中藥逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

★ 馬嘉鑫 劉永忠 李文宏 雷婷 段麗婷 廖玉群（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；. 江西藥都仁和制藥有限公司 江西 樟樹(shù) 3300）

白血病是造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，異質(zhì)性高，預(yù)后差。在中醫(yī)學(xué)中，白血病屬于“虛勞”“髓癆”“血積”“癥瘕”等范疇［1］。一般來(lái)說(shuō)，白血病的治療以綜合性治療為主，采用化學(xué)療法、放射療法、靶向治療、免疫治療及骨髓干細(xì)胞移植等方法，以化療為主要手段，但化療的毒副作用較大，且隨之產(chǎn)生的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）也是白血病患者進(jìn)行有效治療的主要障礙。白血病多藥耐藥是指在治療過(guò)程中白血病細(xì)胞接觸一種藥物后，對(duì)該種藥物出現(xiàn)耐藥性的同時(shí)，對(duì)多種結(jié)構(gòu)不同和作用機(jī)制各異的其他藥物也產(chǎn)生了交叉耐受［2-3］。MDR有兩種表型：一種是首次使用化療藥物就產(chǎn)生耐藥，稱(chēng)為原發(fā)性耐藥；另一種則是在化療過(guò)程中產(chǎn)生耐藥，稱(chēng)為繼發(fā)性耐藥［4-5］。目前尋求安全、有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑，探索治療過(guò)程中產(chǎn)生MDR的機(jī)理，提高白血病對(duì)化療的敏感性，是科研工作者和臨床醫(yī)生共同奮斗的目標(biāo)。而中藥具有多靶點(diǎn)，多階段，毒副作用小，安全有效的優(yōu)點(diǎn)。因此，探討中藥及其有效成分逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥及其機(jī)制研究具有重要意義。國(guó)內(nèi)外研究表明，多藥耐藥產(chǎn)生的分子機(jī)制異常復(fù)雜，是蛋白表達(dá)、酶類(lèi)介導(dǎo)、靶點(diǎn)改變、基因突變等多重因素共同參與的結(jié)果［3,5-7］。目前發(fā)現(xiàn)的引起白血病多藥耐藥機(jī)制主要有：多藥耐藥基因（multidrug resistance gene，MDR1）及其編碼的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MDR-associated protein，MRP）等表達(dá)介導(dǎo)的藥物外排機(jī)制［7-8］；Bcl-2等細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）數(shù)量及活性的異常；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GSTs）作用，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等信號(hào)的激活等。

1 中藥逆轉(zhuǎn)藥物外排機(jī)制介導(dǎo)的MDR

1.1 P-gp蛋白

P-gp是由MDR1編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，由P-gp介導(dǎo)的藥物外排是產(chǎn)生白血病MDR的主要機(jī)制之一［6,9］。P-gp具有藥物外輸泵功能，P-gp的過(guò)表達(dá)使藥物外排能力增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度下降，從而導(dǎo)致MDR的發(fā)生［10-11］。多種中藥單體、中藥復(fù)方等通過(guò)下調(diào)P-gp表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)蝎毒多肽可下調(diào)經(jīng)阿霉素（adriamycin，ADR）作用的經(jīng)典髓系白血病K562/A02多藥耐藥細(xì)胞株P(guān)-gp表達(dá)水平［12］，從而逆轉(zhuǎn)白血病干細(xì)胞多藥耐藥。Jing Shen等［13］研究表明，槲皮素聯(lián)合熱療預(yù)處理對(duì)白血病多藥耐藥K562/A細(xì)胞具有顯著的MDR逆轉(zhuǎn)活性，其活性可能與抑制P-gp和HSP70的過(guò)表達(dá)，增加ADR在細(xì)胞內(nèi)的積聚有關(guān)。甲基蓮心堿能增強(qiáng)K562/A02細(xì)胞對(duì)STI571的敏感性，下調(diào)其MDR1mRNA的轉(zhuǎn)錄和阻斷P-gp的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)白血病的多藥耐藥性［14］。扶正祛邪中藥復(fù)方含藥血清聯(lián)合干擾素可降低長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的急性早幼粒白血病耐藥細(xì)胞株HL60/VCR耐藥基因P-gp表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥［15］。

