轉錄組測序在新城疫病毒感染中的應用與研究進展

賈燕青，仇薪鑫，佛香霖，楊增岐

(1.楊凌職業(yè)技術學院動物工程分院/動物疫病防控陜西省高校工程研究中心，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

新城疫(Newcastle disease,ND)又稱偽雞瘟，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)強毒株引起的一種急性、高度接觸性傳染病，臨床癥狀常以高熱、呼吸困難、黏膜及漿膜出血、下痢、神經(jīng)紊亂等為典型特征[1-2]。新城疫發(fā)病時，傳染性強，傳播極快，發(fā)病率和致死率較高，能夠引起雞和多種鳥類發(fā)病，據(jù)統(tǒng)計，新城疫能夠侵害雞、水禽、野生禽類等250多種不同宿主，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[3-5]。NDV雖然只有一個血清型，但其基因型多、變異快、傳統(tǒng)疫苗免疫易失敗等原因，使得現(xiàn)有疫苗防控NDV感染效果不理想，因此，迫切需要探索防控該病的新策略[4-7]。據(jù)報道，基因轉錄在病毒感染宿主的過程中發(fā)揮著重要的調控作用[8-11]，研究NDV感染后基因表達譜，有利于闡明NDV感染與宿主之間的相互作用，為篩選新城疫防控靶點和方法提供新的思路和策略。

轉錄組(transcriptome)是指組織或細胞在某一特定的發(fā)育階段或生理條件下，細胞內(nèi)所有轉錄本及其數(shù)量的集合[2,5]。通過轉錄組學研究，可以實現(xiàn)對基因的多方面研究。第一，對所有物種的轉錄本進行分類研究，這些研究包含mRNA、微小RNA(microRNA,miRNA)及非編碼RNA；第二，可以確定基因的轉錄結構，包括基因的起始位點(5′和3′末端)、剪切模式以及基因轉錄后的修飾等結構；第三，可對不同條件下的每種轉錄本表達水平的變化進行量化統(tǒng)計，用于基因表達的比較等研究中[2,5,12-13]。

目前已開發(fā)多種用于轉錄組研究的技術和方法。以雜交為基礎的基因芯片技術，該方法相對便宜，但存在對基因組依賴性強、雜交背景高、測序通量低及操作復雜等限制，如寡聚核苷酸芯片、cDNA芯片等[14]。測序技術的快速發(fā)展，以其為基礎的方法可直接完成cDNA序列的確定，早期以Sanger測序為基礎的cDNA或表達序列標簽(expressed sequence tag，EST)文庫，雖然可以實現(xiàn)測序通量高且基因表達水平數(shù)碼化，但是測序成本高、背景高、檢測范圍窄且不能有效區(qū)分相似序列，如大規(guī)模平行信號測序系統(tǒng)、全長cDNA文庫及基因表達系列分析等[2,14]。隨著分子生物學的發(fā)展，新型高通量DNA測序方法的快速發(fā)展為映射和定量分析轉錄組提供了新的支撐和平臺。轉錄組測序(RNA sequencing，RNA-Seq)是利用深度測序技術進行轉錄組分析的一種新技術[2]。RNA-Seq是基于深度測序技術，將總RNA轉化成一個在單端或兩端具有接頭的cDNA文庫，再對每個片段進行高通量測序，從單端或雙端測序獲取較短的序列(即reads)。不同的DNA測序方式獲得的reads長度有所不同，通常為30 bp～400 bp。測序完成后，對所得的reads既可與已有的參考基因組及參考轉錄本進行比對，也可在無參考基因序列時，進行重新組裝來獲得由基因轉錄結構和表達水平組成的基因轉錄圖譜[15-16]。

因此，基于RNA-Seq技術的轉錄組測序可以對NDV感染后宿主與病毒間的相互作用進行研究，有利于闡明病毒感染時宿主機體基因表達的變化、關鍵基因的篩選及基因間的調控，是研究揭示NDV感染時復雜的生物過程和解釋轉錄水平調控網(wǎng)絡的重要方法。

