棘球蚴疫苗及診斷試劑候選抗原研究現(xiàn)狀

張春霞，李 鑫，歐蘭欣，葉碧錦，李 波，王紅彩，張浩吉，唐文強(qiáng)，王海峰，黃福強(qiáng)*

(1.青海農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，青海湟源 812100；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528231；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009；4.常加(上海)農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海 201414)

棘球蚴病(Echinococcosis)由棘球絳蟲屬絳蟲感染引起，是全世界范圍流行的人畜共患慢性寄生蟲病。根據(jù)感染棘球絳蟲的種類不同，棘球蚴病可分為由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)的幼蟲引起的囊型棘球蚴病(Cystic echinococcosis，CE)和多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)的幼蟲引起的泡型棘球蚴病(Alveolar echinococcosis，AE)[1]。我國是棘球蚴病發(fā)病率較高的國家之一，并且某些地區(qū)以泡型棘球蚴病為主。

棘球絳蟲蟲卵在外界環(huán)境中耐受性較強(qiáng)，0℃可以存活116 d，50℃可以生存1 h，并且對化學(xué)物質(zhì)的抵抗力也極強(qiáng)[2]。成蟲寄生于食肉類動物犬、狼等動物的小腸，中間宿主為偶蹄類動物如牛、羊等以及靈長類(包括人)動物。棘球蚴通過消化道進(jìn)入宿主體內(nèi)，再借助血液或者淋巴循環(huán)遷移到其寄生部位[3]，主要侵犯肝臟，其次是肺臟，其他部位也可受罹。

目前，臨床上常用阿苯達(dá)唑、吡喹酮以及奧苯達(dá)唑等藥物為感染病畜治療，但是治療效果欠佳，副作用大，且存在耐藥性等潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。相反，疫苗具有安全、無殘留、接種動物無休藥期等優(yōu)點(diǎn)，并且符合當(dāng)前“預(yù)防為主，治療為輔”的工作方針，疫苗免疫是疫病防控的重要手段之一。因此，加速研制出有效的棘球蚴病疫苗對畜牧養(yǎng)殖業(yè)以及人類的健康均具有重要意義。

自2013年開始，來自多個國家的兩個聯(lián)合科研團(tuán)隊(duì)分別完成了細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的全基因組測序工作[5-6]。基因組測序工作的完成，為后續(xù)對棘球蚴代謝、發(fā)育和免疫逃避等生命活動的研究奠定了重要基礎(chǔ)，其診斷標(biāo)志物和疫苗的研究也得以受益。研究人員也利用各種先進(jìn)技術(shù)合成了多種棘球蚴標(biāo)志性抗原分子，例如AgB、Eg95、EgA31等，并利用這些標(biāo)志性抗原制成了針對棘球蚴病的疫苗和診斷試劑。

1 疫苗

抗蠕蟲疫苗的研發(fā)是一個非常有挑戰(zhàn)性的課題，因?yàn)槿湎x在宿主體內(nèi)的寄生過程中會觸發(fā)一系列的逃避機(jī)制。有科研團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴的基因組中分別有7個和6個抗原B基因，這些基因所表達(dá)的蛋白能分泌到體外，在其免疫逃避中發(fā)揮了重要作用[7]。這些逃避機(jī)制大大增加了疫苗研制的難度。除此之外，由于棘球絳蟲是多細(xì)胞寄生蟲，抗原結(jié)構(gòu)和生活史相對都比較復(fù)雜，使得單價(jià)抗原疫苗可能出現(xiàn)抗原漂移，從而造成疫苗的免疫效果大打折扣。

尋找對不同宿主、不同發(fā)育階段的棘球蚴都有效的疫苗抗原是現(xiàn)在疫苗研發(fā)工作最重要、最艱難的任務(wù)，尤其是針對終末宿主犬疫苗的研發(fā)。目前，疫苗的研發(fā)工作中，已經(jīng)出現(xiàn)了比較成熟的可用于對羊大面積免疫接種的Eg95抗原以及諸如EgA31、EgM、EgTPx和TSP3等在實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)較好的候選抗原。

1.1 粗抗原

最初的棘球蚴疫苗主要是以棘球絳蟲分泌物和代謝物、六鉤蚴或原頭蚴分泌物等為抗原制成的。朱興全、Osborn PJ曾分別對細(xì)粒棘球絳蟲六鉤蚴分泌物的免疫原性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其免疫保護(hù)力可達(dá)96%～99%。但是由于粗抗原的成分過于復(fù)雜，含有多種抗原蛋白，并且生產(chǎn)成本過高，很難批量生產(chǎn)，因此現(xiàn)在已經(jīng)不可避免地被其他類型的疫苗所替代。