1.2 MRP蛋白

MRP與P-gp同為ATP結(jié)合的盒式膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的家族成員［6］，MRP的高表達(dá)通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的化療藥物排出，改變藥物在細(xì)胞內(nèi)分布，從而引發(fā)白血病MDR的發(fā)生。MRP特異性轉(zhuǎn)運(yùn)底物是胞內(nèi)與還原型谷胱甘肽（GSH）共軛結(jié)合的化療藥物，如依托泊苷、米托蒽醌等。多種中藥單體、中藥復(fù)方等通過(guò)下調(diào)MRP表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的發(fā)生［16-17］。如芍藥苷［18］和山奈酚［19］可抑制K562/ADR細(xì)胞株MRP1表達(dá)，從而增加K562/ADR細(xì)胞內(nèi)ADR的濃度，實(shí)現(xiàn)K562/ADR細(xì)胞對(duì)ADR耐藥性的逆轉(zhuǎn)。

1.3 P-170蛋白

P-170是多藥耐藥基因MDR1編碼的跨膜蛋白，具有ATP酶活性及轉(zhuǎn)運(yùn)功能，P-170的過(guò)表達(dá)使藥物外排能力增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度下降，從而導(dǎo)致MDR的發(fā)生［20］。研究表明中藥單體成分苦參堿、姜黃素、川芎嗪作用于白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/ADR后，可不同程度的抑制P-170蛋白的表達(dá)，與耐藥逆轉(zhuǎn)作用成正相關(guān)［21］。三七總皂甙能夠部分逆轉(zhuǎn)白血病耐藥細(xì)胞K562/VCR的耐藥性，其主要機(jī)制為直接或間接抑制多藥耐藥基因表達(dá)P-170糖蛋白，減少其藥物外排作用，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥［22］。麻黃堿通過(guò)下調(diào)K562/A02細(xì)胞膜糖蛋白P-170的表達(dá)，抑制其將化療藥物“泵”出細(xì)胞外的功能，提高化療藥物在K562/A02細(xì)胞內(nèi)的有效質(zhì)量濃度，能部分逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞的多藥耐藥性［23］。

2 中藥逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因異常表達(dá)介導(dǎo)的MDR

當(dāng)白血病細(xì)胞內(nèi)由于遺傳因素或化療藥物等外源因素的誘導(dǎo)，引起凋亡通路中的抗凋亡蛋白過(guò)量表達(dá)、促凋亡因子低表達(dá)或失活以及存活信號(hào)通路活性增強(qiáng)。凋亡通路中的這些異常改變單獨(dú)或共同作用，使得白血病細(xì)胞凋亡受阻，對(duì)多種化療藥物誘導(dǎo)的凋亡不敏感，表現(xiàn)為MDR［24］。

2.1 Bax/Bcl-2失衡

MDR產(chǎn)生的機(jī)制也與Bcl-2家庭成員表達(dá)異常有關(guān)（促凋亡基因Bax下調(diào)和抗凋亡基因上調(diào)）［7］。Bcl-2過(guò)表達(dá)引起的耐藥為非泵耐藥，且Bcl-2的過(guò)度表達(dá)會(huì)刺激MDR1表達(dá)［25］。Bcl-2是對(duì)抗凋亡刺激的關(guān)鍵抑制劑，能抑制化療藥物導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。聚乙二醇化脂質(zhì)體，單獨(dú)使用或與反義寡核苷酸聯(lián)合使用，激活Bax并抑制Bcl-2，顯著抑制了非泵耐藥［26］。故多種中藥單體、復(fù)方等通過(guò)調(diào)控Bcl-2的表達(dá)抑制白血病細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)蟾酥能夠逆轉(zhuǎn)CEM/VCR細(xì)胞的多藥耐藥性，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax的表達(dá)，促進(jìn)CEM/VCR細(xì)胞凋亡；下調(diào)P-gp的表達(dá)，增強(qiáng)CEM/VCR細(xì)胞對(duì)VCR的敏感性有關(guān)［27］。Misra R等［28］將姜黃根莖中提取的黃色素姜黃素聯(lián)合ADR做成小微米粒，作用于K562細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素延長(zhǎng)了姜黃素在胞核中存在的時(shí)間，且通過(guò)抑制Bcl-2分子的表達(dá)，增加對(duì)K562細(xì)胞的毒性，逆轉(zhuǎn)耐藥，協(xié)同促進(jìn)該細(xì)胞凋亡。出自《太平惠民和劑局方》的中藥復(fù)方君子湯聯(lián)合ADR作用于白血病K562/VCR耐藥細(xì)胞株，Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，無(wú)細(xì)胞毒性的君子湯和ADR對(duì)K562/VCR細(xì)胞耐藥性均有逆轉(zhuǎn)作用，兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，其機(jī)制可能與其上調(diào)促凋亡基因Bax和下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)有關(guān)［29］。