1 轉錄組測序優(yōu)勢

與其他測序技術相比，除了經(jīng)濟、方便、快捷等優(yōu)勢外，RNA-Seq主要有以下幾個優(yōu)勢：(1)對轉錄本的檢測沒有限制，即可對沒有參考基因組序列的物種實現(xiàn)直接轉錄組測序及分析，如癌癥干細胞或珍惜野生動物等，這使得RNA-Seq可參與對未知序列或來源少的非模式組織進行檢測[14]；(2)靈敏度高，RNA-Seq可達到一個拷貝數(shù)，且能區(qū)分單堿基差異，可揭示在轉錄區(qū)域的序列變異，如單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析，更真實地了解和評價細胞中全部基因的表達，對獲得的小片段可提供2個外顯子間聯(lián)系的信息，長片段或兩端測序可以揭示多個外顯子間的聯(lián)系，這種方法可用于比較復雜的基因轉錄組的研究中[17]；(3)精確度高，RNA-Seq背景信號通常較低，DNA序列可以直接匹配到基因組的特定區(qū)域[14]；(4)檢測力強且重復性高，一次可產(chǎn)生幾百萬的數(shù)據(jù)量，幾乎涵蓋細胞中所有表達的基因，能夠最大限度地檢測到一些豐度低的稀有基因的轉錄本，還可以鑒定和量化正?；蜣D錄本和稀有基因轉錄本，是發(fā)現(xiàn)新基因的一種新的方法和途徑[2]。

通過RNA-Seq，可以高通量地獲得基因表達時mRNA的相關信息，也可對特定的細胞或組織中的基因表達進行檢測，實現(xiàn)對基因表達變化、樣品間基因表達差異、未知基因轉錄本、基因特殊轉錄本以及稀有轉錄本等的分析研究，從基因表達層面解釋基因與一些生命現(xiàn)象之間的關聯(lián)，為病毒與宿主間的免疫反應或抗病育種等研究提供新的思路和依據(jù)。基于RNA-Seq的各種優(yōu)勢，該技術已廣泛應用于基礎科學研究、生物標記技術、動物疾病機理、藥物研發(fā)及動物抗病育種等領域研究中，目前也有多篇利用該技術進行轉錄譜分析的論文發(fā)表[15-16,18-20]。

2 轉錄組測序技術在新城疫病毒感染中的研究

2.1 基因表達模式研究

病毒在感染宿主過程中，與宿主互作的本質和復雜性等大部分內(nèi)容都可以通過宿主基因轉錄變化譜來了解，這樣就可以篩選到與病毒復制等過程相關的關鍵候選基因。轉錄組測序技術雖在多種病毒研究中應用廣泛，但在NDV感染中僅有少量轉錄組相關報道，這些在NDV感染后的組織或細胞上轉錄組研究給人們提供了很多有用的信息。例如，Liu W等[13]利用RNA-Seq方法對NDV強毒株(Herts/33)及弱毒株(La Sota)感染的雞源原代成纖維細胞(chicken embryonic fibroblasts,CEFs)進行測序，共得到8 433個差異表達基因，其中獲得與干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)相關的基因有3 616個，這些基因的篩選為深入研究NDV感染與宿主抗病毒之間的關系奠定了基礎。Wang XW等[21]基于RNA-Seq技術，比較了NDV強毒株F48E9感染48 h和72 h后的轉錄譜，共檢測到1 498個差異表達基因 (differentially expressed gene,DEG)，根據(jù)基因本體論(Gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析，這些DEGs主要與先天免疫、炎癥反應以及物質代謝相關的信號通路有關，提示NDV 強毒株引起的過度炎癥和先天免疫反應可能與嚴重的法氏囊損傷有關。Zhang J等[22]對21日齡的蛋雞進行NDV感染后2 d和6 d的脾臟進行轉錄組測序發(fā)現(xiàn)，在感染2 d時有526個DEGs，而在 6 d時僅鑒定出36個DEGs，這些基因參與調解免疫細胞發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生和血管生成等通路，其中軟脂酰化磷蛋白(Sprouty1,SPRY1)基因在同群感染NDV毒株6 d時表現(xiàn)出與病毒載量的重要相關性，這些研究為增強雞NDV抗性育種奠定了基礎。Guo LX等[23]對NDV感染96 h內(nèi)的雞胸腺組織進行轉錄組測序研究，發(fā)現(xiàn)24 h有1386個DEGs，其中表達上調基因有989個和表達下調基因397個，48 h有728個DEGs，其中567個上調基因和161個下調基因，72 h的1514 DEGs分別有1 016個上調和498個下調基因，96 h的1 196個DEGs 分別有522個上調和674個下調基因，這些DEGs在細胞成分、生物過程和物質代謝過程中大量富集，這可能與NDV的致病性有關，為深入了解病毒-宿主相互作用的復雜調控機制提供了數(shù)據(jù)支撐。利用RNA-Seq技術對東南亞流行毒株NDV-GVII感染的脾臟進行轉錄組測序發(fā)現(xiàn)，與對照相比，有3 506個基因上調和2 855個基因下調，差異表達基因的功能分析顯示，在脾臟中ElF2信號傳導、mTOR信號傳導、淋巴系統(tǒng)細胞增殖、Rho家族 GTP酶信號傳導等調節(jié)發(fā)生改變，這項研究為新出現(xiàn)的 NDV-GVI在激活自噬介導的細胞死亡、嗜淋巴細胞和突觸發(fā)生信號通路方面的分子發(fā)病機制提供了新的見解[24]。通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)，在NDV感染的細胞外泌體中有7個免疫反應相關的基因表達上調，并發(fā)現(xiàn)NDV可以通過外泌體輸出核苷酸結合寡聚結構域樣受體家族成員X1(NOD-like receptor family member X1,NLRX1)mRNA，從而減弱細胞抗病毒能力來幫助病毒在細胞內(nèi)的增殖[25]。

