微囊化噬菌體治療細(xì)菌感染的研究

張 博，郝 賀，張 楠，呂興幫，張永英，石玉祥,2*，鐘翠紅*

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，邯鄲 056000；2.河北省禽病工程技術(shù)研究中心，邯鄲 056000)

噬菌體的起源要追溯到100多年前，研究人員通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)噬菌體能夠特異性感染細(xì)菌，這一發(fā)現(xiàn)讓噬菌體一度成為治療細(xì)菌病的主流藥物，隨著噬菌體治療的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)噬菌體的治療效果并不讓人滿(mǎn)意，是由于噬菌體的耐酸耐堿及穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致噬菌體易失活，從而達(dá)不到治療細(xì)菌感染的效果，因此，噬菌體療法逐漸淡出了人們的視野[1]?？股氐某霈F(xiàn)，成為了人們治療細(xì)菌感染的主要藥物，一直持續(xù)到現(xiàn)在，但長(zhǎng)期使用抗生素，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，抗生素的治療效果顯著下降，人們開(kāi)始尋找代替抗生素的藥物[2]。

近幾十年來(lái)，在格魯吉亞共和國(guó)等國(guó)家，噬菌體療法一直被應(yīng)用于治療細(xì)菌感染，并且專(zhuān)門(mén)建立了噬菌體研發(fā)中心，旨在開(kāi)發(fā)噬菌體治療[3]。作為抗生素治療的有效補(bǔ)充手段，噬菌體用于臨床抗感染治療在越來(lái)越多的國(guó)家和地區(qū)受到重視，因此亟須系統(tǒng)深入地研究以推動(dòng)噬菌體臨床應(yīng)用的規(guī)范化及安全性。有關(guān)生物制劑的微囊化包被技術(shù)在國(guó)內(nèi)外已相對(duì)成熟，但對(duì)噬菌體進(jìn)行微囊化包被的報(bào)道較少。本文就微囊化噬菌體的作用、制備方式及在治療細(xì)菌感染中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為微囊化噬菌體在畜牧業(yè)中的合理應(yīng)用提供參考。

1 噬菌體

1.1 噬菌體的分類(lèi)

噬菌體的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，主要由蛋白質(zhì)衣殼和核酸組成。依據(jù)遺傳物質(zhì)可將噬菌體分為雙股DNA群(dsDNA)、單股DNA群(ssDNA)、雙股RNA(dsRNA)、單股RNA群(ssRNA)。依據(jù)形態(tài)，雙股DNA群下將噬菌體分為肌尾噬菌體(Myoviridae)、短尾噬菌體(Podoviridae)、長(zhǎng)尾噬菌體(Siphoviridae)等[4]。依據(jù)噬菌體生活周期及繁殖特性，可分為裂解性噬菌體和溶源性噬菌體。在《病毒分類(lèi)—國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第9次報(bào)告》中將噬菌體分為6個(gè)目，87個(gè)科，19個(gè)亞科，349個(gè)屬，2 284個(gè)種[5]。

1.2 噬菌體對(duì)細(xì)菌的感染作用

近年來(lái)，抗生素的過(guò)分使用，其弊端也逐漸顯露出來(lái)，能替代抗生素的藥物卻少之又少，噬菌體是為數(shù)不多可以有效代替抗生素的治療藥物，因此人們對(duì)噬菌體相關(guān)的研究越發(fā)深入，微囊化噬菌體治療有望成為新型治療細(xì)菌感染的藥物。Easwa-ran等[6]通過(guò)以大腸埃希氏菌為宿主菌，成功分離出與大腸埃希氏菌所對(duì)應(yīng)的裂解性噬菌體，通過(guò)試驗(yàn)比較噬菌體處理過(guò)的大腸埃希氏菌與未處理的大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，證明噬菌體可以有效地抑制大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)，起到治療大腸埃希氏菌病的作用。巴西的研究者[7]從奶牛場(chǎng)的牛奶樣品中分離出金黃色葡萄球菌并從奶牛場(chǎng)的污水中分離出對(duì)應(yīng)的金黃色葡萄球菌噬菌體，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從污水中分離出的噬菌體可以有效地裂解金黃色葡萄球菌。Kim等[8]將腸炎沙門(mén)氏菌噬菌體加入到肉雞飼料中給雞食用，發(fā)現(xiàn)食用腸炎沙門(mén)氏菌噬菌體的肉雞不但患腸炎沙門(mén)氏菌病的概率大幅度降低，還可以促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)。

