Wilson病金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡研究進展

霍如尉(綜述)，朱 波(審校)

(1.南京中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，整合醫(yī)學學院，江蘇 南京 210023；2.中國藥科大學生物藥物學院，江蘇 南京 211198)

Wilson病(Wilson′s disease，WD)又稱肝豆狀核變性，是由ATP7B基因突變引起的常染色體隱性銅代謝失衡疾病。WD發(fā)病年齡多在10～30歲[1]，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。根據(jù)最新的流行病學調(diào)查，WD的遺傳患病率為13.9/10萬，出生流行率為15.4/10萬[2]。ATP7B是一種銅轉(zhuǎn)運體，位于13q14.3位點，其生物學功能是將銅裝載到反式高爾基體中新合成的銅藍蛋白上，進而將多余的銅從反式高爾基體中轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜中。ATP7B基因突變引起銅藍蛋白和銅結(jié)合障礙，繼而導致過量的銅沉積于體肝臟、腦、角膜及腎臟等處，引發(fā)這些組織器官不同程度病變[3]。盡管銅穩(wěn)態(tài)失衡作為WD的典型特征已被廣泛報道，目前WD的發(fā)病機制尚未完全闡明。最新研究表明，銅并非WD患者體內(nèi)唯一失衡的金屬元素，其他一些金屬元素如鐵、鋅、錳、鎂、鈣和鋁等的含量在部分患者體內(nèi)也有不同程度改變[4]。本文就近年來金屬離子穩(wěn)態(tài)與WD關(guān)系方面的文獻作一綜述，以期為WD治療及發(fā)病機制的闡明提供新的思路。

1 銅與WD

1.1WD患者銅穩(wěn)態(tài)失衡 作為人體必需微量元素，銅是多種酶發(fā)揮活性的重要輔助因子。正常人體銅穩(wěn)態(tài)受到精密調(diào)控，過量的銅可通過氧化應(yīng)激損傷細胞，甚至引發(fā)程序性細胞死亡[5]。WD患者體內(nèi)ATP7B突變導致其銅轉(zhuǎn)運蛋白功能受損，進而導致銅在肝臟和大腦等部位的積聚，最終導致肝臟和大腦功能損傷[6]。WD根據(jù)其損傷部位可分為肝型WD和腦型WD，其臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)多樣性。肝型WD的主要臨床表現(xiàn)包括：持續(xù)性血清轉(zhuǎn)氨酶增高，并發(fā)急性或慢性肝炎，乃至肝硬化和暴發(fā)性肝功能衰竭等。而腦型WD則表現(xiàn)為明顯的運動障礙、語言障礙和精神癥狀。這些癥狀具有一定的非特異性，給WD的診斷和治療帶來一定的挑戰(zhàn)性[6]。WD患者銅代謝失衡主要表征包括膽道銅排泄減少和血清游離銅水平的升高，這使得過量的銅在肝臟和大腦等組織中蓄積。

24 h尿銅含量是反映血清銅離子水平的重要指標。通常，正常人24 h尿銅含量<40 μg。當24 h尿銅含量>100 μg時，提示可能患有WD[7]。但患有暴發(fā)性肝功能衰竭、自身免疫性肝炎、淤膽型肝炎等肝臟疾病，24 h尿銅也可高達100～200 μg。因此，24 h尿銅不能作為WD確診指標。

血清銅水平是WD治療和監(jiān)測的有效標志，高血清銅水平是WD預(yù)后不良的標志[3]。爆發(fā)型WD(Fulminant Wilson′s disease,FWD)患者的血清銅水平顯著升高，預(yù)后較差。正常人血清銅藍蛋白含量常在0.2～0.5 g/L，近95%的WD患者血清銅藍蛋白水平常降至0.2 g/L以下，但WD患者紅細胞中銅含量與正常人相比差異無統(tǒng)計學意義[8]。這表明，血漿銅含量上調(diào)可能主要由血漿銅藍蛋白所結(jié)合的銅含量大幅降低所致。有研究表明，WD患者血漿中非結(jié)合銅含量升高，常高于250 μg/L，而正常人血漿非結(jié)合銅含量常低于150 μg/L[9]。血漿游離銅在急性肝功能衰竭或慢性膽汁淤積患者以及銅攝入過多者中也會上升，因此血漿游離銅離子水平在調(diào)整藥物劑量中的價值優(yōu)于診斷。經(jīng)治療后WD患者血漿銅離子水平<250 μg/L預(yù)示控制理想，而<50 μg/L則是長期治療后銅耗竭的指標。