1.2 Eg95/Em95基因家族

Eg95/Em95基因家族分別屬于細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲，都由多個基因組成,該基因家族成員編碼的蛋白均含有類纖連蛋白Ⅲ結(jié)構(gòu)域(fibronectin type Ⅲ domain-like).該基因家族不僅在同基因型不同基因間高度保守，在不同基因型之間亦高度保守[8]。

棘球絳蟲六鉤蚴、原頭蚴以及成蟲的體表都含有大量Eg95/Em95基因所編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白表面共有6個抗原決定簇。Eg95/Em95蛋白在棘球絳蟲的整個生長發(fā)育過程中必不可少，這提示了其能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫保護(hù)，可以利用這一特性以Eg95/Em95蛋白為抗原制作棘球蚴病的疫苗。

1.2.1 合成肽疫苗 構(gòu)象表位是Eg95蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要部位，同時(shí)也是宿主的保護(hù)性抗原表位結(jié)構(gòu)類型，這為棘球蚴病合成肽疫苗研發(fā)提供了理論依據(jù)。Woollard D J曾完成了合成Eg95表位4條多肽的工作，并在做成偶聯(lián)肽后加入佐劑制成合成肽疫苗。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該疫苗具有較高的免疫保護(hù)率，但是這些多肽都僅具有免疫原性，能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生大量特異性抗體，卻都沒有反應(yīng)原性[9]。Lightowlers M W也做過類似的試驗(yàn)，為羊注射Eg95重組蛋白疫苗，羊群同樣得到了較好的保護(hù)。

合成肽疫苗全部是由人工合成的，沒有核酸成分，并且可以彌補(bǔ)常規(guī)疫苗的一部分不足，因此被認(rèn)為是一種更加高效、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的疫苗。但是疫苗的自身組成和宿主的免疫系統(tǒng)都可以影響其抗原性及免疫原性，免疫對象的免疫力也不能垂直傳播，還有一些中和表位都為構(gòu)象表位。這些問題極大地限制了合成肽疫苗的開發(fā)和推廣。

1.2.2 核酸疫苗 核酸疫苗即DNA疫苗，是通過為宿主接種某種編碼特定抗原蛋白的核酸，使該蛋白在宿主體內(nèi)得以表達(dá)，從而刺激宿主產(chǎn)生針對該抗原蛋白的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

林仁勇團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，Eg95抗原基因在棘球絳蟲不同成長階段的基因序列幾乎沒有差異，這一發(fā)現(xiàn)提示了Eg95基因的核酸疫苗針對不同發(fā)育階段的棘球絳蟲都是有效的[10]。該團(tuán)隊(duì)還成功克隆并構(gòu)建了棘球蚴的核酸疫苗pcDNA3-Eg95，后續(xù)試驗(yàn)也證明了該疫苗的有效性。Scheerlink JP也開展了相關(guān)試驗(yàn)，不同的是他先用攜帶有Eg95基因的質(zhì)粒進(jìn)行免疫，然后用了Eg95蛋白疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫，結(jié)果顯示免疫對象體內(nèi)產(chǎn)生了相當(dāng)高水平的IgG1抗體[11]。

1.2.3 基因工程疫苗 基因工程重組疫苗的原理就是利用DNA重組技術(shù)，將編碼保護(hù)性抗原的基因?qū)氲皆嘶蛘婧吮磉_(dá)系統(tǒng)，使其高效表達(dá)，從而提取到保護(hù)性抗原的肽鏈，再加入佐劑即制成了基因工程的重組疫苗。

棘球蚴病首個Eg95基因工程重組疫苗由Heath DD研制成功，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果顯示免疫效果較好。此后多個研究團(tuán)隊(duì)也陸續(xù)展開了對棘球蚴基因工程疫苗的相關(guān)研究與探索。丁劍冰團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建了Eg95基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，于琳琳團(tuán)隊(duì)也成功構(gòu)建了Eg95-(C3d)3重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。這些試驗(yàn)都強(qiáng)有力地證明了重組質(zhì)粒所表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性。