2 微囊化噬菌體概述

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，高分子技術(shù)被用作醫(yī)學(xué)制藥，醫(yī)用納米材料已經(jīng)成為目前最具有發(fā)展前景的新型材料之一。微囊化技術(shù)是一種利用天然或合成高分子材料將固體、液體或氣體包封或使其分散于載體基質(zhì)中而形成微小粒子的過(guò)程[9-10]。噬菌體的酸堿耐受性較差，在噬菌體治療的過(guò)程中易失活，達(dá)不到治療的效果，因此需要將噬菌體進(jìn)行微囊化處理，噬菌體微囊化后可以有效地避免噬菌體治療過(guò)程中的不足。微囊化技術(shù)有著諸多的優(yōu)點(diǎn)，其最顯著特點(diǎn)在于能夠?qū)⑹删w與外界環(huán)境隔離開(kāi)來(lái)，而其化學(xué)性質(zhì)能被完整保留，起到保護(hù)噬菌體的作用，并且可以在適當(dāng)?shù)臈l件下，又能將其釋放出來(lái)[11]。微囊化技術(shù)的發(fā)明，成功地解決了噬菌體殺菌過(guò)程中自身易失活的問(wèn)題，能夠起到保護(hù)噬菌體的作用。因此，正確地使用微囊化技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的藥物的控制釋放，保護(hù)噬菌體免受環(huán)境影響，保存噬菌體的活性并有效提高噬菌體的穩(wěn)定性。

微囊化技術(shù)雖然是一種比較新型的技術(shù)，但其有著非常廣闊的前景，主要是利用一些特殊的方法，使某種特殊的物質(zhì)達(dá)到一定密度，并被另一種或幾種物質(zhì)所包裹，從而形成特殊的狀態(tài)，滿(mǎn)足用藥的特殊需求，該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于口服用藥的控制釋放領(lǐng)域[12]。微囊化噬菌體可以有效地提高噬菌體的耐酸耐堿、在胃液中的穩(wěn)定性、在膽汁酸鹽中的穩(wěn)定性、在腸液中的穩(wěn)定性及釋放行為、保存狀態(tài)的穩(wěn)定性[13]。微囊化技術(shù)雖然有著很多的優(yōu)點(diǎn)，但需要選擇出合適的包被材料以及合適的制備方式來(lái)進(jìn)行微囊化包被，才能有效地保證噬菌體的活性，并成功發(fā)揮噬菌體的治療作用。

3 微囊化噬菌體的制備方法

微囊化噬菌體的制備方法常用液滴法、水油相分離法、干燥噴霧法等對(duì)噬菌體進(jìn)行微囊化包被，在制備微囊化噬菌體的同時(shí)還要選擇適宜的包被材料進(jìn)行包被，可以提高噬菌體的包封率及穩(wěn)定性能。

3.1 液滴法

液滴法主要是通過(guò)海藻酸鈉溶液與氯化鈣溶液間的化學(xué)反應(yīng)，來(lái)實(shí)現(xiàn)制備微囊化噬菌體，即直接將提前制備好的噬菌體懸濁液和一定濃度的海藻酸鈉溶液混合后通過(guò)流化床包衣制粒機(jī)勻速滴入氯化鈣溶液中，進(jìn)行凝膠化反應(yīng)形成微球，將形成的微球用去離子水洗滌后置于殼聚糖中覆膜反應(yīng)形成微囊化噬菌體微球。根據(jù)液滴不同的形成方法，液滴法又可進(jìn)一步分為噴流切割法、氣吹液滴法、振動(dòng)噴嘴法和靜電液滴法等方法[14]。液滴法的優(yōu)點(diǎn)主要在于操作簡(jiǎn)單，制備過(guò)程較為溫和，制備出的噬菌體微球形狀規(guī)則，顆粒飽滿(mǎn)成小球狀。液滴法的不足之處：①液滴法主要靠海藻酸鈉溶液和氯化鈣溶液的化學(xué)反應(yīng)來(lái)形成，受海藻酸鈉溶液濃度的影響，海藻酸鈉溶液濃度過(guò)高，溶液黏稠，不易形成噬菌體微球，海藻酸鈉溶液濃度過(guò)低，溶液稀釋?zhuān)膊灰仔纬墒删w微球。②通過(guò)液滴法制備噬菌體微囊化微球的產(chǎn)率相對(duì)較低，不易規(guī)模化制備噬菌體微球。