2.2 p53的缺失與突變

p53是一種腫瘤抑制基因，通過(guò)Bax/Bcl-2，F(xiàn)as/Apol，IGF-BP3等蛋白，p53可完成對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。Bcl-2可阻止凋亡形成因子如細(xì)胞色素C等從線粒體釋放出來(lái)，具有抗凋亡作用，而B(niǎo)ax可與線粒體上的電壓依賴(lài)性離子通道相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，具有凋亡作用，p53可以上調(diào)Bax的表達(dá)水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。而如果p53基因發(fā)生了突變，對(duì)細(xì)胞的增殖失去控制，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞癌變［30］。p53基因突變的腫瘤細(xì)胞，會(huì)誘導(dǎo)激活MDR1啟動(dòng)子，從而產(chǎn)生耐藥性［25］。三氧化二砷與白藜蘆醇聯(lián)合可顯著降低K562-GFP/ADM細(xì)胞耐藥基因MDR1/P-gp以及凋亡抑制基因Bcl-2、NF-κB和p53基因的表達(dá)，增強(qiáng)Bax表達(dá)和Caspase-3的活化，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥［31］。Wang D H 等［32］研究表明，砒霜提取物三氧化二砷（As2O3）作用于白血病K562/ADR耐藥細(xì)胞后，p53蛋白水平升高，P-gp水平下降，RT-PCR檢測(cè)到Fas和Caspase-3基因mRNA產(chǎn)物增加，MDR1 mRNA減少，As2O3處理后Caspase-3活性也明顯增強(qiáng)，As2O3能夠誘導(dǎo)白血病K562/ADR多藥耐藥細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)耐藥。

2.3 NF-κB異常激活

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB屬于腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)與自身免疫病、慢性炎癥以及很多癌癥的發(fā)生密切相關(guān)［3］。研究提示，NF-κB的異常表達(dá)與白血病有一定的相關(guān)性，且認(rèn)為NF-κB的激活是促白血病細(xì)胞存活的重要因素［33］。NF-κB一般存在于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞受刺激后，與很多基因的相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，使自身免于凋亡。多研究表明，NF-κB的活性升高與白血病細(xì)胞的多藥耐藥產(chǎn)生密切相關(guān)。且多種中藥單體及復(fù)方通過(guò)阻斷NF-κB信號(hào)通路等方式逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。馬武開(kāi)等［34］研究表明，解毒化瘀藥對(duì)HL60/ADR細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用可能是通過(guò)阻斷NF-κB信號(hào)通路，影響MDR1耐藥基因的表達(dá)，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)耐藥。研究表明非細(xì)胞毒劑量雷公藤紅素作用于人白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02后，K562/A02細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及survivin mRNA表達(dá)水平均降低，逆轉(zhuǎn)了NFκB-survivin途徑介導(dǎo)的K562/A02細(xì)胞多藥耐藥（化療藥物通過(guò)激活NF-κB的表達(dá)引起凋亡抑制因子survivin的表達(dá)，從而抑制白血病細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生耐藥）［35］。As2O3可通過(guò)調(diào)節(jié)NFκB，進(jìn)而抑制MDR1基因表達(dá)，逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥［10］。

3 中藥逆轉(zhuǎn)酶量與活性介導(dǎo)的MDR

3.1 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶

TopoⅡ是細(xì)胞內(nèi)的一種重要核酶，參與DNA的重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過(guò)程［36］。TopoⅡ是目前抗癌藥物重要的作用靶點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)TopoⅡ含量降低或酶活性減弱位點(diǎn)突變等，抗癌藥物的作用靶點(diǎn)減少，從而產(chǎn)生MDR。TopoⅡ介導(dǎo)的耐藥與TopoⅡ磷酸化水平提高，TopoⅡ酶水平下降，TopoⅡ基因位點(diǎn)的突變、缺失有關(guān)［37］。因此，多種中藥單體及復(fù)方，通過(guò)調(diào)控TopoⅡ表達(dá)實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的發(fā)生。高劑量復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合順鉑作用于急性淋巴細(xì)胞白血病耐藥細(xì)胞株L1210/CDDP移植瘤細(xì)胞，TopⅡ表達(dá)明顯升高，GSTs表達(dá)明顯降低，逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥性，增加白血病細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性［38］。黃連解毒湯所含的黃芩苷和京尼平苷作用于白血病耐藥細(xì)胞株K562/ADR，使TopoⅡ基因表達(dá)逐漸降低，Caspase-3基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，MDR1基因表達(dá)明顯抑制，干預(yù)與逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥［39］。