除此之外，還有一種應(yīng)用非常廣泛的基因重組疫苗是重組病毒活載體疫苗。有研究團(tuán)隊(duì)曾用羊口瘡病毒作為重組疫苗病毒(recombinant vaccinia virus,VACA)載體，成功構(gòu)建了Eg95載體病毒活疫苗。使免疫動物在產(chǎn)生針對口瘡病毒抗體的同時(shí)，也產(chǎn)生了針對Eg95的特異性抗體，并且該抗體水平不亞于用純化抗原制備疫苗刺激產(chǎn)生的抗體水平。

1.2.4 其他類型疫苗 除了以上3種主流疫苗以外，還有一些新型疫苗技術(shù)被用于棘球蚴病疫苗的開發(fā)，例如基因工程重組細(xì)菌載體活疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等。這些疫苗所具有的共同點(diǎn)就是都利用了Eg95基因或Eg95基因家族所編碼的蛋白。盡管現(xiàn)在已經(jīng)有了如此多種類的疫苗，但是只有細(xì)粒棘球絳蟲羊株(G1)的Eg95基因工程亞單位疫苗在生產(chǎn)中應(yīng)用，其余大多數(shù)疫苗都還處于實(shí)驗(yàn)室探索階段。

1.3 EgA31、EgTrp

EgA31和EgTrp蛋白均在胚乳期表達(dá)，尤其是在原頭節(jié)下水平表達(dá)，參與了原頭蚴和成蟲的發(fā)育過程，是細(xì)粒棘球絳蟲成蟲發(fā)育調(diào)控的重要蛋白之一[12]。以EgA31為抗原的疫苗主要是針對細(xì)粒棘球蚴病的終末宿主犬，該類疫苗可以大幅度降低棘球絳蟲的產(chǎn)卵率，減緩蟲體發(fā)育速度，并能提高宿主的IgA抗體水平[13]。

Fraize M的研究表明EgA31、EgTrp或EgA31-EgTrp能大幅提高IgG和IgA的抗體滴度[14]。Petavy AF以沙門氏菌弱毒株為載體，制成了EgA31和EgTrp的口服重組疫苗，對犬口服免疫，這也再次證明了EgA31可以作為包蟲病終末宿主疫苗的候選蛋白。

1.4 EgM家族

EgM家族蛋白主要由EgM4、EgM9以及EgM123共3種蛋白組成，可以抑制棘球絳蟲蟲體的生長，對蟲卵和六鉤蚴的抑制作用尤為明顯[3]。并且EgM蛋白疫苗的主要免疫對象為棘球絳蟲的終末宿主犬，可以在犬的體內(nèi)發(fā)揮免疫保護(hù)作用，誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答從而阻止蟲體的發(fā)育。

張文寶團(tuán)隊(duì)成功利用EgM家族蛋白中的EgM9對犬進(jìn)行免疫，結(jié)果顯示抑制蟲體發(fā)育的效果非常顯著，使蟲體發(fā)育受阻，不能產(chǎn)卵。這也正是針對終末宿主的疫苗最需要的效果之一。

1.5 EgTPx

EgTPx蛋白是棘球絳蟲體內(nèi)的一種硫氧還蛋白過氧化物酶，可以保護(hù)蟲體免受宿主氧化損傷過程造成的傷害，起著非常重要的抗氧化作用[15]。對蟲體在人和其他中間宿主內(nèi)穩(wěn)定寄生、生長和存活十分重要。王慧團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)了EgTPx編碼基因的原核表達(dá)，又通過對小鼠進(jìn)行免疫，制備了EgTPx抗體。

1.6 p29

作為一種重組抗原分子，p29也得到了多方學(xué)者的研究。據(jù)GO富集和KEGG通路聯(lián)合分析的結(jié)果可以得出，在p29免疫和細(xì)粒棘球蚴感染的兩個階段中，和免疫有關(guān)的多個過程比如免疫正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、B細(xì)胞穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞因子受體相互作用等，被注釋出了多種差異表達(dá)的mRNA[2，16]，而這些過程正是宿主在疫苗免疫和感染后機(jī)體會產(chǎn)生的變化。

Shi Z的團(tuán)隊(duì)也對p29抗原分子做了相關(guān)研究，結(jié)果顯示對繼發(fā)感染細(xì)粒棘球蚴的小鼠可以產(chǎn)生96.6%的免疫保護(hù)力，對感染蟲卵的綿羊也能產(chǎn)生94.8%的免疫保護(hù)力[17]。