3.2 水油相分離法

水油相分離法制備微囊化噬菌體的原理是通過(guò)適宜的材料經(jīng)攪拌過(guò)濾后制備成水相，然后將適宜的油類(lèi)材料攪拌均勻后制備成油相，向混合均勻的油相中緩慢滴入提前制備好的水相，邊加邊攪拌，隨著水相的逐漸增加，混合液由開(kāi)始的黏度較低逐漸升高，使混合液變黏稠，黏稠的混合液中繼續(xù)加入水相，混合液由黏稠逐漸稀釋?zhuān)敝了嗳考尤氩嚢杈鶆騕15]。水油相分離法的優(yōu)點(diǎn)是包封率較高，可以有效地保護(hù)噬菌體；局限性是需要噬菌體的包被材料分別能夠溶解于水相和油相中。

3.3 干燥噴霧法

干燥噴霧法制備微囊化噬菌體，主要是將提前準(zhǔn)備好的噬菌體分散于溶液當(dāng)中，形成噬菌體懸濁液，通過(guò)霧化器使噬菌體懸濁液分散成小液滴，當(dāng)噬菌體小液滴與熱空氣接觸時(shí)，小液滴中的噬菌體迅速蒸發(fā)從而形成微粒[16]。干燥噴霧法操作簡(jiǎn)單，可以大規(guī)模生產(chǎn)，但由于操作時(shí)溫度較高，易降低噬菌體的活性，對(duì)噬菌體的破壞較大。

4 微囊化噬菌體在治療細(xì)菌感染中的應(yīng)用效果

噬菌體早在20世紀(jì)就被發(fā)現(xiàn)了其在治療細(xì)菌感染方面的作用，d’Herelle等[17]對(duì)禽傷寒進(jìn)行了有關(guān)噬菌體的治療試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，噬菌體能夠取得有效的治療效果，基本可以確定噬菌體是治療細(xì)菌性疾病的治療因子。Atterbury等[18]于2007年成功分離出沙門(mén)氏菌噬菌體，選用雞體內(nèi)的沙門(mén)氏菌與其反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果表明，噬菌體可以成功地消滅雞體內(nèi)的沙門(mén)氏菌。

馬永生等[19]研究表明，對(duì)患沙門(mén)氏菌病的雞服用沙門(mén)氏菌微囊化噬菌體，可以有效地治療雞的沙門(mén)氏菌病，當(dāng)微囊化噬菌體進(jìn)入機(jī)體體內(nèi)后，其在胃液、膽汁酸鹽中保護(hù)噬菌體的活性不發(fā)生顯著的變化，使噬菌體能夠以較高的活性進(jìn)入到腸液中，包被的材料與腸液發(fā)生反應(yīng)，使其中的噬菌體釋放出來(lái)，殺滅機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌，達(dá)到治療效果。

綜上所述，選用適宜材料微囊化后的噬菌體可以有效地發(fā)揮噬菌體的治療作用，并彌補(bǔ)了噬菌體自身活性易被胃液腐蝕降低的問(wèn)題，有望成為新型的抗生素替代藥物。

5 微囊化噬菌體治療的優(yōu)點(diǎn)和局限性

5.1 噬菌體治療的優(yōu)點(diǎn)