腦型WD患者病理表現(xiàn)主要集中在基底神經(jīng)節(jié)、中腦和腦干。這些部位在核磁共振T2加權(quán)圖像中的信號下降，可能是由銅積累的順磁效應(yīng)引起[10]。Litwin等[11]發(fā)現(xiàn)WD患者大腦額葉皮層、殼核、腦橋和齒狀核中的銅含量均高于對照組，且與性別、年齡、治療類型和疾病持續(xù)時間無關(guān)。

1.2ATP7B突變與銅穩(wěn)態(tài)失衡 ATP7B在銅藍蛋白合成的過程中發(fā)揮重要作用，其N端含有6個金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域(metal-binding domain,MBD)。MBD與銅具有高親和力，在與抗氧化蛋白1相互作用下接受來自細胞質(zhì)的銅離子，并促進銅釋放到跨膜孔道中[12]。ATP7B蛋白核心區(qū)域決定了其的金屬離子結(jié)合特異性，而N端金屬結(jié)合區(qū)域起調(diào)節(jié)作用[12]。

膜轉(zhuǎn)運蛋白ATP7B調(diào)節(jié)人體組織和細胞內(nèi)銅分布及含量。當機體銅處在本底水平時，ATP7B位于反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)中，負責將銅轉(zhuǎn)運給新合成的含銅蛋白，如銅藍蛋白等。在肝臟中，銅藍蛋白通過將多余的銅轉(zhuǎn)運到膽道出口的小泡中，通過膽汁排泄維持系統(tǒng)銅穩(wěn)態(tài)[3]。機體銅含量升高時，ATP7B從高爾基體轉(zhuǎn)運到溶酶體，并將銅運輸?shù)饺苊阁w腔內(nèi)。ATP7B通過與肌動蛋白p62亞基的相互作用使溶酶體發(fā)生胞吐，使溶酶體向肝細胞的小管極轉(zhuǎn)移[12]。溶酶體胞吐作用促進了肝細胞中銅的清除。

H1069Q和R778L是ATP7B基因最常見的突變類型，這兩種蛋白突變體仍保留有相應(yīng)的銅結(jié)合能力，但其生物學構(gòu)象發(fā)生改變，常引發(fā)亞細胞定位異常[13]。肝臟銅過量時，ATP7B突變體無法精準轉(zhuǎn)運至高爾基復合體和溶酶體腔，從而無法通過溶酶體胞吐作用排泄過量銅，最終引發(fā)肝臟損傷[6]。ATP7B跨膜結(jié)構(gòu)域1和2(TM1/TM2)在調(diào)控胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域構(gòu)象中發(fā)揮重要作用。通過糾正ATP7B突變體的異常亞細胞定位，有可能恢復肝細胞過量銅的排泄。研究表明，H1069Q突變體表達可激活p38和JNK信號通路，進而促進該突變體的快速降解[13]。通過抑制p38和JNK通路，可促進H1069Q突變體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至高爾基體，恢復其銅轉(zhuǎn)運功能，有效降低胞內(nèi)銅含量[13]。p38和JNK通路是校正WD致突變體的潛在靶點，未來有可能為WD新型治療策略的開發(fā)提供線索。

1.3銅穩(wěn)態(tài)失衡與WD發(fā)生發(fā)展 WD患者肝內(nèi)過量的銅可誘導活性氧生成，進而導致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等大分子的氧化損傷，甚至增加肝癌的發(fā)病風險。WD早期肝臟病變特征為脂肪變性，并表現(xiàn)出嚴重的線粒體能量生成和甾醇代謝障礙[14]。研究表明，WD患者肝臟銅穩(wěn)態(tài)失衡的同時，p53突變頻率增加。而銅離子螯合劑能夠顯著降低線粒體銅含量進而減輕線粒體損傷，最終減緩肝臟損傷[14]。

高銅能誘導肝細胞線粒體氧化應(yīng)激，進而引發(fā)肝細胞自噬性死亡[15]。Polishchuk等[15]的研究表明，自噬有利于保護ATP7B敲除細胞免受銅過量引發(fā)的肝細胞凋亡。與野生型細胞相比，ATP7B敲除細胞中103個自噬相關(guān)基因表達顯著上調(diào)。因此，自噬有可能成為WD藥物研發(fā)的新方向。