1.7 FABP

蠕蟲寄生蟲體內(nèi)含有一種多基因家族編碼的低分子質(zhì)量包漿蛋白，稱為脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)。目前已經(jīng)在細(xì)粒棘球絳蟲中鑒定出兩種類型的脂肪酸結(jié)合蛋白家族，即EgFABP1和EgFABP2[18]。現(xiàn)已有研究證明，在宿主體內(nèi)將脂質(zhì)分子運(yùn)輸?shù)郊纳x細(xì)胞的過程中，F(xiàn)ABPs作為載體蛋白發(fā)揮著關(guān)鍵的中間作用[19]。這也提示了這些FABP可用于構(gòu)建針對細(xì)粒棘球絳蟲的疫苗。在后來的疫苗試驗(yàn)中，口服rEgFABP1免疫產(chǎn)生了比較顯著的高水平抗體。

1.8 其他疫苗候選分子

除了前文介紹的這些抗原分子，還有大量蛋白被研究團(tuán)隊(duì)作為疫苗的候選抗原研究，并且效果較好。比如包蟲囊腫液(HCF)中的Antigen 5,因?yàn)閞EgAg5含有多個具有高免疫原性的B細(xì)胞和T細(xì)胞激活表位，可作為終末宿主和中間宿主疫苗的候選抗原[20]。但因?yàn)镋gAg5在成蟲期僅有弱表達(dá)，并且容易與p29發(fā)生交叉反應(yīng)[21],因此該抗原還停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。還有如Eg14-3-3，作為一個普遍存在的蛋白質(zhì)家族，是棘球絳蟲成蟲喙腺的分泌成分，它在細(xì)胞周期、分化以及生長調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)等多個過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22]。除此之外，還有EmⅡ/3-10[23]、ANX[24]、EgTeg[25]、TSP3[26]等，還有學(xué)者將多個抗原整合起來制成一個多細(xì)胞表位的抗原，都有不錯的免疫效果。

2 診斷

目前，棘球蚴病的診斷方式主要是采用影像學(xué)檢查，再結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)確診。遺憾的是影像學(xué)技術(shù)還無法實(shí)現(xiàn)棘球蚴病的早期診斷，這時(shí)就需要借助在早期診斷中非常有優(yōu)勢的免疫學(xué)檢測方法[27]。

2.1 血清學(xué)診斷

棘球絳蟲病免疫診斷的抗原主要來自于包囊液(HF)。針對不同類型的棘球蚴病，所用到血清中的抗原也不盡相同。

2.1.1 細(xì)粒棘球蚴抗原 HF脂蛋白抗原B(AgB)和抗原5(Ag5)廣泛應(yīng)用于細(xì)粒棘球蚴引起的囊性棘球蚴病(CE,即包蟲病)的血清學(xué)分析。經(jīng)手術(shù)切除證實(shí)的CE患者血清學(xué)檢測方法的敏感性和特異性從60%～90%不等。使用富集Ag5以及基于重復(fù)串聯(lián)細(xì)粒棘球蚴的重組AgB和Ag5均可以極大地提高其診斷價(jià)值[28]。大量其他新抗原例如表皮蛋白EgTeg、堿性磷酸酶EgAP和EpC1在所選血清樣本上也都表現(xiàn)出了90%左右的敏感性和特異性[29]。

但是，對它們的性能還從未進(jìn)行過大規(guī)模的評估，僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段。目前報(bào)告的抗原敏感性和特異性還不夠高，導(dǎo)致其無法作為診斷或大規(guī)模人群篩查的首選工具。Casoni的皮內(nèi)試驗(yàn)也證實(shí)了這些抗原的特異性和敏感性不夠高，僅可用于側(cè)面印證影像學(xué)的診斷結(jié)果。

2.1.2 多房棘球蚴抗原 相比于CE，由多房棘球蚴引起的泡性棘球蚴病(AE)所用到的血清學(xué)檢查較為可靠。Em2和Em492代表了完整囊尾蚴排泄物和分泌物的成分，EmAP和EmP2對多房棘球蚴感染診斷具有較高的特異性[30]。Em10或其衍生物EmⅠ/3以及由Em10部分基因序列編碼的蛋白Em18在診斷AE方面顯示出較高的性能，但其純化十分困難，難以滿足需求。目前一種商業(yè)化的EM2-葡聚糖酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)已廣泛用于AE的臨床診斷，其敏感性和特異性均超過了90%。