3.2 谷胱甘肽及其相關(guān)酶

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合，含有巰基的的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用［40-41］。GSH通過(guò)自行或經(jīng)GSTs催化過(guò)氧化氫和過(guò)氧化酯質(zhì)，在細(xì)胞解毒、抗損傷等過(guò)程中起重要作用［42］，GSTs是細(xì)胞抗損傷、抗癌變的重要解毒系統(tǒng)，多藥耐藥細(xì)胞伴有GSTs的高表達(dá)。因此，已有多種中藥有效成分及復(fù)方通過(guò)下調(diào)GSTs的表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)MDR的發(fā)生［43］。白花蛇舌草熊果酸作用于白血病耐藥細(xì)胞株K562/ADR，隨著作用劑量和時(shí)間的延長(zhǎng)，GSH含量明顯減少，GST和GSH-Px的活性逐漸下降，從而誘導(dǎo)K562/ADR凋亡，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥［44］。砒霜提取物As2O3聯(lián)合非米司酮作用于白血病耐藥K562/ADR細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)明顯增高，GSH含量明顯降低，對(duì)細(xì)胞增殖及其誘導(dǎo)凋亡的效果明顯增高，耐藥逆轉(zhuǎn)作用增強(qiáng)，機(jī)制與GSH含量改變有關(guān)［45］。此外，川芎嗪衍生物DLJ14和貝母素甲能引起GSH水平下降、下調(diào)GSTs相關(guān)酶活性來(lái)逆轉(zhuǎn)慢性髓系白血病多藥耐藥［46-47］。

3.3 環(huán)氧合酶

目前為止發(fā)現(xiàn)兩種環(huán)氧合酶：COX-1和COX-2。COX-2主要分布在細(xì)胞核膜上，被認(rèn)為是誘導(dǎo)性反應(yīng)基因，即“快速反應(yīng)基因”，參與白血病的發(fā)生、發(fā)展［48］。在腫瘤細(xì)胞中，COX-2可以調(diào)節(jié)MDR1/P-gp的表達(dá)［49］。槲皮素是一個(gè)COX-2啟動(dòng)子依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄和激活抑制劑，顯著下調(diào)ADR誘導(dǎo)的白血病HL-60細(xì)胞COX-2和MDR1 mRNA共表達(dá)，逆轉(zhuǎn)HL-60細(xì)胞MDR［50］。桂琳等［51］研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿、塞來(lái)昔布單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于白血病耐藥細(xì)胞K562/A02后，凋亡率增加COX-2 mRNA、MDR1以及P-gp、COX-2蛋白表達(dá)明顯下降，有逆轉(zhuǎn)細(xì)胞K562/A02耐藥的作用。

4 結(jié)語(yǔ)

在白血病的治療中，中西醫(yī)相結(jié)合是符合發(fā)展趨勢(shì)的必然結(jié)果，對(duì)于當(dāng)前白血病研究的重點(diǎn)熱點(diǎn)多藥耐藥問(wèn)題，利用中藥單體及復(fù)方逆轉(zhuǎn)多藥耐藥已經(jīng)取得了許多成果，但如何將其更好的結(jié)合是需要我們不斷思考的問(wèn)題。目前已有的關(guān)于中藥逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的研究仍存在很多不足，如更傾向于體外實(shí)驗(yàn)，多為研究中藥提取物及復(fù)方對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞的作用，更無(wú)法及時(shí)有效的與臨床相結(jié)合；中藥種類(lèi)較多，提取物豐富，中藥復(fù)方更是千變?nèi)f化，使得研究范圍過(guò)大，無(wú)法全覆蓋，難以集中目標(biāo)；相關(guān)基礎(chǔ)研究較少，無(wú)法進(jìn)行更加深入的研究等問(wèn)題，仍需要不斷的改進(jìn)，積極將中西醫(yī)相結(jié)合，尋求安全、有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑，提高白血病對(duì)化療的敏感性，探索治療過(guò)程中產(chǎn)生MDR的機(jī)理。我們應(yīng)發(fā)揮中醫(yī)中藥學(xué)及西醫(yī)學(xué)特質(zhì)，辨證論治、司外揣內(nèi)與分析還原、微觀研究相結(jié)合，使中藥逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥研究向著更貼合臨床應(yīng)用。