2 鐵與WD

2.1WD患者腦鐵穩(wěn)態(tài)失衡 鐵是人體含量最為豐富的微量元素，正常成人體內(nèi)含鐵4～5 g。鐵在體內(nèi)主要作為血紅蛋白組分參與氧運輸，以及存在于細胞色素酶中參與三磷酸腺苷(5′-Adenylate triphosphate，ATP)合成等。鐵作為多種酶的輔基，對機體的能量代謝和免疫功能也具有重要作用。但大腦中過量鐵可誘發(fā)神經(jīng)元壞死，進而導致WD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

WD患者殼核中的鐵和銅含量顯著增加[16]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，WD患者殼核鐵含量越高，則其病理嚴重程度越高，這可能與含鐵巨噬細胞浸潤增加有關(guān)。此外，Litwin等[11]發(fā)現(xiàn)WD組齒狀核的鐵含量顯著高于對照組。另一項尸檢研究顯示，WD患者小腦紋狀體、灰質(zhì)、白質(zhì)中鐵含量也有顯著增加，WD患者腦鐵攝取率高于健康個體[4]。這與腦組織各區(qū)域鐵沉積的表現(xiàn)一致。

2.2鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因與WD發(fā)生發(fā)展 正常人血清在體外具有較強的抗氧化能力。進一步研究表明，血清抗氧化活性與血清中去鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白及銅藍蛋白含量有關(guān)[17]。WD患者體內(nèi)去鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白和銅藍蛋白表達水平異?；蚬δ墚惓?，可能導致肝臟等組織發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。

血清銅藍蛋白是一種主要由肝臟合成的糖蛋白，主要生理功能為銅離子轉(zhuǎn)運，兼具鐵氧化酶活性，對機體銅穩(wěn)態(tài)和鐵穩(wěn)態(tài)均具有重要調(diào)控作用。研究表明，WD鐵穩(wěn)態(tài)失衡可能與銅藍蛋白表達大幅下調(diào)有關(guān)。銅藍蛋白鐵氧化酶活性的降低及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的降低也是WD患者體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)失衡的重要原因[16]。WD患者大腦多個部位鐵含量均高于健康人群，這可能與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)的持續(xù)表達有關(guān)。過量的游離銅可以與鐵反應(yīng)蛋白1(iron response protein-1，IRP-1)結(jié)合，占據(jù)了鐵與IRP-1結(jié)合位點，使IRP-1無法脫離TfR抑制基因，進而引起TfR的持續(xù)表達[18]。最終導致鐵的大量積累，造成細胞氧化損傷。

WD患者血清鐵蛋白水平升高，可能與轉(zhuǎn)鐵蛋白的低表達有關(guān)，在大多數(shù)病例的肝臟組織中鐵含量維持在正常水平。研究顯示，爆發(fā)型WD患者血清鐵蛋白水平明顯高于普通WD患者，其預(yù)后評分與血清鐵蛋白水平呈正相關(guān)[4]。ROC分析顯示，血清鐵蛋白預(yù)測爆發(fā)型WD的最佳界值為93.5 μg/L，敏感度為92.9%，特異度為66.2%，提示血清鐵蛋白水平可能是預(yù)測WD進展為FWD的重要指標[4]。

朗埃文斯肉桂大鼠(long-Evans cinnamon，LEC)大鼠是遺傳性肝炎和自發(fā)性肝細胞癌的突變品系，其肝臟銅異常積累與WD患者相似。研究發(fā)現(xiàn)，LEC大鼠肝臟鐵蛋白含量隨周齡顯著升高[19]。通常，肝臟鐵含量的增加與血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和總鐵結(jié)合力的降低有關(guān)。然而，LEC大鼠血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和總鐵結(jié)合力都隨著肝鐵的增加而增加。LEC大鼠血清轉(zhuǎn)鐵蛋白水平異常升高，鐵和銅在LEC大鼠肝臟中自發(fā)累積，可能是導致其肝臟損傷的重要原因[20]。LEC大鼠模型為研究鐵穩(wěn)態(tài)與WD的關(guān)系提供了線索，值得進一步深入探索。

3 鋅與WD

3.1WD患者肝臟鋅穩(wěn)態(tài)失衡 作為人體含量僅次于鐵的必需微量元素，正常人血清中鋅含量為10～18 μmol/L[20]。據(jù)估計，人細胞中約10%的蛋白含有鋅結(jié)合位點，需要與鋅結(jié)合后發(fā)揮功能。鋅廣泛參與調(diào)控細胞生物學事件，包括DNA復制、基因表達、細胞生長、酶催化等。