2.2 非編碼RNA調控機制研究

非編碼RNA雖然不能直接產(chǎn)生蛋白質，但是對基因表達起著關鍵作用，近年來發(fā)現(xiàn)這些基因在動物育種、疾病防控及生產(chǎn)性能改良等方面越來越受重視[26-29]。為了鑒定miRNA表達與NDV復制過程的關系，Chen Y等[26]利用RNA-Seq獲得了NDV分離株JS5/05感染DF-1細胞6 h和12 h后的miRNAs表達譜，與對照組相比，感染6 h和12 h分別有73個和64個miRNAs表達差異顯著，深入研究發(fā)現(xiàn)gga-miR-451可靶向酪氨酸3單加氧酶/色氨酸5單加氧酶激活蛋白ζ(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta,YWHAZ)基因抑制NDV誘導的炎癥反應。Chen Y等[30]為闡明NDV在腫瘤細胞中miRNA的變化和調控機理，對感染NDV 6 h和12 h后的Hela細胞進行測序分析，發(fā)現(xiàn)NDV可以明顯提高3個miRNAs并抑制了20個miRNAs的表達水平，這些miRNAs可靶向參與病毒復制和抗病毒免疫的多個基因，為進一步研究miRNAs在NDV介導的溶瘤作用提供有價值的基礎。在NDV La Sota疫苗注射后24、48、72和96 h后，通過RNA-Seq技術對胸腺組織中的circRNA、miRNA和mRNA表達進行分析發(fā)現(xiàn)，與高表達的gga-miR-6631-5p相關的天然免疫有關的差異表達基因共有7個，為研究疫苗毒株在雞群中的分子反應提供了全面的信息[31]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度超過200個核苷酸的轉錄本，可參與多種生物活動的調節(jié)，利用轉錄組測序分析NDV感染后的雞哈德氏腺體，篩選了359個差異表達lncRNAs，鑒定了1232個與lncRNAs有互作的相關基因的數(shù)量性狀基因座，并確定了lncRNAs推定miRNAs前體的作用，這些研究揭示了lncRNAs在宿主對NDV感染反應中的作用，也為易感雞群品種遺傳改良調控提供了有力的數(shù)據(jù)支撐[32]。

3 展望

雖然目前在轉錄組水平對NDV感染機理研究中已經(jīng)取得了一定的研究進展，但是對NDV與宿主之間的相互作用依然不清晰，主要是當前的研究過多關注NDV感染后宿主基因表達量的變化，對病毒基因轉錄的研究還依然欠缺；對疫苗毒株La Sota和經(jīng)典強毒株F48E9研究過多，而NDV的基因型比較多，不同基因型的NDV對宿主的致病性存在差異，宿主對不同毒株的反應也存在差異，缺乏系統(tǒng)研究不同NDV毒株與宿主基因轉錄間的關系；缺乏對篩選的差異表達基因深入研究，沒有深入闡明NDV感染后宿主產(chǎn)生的免疫應答關鍵環(huán)節(jié)。隨著當前測序技術的快速發(fā)展，基于三代測序技術的應用已為轉錄組學研究提供了新的平臺[33-35]，也為深入研究NDV的致病性及宿主免疫應答提供了有利的工具。因此，利用新的測序技術研究不同基因型NDV的感染機制，可以更系統(tǒng)、深入地揭示NDV感染期間病毒與宿主基因表達的變化，為新城疫防控、疫苗研發(fā)及靶向藥物開發(fā)提供了有利的支持。