懷牛膝的化學(xué)成分和分析方法研究進(jìn)展

李存紅 符德學(xué) 侯 艷

（1.焦作市懷藥活性成分分析利用工程技術(shù)研究中心，河南 焦作 454000；2.焦作大學(xué)化工與環(huán)境工程學(xué)院，河南 焦作 454000）

牛膝為覓科植物牛膝的干燥根,又名百倍、懷牛膝、牛莖等，被《中華人民共和國藥典》(2015版)收載為常用中藥，具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行之功效[1]。河南焦作的武陟、溫縣、沁陽種植的牛膝稱為懷牛膝，是聞名中外的“四大懷藥”之一。懷牛膝的化學(xué)成分主要包括皂苷、甾酮、黃酮、糖、生物堿等，為了進(jìn)一步開發(fā)和利用懷牛膝資源，本文對懷牛膝主要化學(xué)成分研究概況和懷牛膝中活性成分的分離分析方法進(jìn)行了綜述。

1.懷牛膝的化學(xué)成分

1.1 牛膝多糖

藥理研究表明，牛膝多糖具有顯著的增強(qiáng)人體免疫功能的作用，能升高血清溶血素和脾臟內(nèi)抗體形成細(xì)胞數(shù)，激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞的活性。它還有增強(qiáng)人體骨髓造血功能、明顯抑制腫瘤生長的作用，無毒性。

方積年[2]等人從牛膝中提取到具有免疫活性的肽多糖。Yu Biao[3]等從牛膝中得到一種具有增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)活性的多糖類成分。惠永正[4]等從牛膝中分離得到一種具有免疫功能的水溶性寡糖。

1.2 牛膝皂苷

牛膝皂苷是懷牛膝的主要化學(xué)成分，牛膝皂苷主要是以齊墩果酸為苷元的三萜皂苷，該類成分一經(jīng)水解，就會生成葡萄糖醛酸、齊墩果酸等。牛膝皂苷有保肝降酶、抗腫瘤、降血脂等作用，能明顯降低血清中甘油三酯、膽固醇和脂蛋白的含量。

李娟等[5]研究了懷牛膝根中三萜皂苷類成分，將懷牛膝用乙醇提取，過濾，減壓濃縮得稀浸膏。將稀浸膏用水稀釋，用乙酸乙酯、正丁醇萃取，液相色譜分離鑒定，得到了齊墩果酸、竹節(jié)參皂苷-1,齊墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷、齊墩果酸-3-Oβ-D-(6’ -丁酯)-吡喃葡萄糖醛酸苷、齊墩果酸-3-O-β-D-(6’-甲酯)-吡喃葡萄糖醛酸苷、3-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-齊墩果酸-28-O-(β-D-吡喃葡萄糖)等三萜皂苷類化合物。

羅懿釩[6]等己整理出從牛膝中分離到的39種三萜皂苷類化合物。

1.3 甾酮類成分

甾酮類化合物也是懷牛膝的主要活性成分，懷牛膝中的甾酮類化合物主要有牛膝甾酮和蛻皮甾酮兩種。牛膝甾酮具有促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成、抑制由于藥物引起的血糖升高、降膽固醇和使受損的細(xì)胞再生的作用。

楊柳等[7]將干燥的牛膝以水煎煮提取，得水溶液提取物。水溶液提取物經(jīng)D101型大孔吸附樹脂柱色譜，用水、乙醇依次洗脫，洗脫組分經(jīng)液相色譜法分離鑒定，得到25，26-二去氫坡那甾酮A、紅莧甾酮。

王秋紅[8]等將干燥的牛膝用水反復(fù)煎煮，過濾，減壓蒸餾回收，得水溶液提取物。水溶液提取物經(jīng)D101型大孔吸附樹脂柱色譜、硅膠柱色譜、ODS反相柱色譜及制備型高壓液相色譜，從中分離得到了β-蛻皮甾酮、25S-牛膝甾酮、25R-牛膝甾酮、旌節(jié)花甾酮C、旌節(jié)花甾酮D等甾酮類化合物。

孟大利[9]用大孔樹脂、硅膠柱、氧化鋁柱、SePhadexLH-20，從牛膝中分離出牛膝甾酮A、25-R牛膝甾酮、25-S牛膝甾酮、漏蘆甾酮B、族節(jié)花甾酮D、β-蛻皮甾酮、水龍骨甾酮B、紅覽甾酮。