有研究發(fā)現(xiàn)WD患者肝臟鋅大量缺失，而大腦鋅含量與分布與對照組差異無統(tǒng)計學意義。WD患者血漿和紅細胞中鋅的水平與正常對照比略有升高，但差異無統(tǒng)計學意義[3]。在危重WD患者中，血清鋅濃度由于各組織臟器對鋅的重新攝取而降低。鋅水平與WD嚴重程度之間可能存在關(guān)聯(lián)。最新研究表明，與其他類型WD相比，爆發(fā)型WD患者血清鋅水平顯著降低。Ranucci等[21]認為銅超載降低了鋅轉(zhuǎn)運體家族成員活性，進而減少腸道對鋅的吸收，導致了WD患者血清鋅含量的降低。

3.2鋅穩(wěn)態(tài)相關(guān)通路與WD發(fā)生發(fā)展 鋅穩(wěn)態(tài)失衡可引起細胞內(nèi)活性氧積累，從而引發(fā)程序性細胞死亡。高濃度鋅可通過抑制p53 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白入核阻止過量銅引發(fā)的神經(jīng)元細胞凋亡，這提示鋅補充有潛力用于減緩WD神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[3]。此外，p53蛋白活性及穩(wěn)定性受胞內(nèi)游離鋅離子調(diào)控，過量鋅可改變p53蛋白構(gòu)象并下調(diào)其表達水平。WD患者肝臟樣本中p53高頻突變可能參與了WD的肝癌轉(zhuǎn)化，但WD患者p53突變與鋅穩(wěn)態(tài)的關(guān)系尚不明確。WD患者肝細胞內(nèi)過量的銅可促進鋅從p53結(jié)合位點轉(zhuǎn)移，導致p53異常折疊，失去生物學功能[22]。而p53是控制金屬硫蛋白(metallothionein，MT)轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，WD患者p53突變或失活后，表達量下調(diào)的金屬硫蛋白不足以與胞內(nèi)過量的銅結(jié)合，從而導致肝臟損傷。

人體細胞鋅穩(wěn)態(tài)受SLC39A/ZIP家族、SLC30A/ZnT家族及MT家族精密調(diào)控。其中SLC39A/ZIP家族成員負責將鋅從胞外或細胞器轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，SLC30A/ZnT家族成員則負責將鋅從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至胞外或細胞器中。研究表明，ATP7B突變小鼠肝臟ZIP5 mRNA表達水平顯著上調(diào)，這與胞內(nèi)鋅含量上調(diào)一致[23]。ATP7B突變小鼠ZnT1的表達呈中度升高，提示在分泌通路早期ZnT1和ZnT4與MT協(xié)同轉(zhuǎn)運鋅，實現(xiàn)酶金屬化。ATP7B突變小鼠在疾病的早期階段激活了鋅的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)態(tài)反應(yīng)[24]。銅/鋅比值的增加以及MT-1/2表達居高不下，提示可能過量銅限制了蛋白質(zhì)對鋅的利用。然而，最近一項基于基因芯片的研究發(fā)現(xiàn)，WD患者肝臟活檢組織ZIP5和ZIP8表達下降，提示在WD晚期存在不同的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答模式。

人體特定組織銅和鋅的含量變化通常相反，血清高銅、低鋅可能是WD重要的預(yù)后標志物[21]。銅可能通過阻止鋅吸收，導致WD血清中鋅水平下降。血清鋅、銅水平與肝臟功能具有一定關(guān)聯(lián)。相關(guān)動物研究表明，鋅介導的MT表達上調(diào)不僅減輕LEC大鼠肝臟損傷，還可降低肝臟銅和鐵含量[24]。LEC大鼠中，鋅可能通過抑制氧化應(yīng)激保護肝臟。ATP7B敲除小鼠肝臟鋅含量為對照鼠2倍左右，其肝臟銅含量則是野生型小鼠的28倍左右。野生型小鼠肝臟鋅水平是銅水平的4～5倍，而ATP7B敲除小鼠肝臟銅水平則是鋅水平的3倍左右[24]。這提示，ATP7B敲除小鼠肝臟鋅穩(wěn)態(tài)失衡可能是銅穩(wěn)態(tài)失衡的繼發(fā)反應(yīng)。

