有677個氨基酸的蛋白質(zhì)，由20號染色體處的OGFR基因編碼，是一種廣泛存在于多種細胞中的受體。OGFR可與阿片生長因子（OGF）特異性結(jié)合，其調(diào)控軸不僅具有神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫調(diào)節(jié)活性，而且也具有直接的抗腫瘤活性[13]。近年來，在多種類型的癌癥中均發(fā)現(xiàn)OGFROGF對腫瘤細胞的生物學行為有調(diào)控作用。一項研究表明，OGF是細胞通過自分泌產(chǎn)生的阿片類肽，可顯著降低使用放射性標記胸腺嘧啶核苷中的DNA合成，從而調(diào)控有絲分裂和細胞的增殖，OGFR與OGF結(jié)合后可通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依賴性抑制性激酶，作用于細胞周期，誘導細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p16和p21的上調(diào)，導致Rb磷酸化抑制和在細胞周期S期停滯，從而對細胞的生物學行為產(chǎn)生影響[14-15]。CHENG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，OGF通過網(wǎng)格蛋白小干擾RNA受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞膜，隨后通過細胞質(zhì)中的OGFR進一步轉(zhuǎn)移到核內(nèi)發(fā)揮作用，整個OGF進入細胞核的轉(zhuǎn)運過程依賴于核定位信號并通過karyopherinβ1受體介導的核漿轉(zhuǎn)運。ZHENG等[17]研究發(fā)現(xiàn)OGFR-OGF調(diào)控軸是介導上皮性卵巢癌中LINC00673致癌作用的潛在下游靶點，促進腫瘤的遷移、侵襲和細胞生長。還有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染OGFR cDNA后的胰腺細胞，轉(zhuǎn)染組腫瘤發(fā)生率增加了45%，腫瘤體積增加了60%，且在隨后的研究中證明，OGFR-OGF調(diào)控軸在三陰性乳腺癌MDA-MD-231、BT-20等細胞株的增殖中起決定性作用[18-19]。AVELLA等[20]采用高通量測序分析以篩選肝癌細胞中HOTAIR的下游效應因子，發(fā)現(xiàn)OGFR在肝癌組織中顯著表達，并且發(fā)現(xiàn)HOTAIR可與OGFR的啟動子區(qū)域結(jié)合，提高其轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)控肝癌細胞增殖過程。且有研究證實，OGF、OGFR在甲狀腺乳頭狀癌組織及正常組織中發(fā)揮著細胞增殖調(diào)控作用[21-22]。

為明確OGFR在NSCLC中的生物學功能，本研究采用小干擾RNA技術沉默實驗組A549細胞株中的OGFR基因，實驗組OGFR mRNA、蛋白相對表達量較對照組降低，表明轉(zhuǎn)染成功。本研究采用CCK-8實驗、平板克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)實驗組24、48、72 h細胞增殖OD值及克隆形成細胞集落數(shù)降低，表明抑制OGFR表達可抑制A549細胞增殖。同時，本研究細胞劃痕實驗、Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，實驗組細胞遷移、侵襲能力較對照組降低，表明OGFR對A549細胞遷移、侵襲起促進作用。本研究結(jié)果與既往的多數(shù)研究結(jié)果一致。MCLAUGHLIN等[22]將人類頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）移植到裸鼠體內(nèi)，然后使用受體結(jié)合分析和定量免疫組織化學檢測不同大小腫瘤中與SCCHN相關的OGFR mRNA和蛋白表達差異。結(jié)果顯示，OGFR的表達隨著腫瘤的增大而下降，說明在不同體積的腫瘤組織中存在著一定的表達調(diào)控差異，這也將是筆者下一步的研究重點。另外，以OGFR為代表的阿片類藥物會影響免疫細胞和炎癥反應，其在體外、體內(nèi)模型中發(fā)揮的作用可能不同，因此OGFR的機制應在體內(nèi)實驗中進一步評估。

綜上可見，沉默OGFR后A549細胞株增殖、遷移、侵襲能力降低，這為后續(xù)NSCLC的治療提供了基礎依據(jù)。