噬菌體在治療細(xì)菌感染時(shí)，有著很多抗生素所不具備的優(yōu)點(diǎn)：①噬菌體具有專(zhuān)一性，能夠特異裂解目標(biāo)病原微生物，而不會(huì)破壞其他微生物，抗生素治療雖然治療效果很好，但是抗生素在治療的過(guò)程中會(huì)破壞其他正常的微生物，導(dǎo)致微生物之間的平衡遭到破壞，有可能會(huì)造成感染[20]。②噬菌體在成功抵達(dá)細(xì)菌感染的部位后，能夠自我復(fù)制增殖，理論上可以按指數(shù)增殖，即一次給藥便可達(dá)到治療效果，而抗生素治療需要多次給藥[21]。③噬菌體具有無(wú)毒、無(wú)殘留的特點(diǎn)，人和動(dòng)物的身體當(dāng)中都存在著噬菌體，對(duì)機(jī)體并不會(huì)造成危害[22]，當(dāng)噬菌體清除宿主菌后，會(huì)逐漸消亡，而不會(huì)存留于機(jī)體中。④噬菌體在自然界中廣泛存在，所以噬菌體的制備成本較低[23]，篩選噬菌體的周期較短，而抗生素藥物的研發(fā)周期較長(zhǎng)、成本較高。

5.2 微囊化噬菌體治療的優(yōu)點(diǎn)

微囊化噬菌體治療具備噬菌體治療的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，而且有效地彌補(bǔ)了噬菌體治療中的不足。噬菌體治療一般采用口服治療的方法，當(dāng)噬菌體進(jìn)入胃液后，很容易被胃液腐蝕，從而失去活性[24]，微囊化噬菌體能夠有效地延長(zhǎng)噬菌體在胃液中的存活時(shí)間，較好地保存噬菌體的活性[25]。當(dāng)微囊化后的噬菌體進(jìn)入腸液后，噬菌體的包被材料與腸液發(fā)生反應(yīng)，使其破裂，從而釋放噬菌體，完成與細(xì)菌的特異性反應(yīng)。

5.3 微囊化噬菌體治療的局限性

微囊化噬菌體的局限性在于：①目前國(guó)內(nèi)外對(duì)這方面的研究較少，缺少合適的噬菌體包被材料，其選擇的包被材料需要能夠形成噬菌體微球，并能夠較好地保存噬菌體的活性，提高噬菌體的酸堿耐受性，還要能夠在腸液中成功釋放。②部分噬菌體攜帶毒力基因，裂解的噬菌體在與宿主菌反應(yīng)后，毒力基因不斷表達(dá)，從而產(chǎn)生毒力因子，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響[26]。③選擇合適的包被材料并采用合適的劑量是微囊化噬菌體成功的主要因素，包被材料的選擇和包被材料濃度的選擇，需要大量的試驗(yàn)來(lái)輔助證明，這方面還有待進(jìn)一步研究。

6 總結(jié)與展望

抗生素的過(guò)分使用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性愈發(fā)嚴(yán)重，治療效果也在顯著下降，尋找一種替代抗生素的藥物已經(jīng)刻不容緩。國(guó)內(nèi)外對(duì)噬菌體的研究愈發(fā)成熟，其應(yīng)用也愈發(fā)廣泛，但有關(guān)微囊化噬菌體的研究卻較少，這方面的研究仍有待提升。①微囊化噬菌體制備的材料有待探索嘗試，尋找適合噬菌體的包被材料。②微囊化噬菌體制備材料的濃度有待探索嘗試。③微囊化噬菌體在治療細(xì)菌感染上的應(yīng)用研究和技術(shù)還有待提高。

微囊化噬菌體可以保護(hù)噬菌體在胃液中短時(shí)間內(nèi)不被胃液腐蝕，以較高的活性進(jìn)入到腸液當(dāng)中，包被材料與腸液發(fā)生反應(yīng)，將噬菌體釋放出來(lái)，從而達(dá)到噬菌體殺滅細(xì)菌的作用。微囊化后的噬菌體活性差異性不顯著。微囊化噬菌體的合理研發(fā)與使用，可以有效地避免噬菌體自身的局限性，使噬菌體的治療效果得到充分的發(fā)揮。微囊化噬菌體期待在一定程度上降低抗生素帶來(lái)的負(fù)面影響，對(duì)臨床抗菌應(yīng)用有著非常重要的意義，其在動(dòng)物疾病治療方面有著非常廣闊的應(yīng)用前景，具體的微囊化材料還有待進(jìn)一步研究。