一些報(bào)告顯示，在一些大規(guī)模使用血清學(xué)篩查的地方，一部分人口的血清學(xué)檢查呈陽性，卻沒有AE病變。在患有AE的免疫抑制患者中，血清學(xué)檢查也經(jīng)常呈陰性，因此還不應(yīng)將血清學(xué)診斷結(jié)果單獨(dú)用作該疾病的診斷論據(jù)[31]。

2.2 卵抗原

棘球絳蟲的主要卵抗原(major egg antigen，EmMEA)中的p40(MEAp40)是一種免疫原性良好的分子，可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較為強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可以作為診斷試劑甚至疫苗的候選抗原。Western-blot和ELISA的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了重組EmMEA可與多房棘球蚴感染小鼠的血清發(fā)生特異性反應(yīng)，且敏感性和特異性均達(dá)到了99%以上[32]。

2.3 游離DNA

存在于血液、尿液和唾液等體液中的細(xì)胞外游離狀態(tài)的DNA分子被稱為游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)。通過基因組重測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析相互印證，發(fā)現(xiàn)在細(xì)粒棘球絳蟲病患者的血漿中存在著屬于細(xì)粒棘球蚴的蟲源cfDNA，近期也有相關(guān)研究再次證實(shí)了這一觀點(diǎn)[33]。這些結(jié)果都表明了體液中的蟲源cfDNA可以作為標(biāo)志物應(yīng)用于棘球絳蟲病的診斷。后續(xù)通過采集感染不同生長時(shí)期、不同型別棘球絳蟲患者的血樣，有望篩選出更加理想的核酸診斷標(biāo)志物。

2.4 其他抗原

曾用于棘球絳蟲病疫苗的粗抗原也可用于AE或CE的免疫學(xué)診斷，但是因?yàn)槿菀着c其他寄生蟲的抗原發(fā)生不同程度的交叉反應(yīng)，所以即使其具有較好的敏感性和特異性，也不能制成可靠的診斷試劑。除此之外，還有學(xué)者通過構(gòu)建pET30α-Eg95-5載體，成功獲得了Eg95-5蛋白。Western blot的結(jié)果顯示該蛋白可以與患病動物的陽性血清發(fā)生反應(yīng)[34]，提示其具有用于棘球蚴病檢測的潛力。

3 展望

不管是AE還是CE，都是十分嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病，對畜牧養(yǎng)殖業(yè)和人類生活都能產(chǎn)生巨大的影響。在棘球蚴的生活史和傳播途徑中，犬是一個十分重要的終末宿主，在其體內(nèi)還有大量的蟲卵。因此，目前控制該病傳播的重要措施便是給犬定期驅(qū)蟲，阻止在中間宿主體內(nèi)的發(fā)育。這也提示了根據(jù)免疫對象的不同，需要不同功能的疫苗。針對終末宿主犬，需要讓疫苗發(fā)揮清除蟲卵，降低成蟲產(chǎn)卵率，阻止棘球蚴傳播的作用。針對中間宿主牛、羊，更需要疫苗可以激發(fā)免疫對象的免疫系統(tǒng)，使其被棘球蚴感染以后可以快速產(chǎn)生大量抗體，增強(qiáng)其抵抗力。雖說已經(jīng)探索出多種可以作為候選抗原的蛋白和基因，甚至可以在不同的宿主體內(nèi)亦或是針對不同時(shí)期、類型的寄生蟲發(fā)揮不同的作用，但其中的大部分都還沒有經(jīng)過大規(guī)模的試驗(yàn)，都還僅僅停留在實(shí)驗(yàn)室探索階段。這就需要開發(fā)出免疫效果更好的候選抗原或接種方式。

棘球蚴病的傳播范圍較廣，傳播方式也較為隱蔽，這就需要能夠盡早診斷出宿主的棘球蚴病。而常用的影像學(xué)技術(shù)還無法實(shí)現(xiàn)早期診斷，只能依靠在早期診斷比較有優(yōu)勢的免疫學(xué)診斷。前面描述的目前常用的免疫試劑總體效果不錯，但都存在各種各樣的缺陷或者不足，比如診斷試劑所用的抗原常與宿主體內(nèi)針對其他絳蟲甚至吸蟲產(chǎn)生的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)[35]。因此，需要開發(fā)出特異性和敏感性極高且假陽率較低的蛋白作為新的診斷試劑和候選抗原。