羅懿釩[6]等己整理出從牛膝中分離到的31 個甾酮類化合物。

1.4 生物堿類

巢志茂[10]等從懷牛膝炮制品中分離出甜菜堿并測定其含量，G.Bisht等[11]從牛膝中分離得到了生物堿類化合物。

孟大利[9]利用大孔樹脂、硅膠柱、氧化鋁柱、SePhadexLH-20、制備薄層以及制備型高壓液相色譜等色譜手段，從牛膝乙醇提取物中分離出4種生物堿，經(jīng)鑒定為小檗堿、巴馬亭、黃連堿、表小檗堿。

1.5 黃酮類

孟大利[9]從牛膝中分離出漢黃芩素、黃芩苷、蘆丁、槲皮素、山萘酚等。冬海洋等[12]從牛膝葉中得到了異槲皮素。

1.6 其他成分

冬海洋等[12]對懷牛膝葉的化學(xué)成分分析測定，共檢測到38 種化合物，其中亞油酸、牛膝甾酮A、棕櫚酸、異槲皮素、N-順式阿魏?；野?、姜狀三七苷R 1、旌節(jié)花甾酮這7種化合物相對含量達(dá)5%以上。

巢志茂等[13]以氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用，分析和鑒定了懷牛膝干燥根揮發(fā)油的化學(xué)成分:二十四烷等11個長鏈烷烴、3-壬烯-2-酮等8個酮類、十六酸等6個長鏈飽和脂肪酸、乙醛等6個醛類、己醇等6個醇類、鄰苯二甲酸二丁酯等5個酯類化合物，并指出，2，6-二甲基吡嗪、2-甲氧基-3-異丙基吡嗪和2-甲氧基-3-異丁基吡嗪可作為懷牛膝揮發(fā)油的特征性成分。

2.懷牛膝中化學(xué)成分分離方法

牛膝中生物活性成分的提取分離方法有多種，各有特點，主要有：回流提取法、超聲波提取法、加速溶劑萃取法、超臨界流體萃取法等。

回流提取法一般用乙醇、甲醇或水作溶劑進(jìn)行提取，然后回收溶劑。此方法簡便易行,能夠比較徹底地提取出牛膝中的生物活性成分；超聲提取法用超聲波強(qiáng)化提取牛膝中的生物活性成分，超聲波能破壞植物藥材的細(xì)胞,使溶媒滲透到牛膝細(xì)胞中,加速牛膝中的有效成分溶解,從而提高活性成分的提取率。

加速溶劑萃取法是Richter于1995年提出的一種萃取方法，可用于從固體牛膝藥材中提取生物活性成分。其原理是在密閉容器內(nèi)，在高溫、高壓條件下，用溶劑對牛膝樣品中的生物活性成分進(jìn)行提取。升高壓力可提高溶劑的沸點,從而提高有效成分在提取溶劑中的溶解度；升高溫度可以降低液體黏度，減少流動阻力，有利于溶劑分子向牛膝樣品基質(zhì)擴(kuò)散，縮短牛膝活性成分進(jìn)入溶劑的時間。溶劑萃取法的優(yōu)點主要是：縮短提取時間,提高提取效率，減少溶劑用量。

超臨界流體萃取是用超臨界流體作為溶劑來提取牛膝中的活性成分。物質(zhì)氣態(tài)時加壓液化允許的最高溫度稱為該物質(zhì)的臨界溫度，臨界溫度時液化所需的最小壓力是該物質(zhì)的臨界壓力。溫度和壓力處于臨界溫度和臨界壓力之上的流體稱為超臨界流體。超臨界流體既具有液體的性質(zhì)，也具有氣體的性質(zhì)，超臨界流體具有以下特點：⑴密度與液體相當(dāng)；⑵黏度接近氣體,流動阻力很??；⑶擴(kuò)散系數(shù)介于氣液之間，物質(zhì)在里面的傳遞速率很快。超臨界流體萃取法提取牛膝中活性成分時，其提取過程一般分為四個階段：⑴牛膝活性成分從牛膝樣品基質(zhì)中解析；⑵活性成分在牛膝樣品基質(zhì)中擴(kuò)散；⑶牛膝活性成分?jǐn)U散到超臨界流體中；⑷牛膝活性成分通過超臨界流體從萃取室中流出。影響超臨界流體萃取的主要因素有超臨界流體的選擇、萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、萃取流速、牛膝樣品顆粒大小。

3.懷牛膝中化學(xué)成分分析方法

懷牛膝中的生物活性成分的分析測定主要有紫外分光光度法、薄層色譜法、超臨界流體色譜法、原子吸收光譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。