鋅能夠干擾銅在胃腸道的吸收，并誘導腸腔以及肝細胞中金屬硫蛋白的形成，減少銅對肝臟的損傷。盡管鋅劑目前主要用于維持期治療,但同樣可作為一線治療藥物,尤其是對于無癥狀的患者。鋅劑的療效與青霉胺相似,但耐受性明顯優(yōu)于青霉胺。研究表明，銅絡(luò)合劑和鋅劑聯(lián)合使用并逐漸減少銅絡(luò)合劑用量,最后改為單純使用鋅制劑維持治療對大多數(shù)患者是經(jīng)濟、安全和有效的[21]。

值得一提的是，肝臟鋅穩(wěn)態(tài)失衡并非WD特異性指標，其他肝臟疾病也常伴有鋅穩(wěn)態(tài)失衡，如慢性肝病患者血清鋅濃度顯著降低。外源鋅補充可誘導肝臟表達MT，從而減少銅吸收，保護WD肝臟免受自由基氧化損傷[24]。有研究表明，死于肝硬化的WD患者各腦區(qū)鋅含量沒有顯著變化。鋅可能通過降低血氨或其他神經(jīng)毒素的含量改善慢性肝病患者的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀?？诜\制劑可能通過誘導腸內(nèi)MT表達來介導保護作用。

4 鋁與WD

正常人體鋁含量極低，其與人體健康及疾病的關(guān)系尚不完全清楚。有研究表明，WD患者尿鋁含量明顯增加。肝臟活檢結(jié)果表明，WD患者肝臟鋁含量顯著上調(diào)至1 345 μg/g(正常人肝臟鋁含量<100 μg/g)[25]。WD患者血清、尿液及肝臟鋁含量的升高主要由WD患者體內(nèi)鋁的吸收和貯存量病理性增加引起。與之相反，WD患者尸檢結(jié)果顯示肝臟鋁處于正常生理水平[26]。這提示鋁可能在WD發(fā)病不同時期作用不同。動物實驗表明，過量鋁具有一定的肝毒性，長時間攝入過量鋁可損害肝臟顯微及超微結(jié)構(gòu)，進而影響肝臟功能[25]。WD患者肝臟鋁含量的增加可能參與了肝臟的病變。

5 錳、鎂、鈣及其他金屬與WD

WD患者血漿中錳含量有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。但WD肝硬化患者大腦皮層錳含量顯著升高，同時大腦皮層銅濃度升高[27]。銅藍蛋白可與錳相互作用，其活性降低可改變錳的神經(jīng)毒性。在WD患者或獲得性肝腦退行性變患者MRI的T1加權(quán)序列中，可見顱內(nèi)低值信號，提示腦錳沉積。WD患者經(jīng)顱超聲圖像上的高回聲病變同樣提示錳和鐵的積聚。在獲得性肝腦退變的患者中，大多數(shù)患者的MRI圖像中可以觀察到蒼白球和棘突外的局部錳沉積[28]。這些結(jié)果提示，腦錳沉積可能參與了WD神經(jīng)病變，通過干預(yù)腦錳沉積改善WD患者神經(jīng)癥狀值得進一步探索。

一項基于60例接受D-青霉胺治療的WD患兒的研究表明，WD患兒24 h尿液中銅、鎂、鈣、鋅、汞、鉛、鉈、鎘和錳的水平高于健康對照組[29]。其中鎂、鈣、鋅水平的上調(diào)與D-青霉胺治療時間呈正相關(guān)。WD患兒24 h尿液鋁與砷含量顯著低于健康對照組，其含量與D-青霉胺治療時長呈負相關(guān)[29]。人體中其他一些含量較低的金屬或半金屬元素，如硒、錫、鉻等在WD患者體內(nèi)的變化尚無相關(guān)報道，有待進一步探索。

6 總結(jié)與展望

本文首先回顧了ATP7B突變所致銅穩(wěn)態(tài)失衡在銅穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用及機制研究方面最新進展，隨后系統(tǒng)總結(jié)了鐵、鋅、鋁、錳、鎂、鈣等金屬與WD的關(guān)系。盡管WD患者血清或病變部位多種金屬元素含量均發(fā)生變化，但其作用不盡相同。腦組織中鐵、錳及肝臟鋁的蓄積可能參與了WD的發(fā)生發(fā)展。而肝臟鋅的大量減少，提示補鋅可一定程度減緩WD病程進展。如何利用金屬組學結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學及代謝組學等新興技術(shù)全面深入挖掘WD的致病機制，并基于人體各金屬穩(wěn)態(tài)的相互調(diào)控關(guān)系、各金屬穩(wěn)態(tài)與關(guān)鍵通路之間的調(diào)控關(guān)系，開發(fā)潛在的新型治療手段，值得未來進一步深入探索。