紫外分光光度法是在190～800nm波長范圍內(nèi)，通過測定物質(zhì)的吸光度，進(jìn)而進(jìn)行定性和定量測定的方法。該方法通過將特定波長范圍內(nèi)樣品的光譜與對照光譜或?qū)φ掌饭庾V進(jìn)行比較，或通過確定最大吸收波長，或通過測量兩個特定波長處的吸收比值而鑒別物質(zhì)。紫外分光光度法的優(yōu)點是簡單、快速，缺點是顯色劑的選擇比較難。

薄層色譜法是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以適合的溶劑為流動相，利用各組分對同一吸附劑吸附能力不同，在流動相(溶劑)流過固定相(吸附劑)的過程中，連續(xù)地產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達(dá)到混合樣品中各組分的快速分離。

超臨界流體色譜法是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的使用超臨界流體作流動相的色譜技術(shù)?；诔R界流體的一系列優(yōu)點，超臨界流體色譜法既可以分析氣相色譜不適應(yīng)的高沸點樣品，又比高效液相色譜有更快的分析速度和更高的分離效率，擁有氣相色譜和液相色譜所沒有的優(yōu)點，應(yīng)用范圍更廣泛。

原子吸收光譜法是利用氣態(tài)原子吸收一定波長的光輻射后，原子中外層的電子會從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。由于各元素的原子結(jié)構(gòu)和外層電子的排布不同，外層電子從基態(tài)躍遷至第一激發(fā)態(tài)時吸收的能量不同，因而各元素的共振吸收線具有不同的特征，可作為元素定性的依據(jù)，吸收輻射的強(qiáng)度在線性范圍內(nèi)與被測元素的含量成正比，可作為定量的依據(jù)。原子吸收光譜法主要用于樣品中微量及痕量組分分析，其優(yōu)點是分析時間短、選擇性好、準(zhǔn)確度高、檢出限低、應(yīng)用范圍廣，其缺點是樣品前處理麻煩、線性范圍窄、不能實現(xiàn)多元素同時分析。

許海丹等[14]用乙醇沉淀干燥的牛膝粉末中的牛膝多糖，最后用乙醚、丙酮反復(fù)清洗，干燥，得到牛膝多糖固體。采用正交設(shè)計得到最佳顯色條件:5%苯酚1.0 mL,濃硫酸7.5 m L,反應(yīng)時間30 min。本方法采用UV-2401PC紫外-可見分光光度計測定吸光度（最大吸收波長482 nm），采用苯酚-硫酸法測定懷牛膝中多糖平均含量為29.4%。

衛(wèi)修來等[15]采用高氯酸-香草醛比色法,用 721型分光光度計 (測量波長544 nm)，測定了懷牛膝中總皂苷含量。

王龍等[16]以大孔吸附樹脂提取牛膝總甾酮,以50 mg·mL-1香草醛冰醋酸溶液和高氯酸作顯色劑,用紫外分光光度法(測量波長550 nm)測定了牛膝總甾酮含量。

王篤學(xué)等[17]以氯仿-甲醇-甲酸為展開劑，用薄層色譜法測定了懷牛膝中齊墩果酸的含量。

吳美涵等[18]用超臨界流體色譜法測定懷牛膝及其制劑中齊墩果酸的含量。

穆海風(fēng)等[19]用Venusil XBP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲酸-乙腈為流動相,流速1.0 mL.min-1,檢測波長250 nm,采用高效液相色譜法比較了不同產(chǎn)地樣品中β-蛻皮甾酮、R-牛膝甾酮和S-牛膝甾酮的含量差異。

張留記等[20]用ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm）,以乙腈磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL.min-1,檢測波長250 nm,采用高效液相色譜法測定了懷牛膝中β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa這5種活性成分的含量，并比較了焦作16個產(chǎn)地樣品中5種活性成分的含量差異。

李向陽等[21]以甲醇磷酸溶液為流動相，建立了反相高效液相色譜法，測定了懷牛膝中牛膝皂苷II和β-蛻皮甾酮的含量。

王建科等[22]采用火焰原子吸收光譜法，測定了懷牛膝生品及3種不同炮制品中10種微量元素的含量。

4.結(jié)語

本文綜述了懷牛膝的化學(xué)成分、分離分析方法的研究狀況。目前，國內(nèi)外研究人員已從懷牛膝中分離出大量的甾酮和皂苷類化合物，但對化學(xué)成分的藥效藥理機(jī)制研究還不夠。文獻(xiàn)已報道的懷牛膝的生物活性成分的分離分析方法有很多，這些方法分離分析時間一般比較長，可以嘗試縮短分離分析時間。另外，懷牛膝生物活性成分的藥代動力學(xué)有待進(jìn)一步研究。