誘導性多能干細胞內(nèi)耳移植的研究進展

華榮愷 張志堅 華清泉

武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（武漢 430060）

感音神經(jīng)性聾(Sensorineural hearing loss,SNHL)是指因耳蝸（毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、血管紋等）、聽神經(jīng)、聽覺中樞的器質(zhì)性病變或者代謝障礙引起的聽力障礙或聽力損失。常見的SNHL有：藥物性聾（氨基糖苷類藥物、噻嗪類利尿劑、抗腫瘤藥物等）、遺傳性聾、突發(fā)性聾等。目前針對SNHL最主要的治療方法是佩戴助聽器和人工耳蝸植入（Cochlear implant，CI），一定程度上可以改善部分患者的生活質(zhì)量[1]。但是這兩者的療效與內(nèi)耳細胞的數(shù)量、功能息息相關(guān)，如果內(nèi)耳細胞（尤其是毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元）數(shù)量、功能極度低下的話，助聽器和人工耳蝸的作用會非常受限。經(jīng)過探索，人們發(fā)現(xiàn)，哺乳類動物的內(nèi)耳細胞幾乎是不可再生的[2]，如果損失了，就是永久性的。因此，我們需要一種方法來恢復受損的內(nèi)耳細胞的數(shù)量和功能，更有效的改善聽力受損的狀況[3]。

干細胞是指來自胚胎或成體內(nèi)、在一定條件下可以無限自我更新與增殖分化的一種細胞[4]，具有強大的再生、分化功能，人們希望用它來修復人體組織。越來越多的實驗證明，干細胞內(nèi)耳移植是有前景的。近些年，誘導性多能干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)已然成為研究的熱點，本文將對iPS細胞及其內(nèi)耳移植的相關(guān)進展進行綜述，以求為后續(xù)的實驗研究提供思路。

1 誘導性多能干細胞

iPS細胞是成體細胞在轉(zhuǎn)錄因子作用下，重組產(chǎn)生的與胚胎干細胞有類似特點的一類干細胞。2006年，Yamanaka等[5]把 Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4這四種轉(zhuǎn)錄因子引入小鼠成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)可誘導其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的iPS細胞在形態(tài)、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細胞增殖能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞相似。iPS細胞有著其獨特的優(yōu)勢和特點，如：容易獲取、可以大量克隆，因此越來越受到研究者們的關(guān)注。到目前為止，iPS細胞在很多領(lǐng)域已有較深入的研究，例如：心血管內(nèi)皮再生[6]、神經(jīng)再生[7]、血小板再生[8]等，并且取得了顯著的成果?？傊琲PS細胞會是將來干細胞應用領(lǐng)域最有希望的細胞之一。

2 移植途徑

內(nèi)耳的結(jié)構(gòu)非常精密且復雜，選擇什么樣的移植途徑尤為重要。一條合適的途徑不僅能保證細胞的高存活率、保持增殖分化能力，而且不影響機體正常的解剖結(jié)構(gòu)與功能。目前用于iPS細胞內(nèi)耳移植的途徑主要有：圓窗、耳蝸底轉(zhuǎn)以及子宮內(nèi)注射。

2.1 圓窗

圓窗途徑是目前比較成熟的一種移植途徑，能既可靠又快速地將細胞注入耳蝸[9]。目前用于實驗的動物主要有豚鼠、小鼠和大鼠，通常于其耳后做一縱行切口，逐層分離，尋找面神經(jīng)，并于面神經(jīng)后方充分暴露聽泡，開放聽泡即可見圓窗龕及鐙骨動脈，用微量注射器將細胞懸液緩慢通過圓窗注入即可[10]。

陳等[11]將2周齡ICR小鼠進行感音神經(jīng)性聾造模，4周后將iPS細胞經(jīng)圓窗移植到Rosenthal’s管中，進行ABR測試發(fā)現(xiàn)，iPS細胞移植組的小鼠的閾值在術(shù)后8周開始呈稍降低趨勢，術(shù)后12、16周，iPS細胞移植組的閾值與新霉素致聾組的閾值比較差異有統(tǒng)計學意義，但與正常之間也有明顯差異。說明iPS細胞可以在體內(nèi)存活長達16周，并可改善聽力。Chen等[12]將Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc導入從正常人尿液中收集到的上皮細胞中得到胚胎干細胞樣細胞團，即iPS細胞，然后將得到的iPS細胞向內(nèi)耳上皮祖細胞(otic epithelial progenitors,OEPs)做進一步的誘導，并將iPS細胞與誘導得到的OEPs分別移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，他們發(fā)現(xiàn)，iPS細胞會形成畸胎瘤，但OEPs細胞不會生成畸胎瘤，說明經(jīng)過進一步的誘導，干細胞的安全性得到了很大的提高。隨后他們將得到的OEPs經(jīng)圓窗移植到Slc26a4基因缺陷小鼠體內(nèi)4周后發(fā)現(xiàn)，移植細胞具有遷移和分化為毛細胞的能力，以及位于Corti器的移植細胞可以與天然SGNs形成突觸連接。Zhu等[13]將iPS細胞移植到6-8周齡經(jīng)感音神經(jīng)性聾造模ICR小鼠體內(nèi)后4周發(fā)現(xiàn)，用CM-Di1標記的iPS細胞在鼓階、中階、前庭階以及蝸軸都可見，并同時表達神經(jīng)元標志物巢蛋白，這說明iPS細胞移植入內(nèi)耳后，增殖分化能力依舊良好。但是仍有2只小鼠（占實驗組10%）的耳蝸內(nèi)發(fā)現(xiàn)了畸胎瘤，這會影響聽力的改善，甚至會影響其他的正常結(jié)構(gòu)。盡管iPS細胞在移植后可以在宿主內(nèi)耳中較好的生存，但是其成瘤性是移植后非常常見的問題，而將iPS細胞做進一步誘導后便能降低畸胎瘤的發(fā)生率，故將iPS細胞的誘導細胞經(jīng)圓窗途徑移植入耳蝸是不錯的選擇。

2.2 耳蝸底轉(zhuǎn)

耳蝸底轉(zhuǎn)入路與圓窗入路在動物選擇方面具有一致性，但在手術(shù)過程中存在一些差異，在暴露并打開聽泡之后，于圓窗龕的前上方偏腹側(cè)，以尖端直徑約0.1mm的電鉆在耳蝸底轉(zhuǎn)鉆開耳蝸骨壁，隨即可見清亮外淋巴液流出，此時注入細胞即可[14]。

Ishikawa等[15]對人iPS細胞進行神經(jīng)誘導得到衍生細胞，并將其移植到4周齡豚鼠的耳蝸，移植后1周，所有7只動物均發(fā)現(xiàn)移植細胞存活，但移植后2周，7只動物中僅有3只存活。1周和2周存活組中βIII微管蛋白陽性移植細胞的比例分別為64.3±25.4%和90.7±5.4%，VGLUT1陽性細胞在βIII微管蛋白陽性移植細胞中的比例分別為90.7±5.4%和94.3±7.0%。這些結(jié)果表明，將iPS細胞經(jīng)耳蝸底轉(zhuǎn)移植入耳蝸的方案是可行的。Lopez-Juarez等[16]將人iPS細胞向內(nèi)耳祖細胞方向誘導后移植到成年豚鼠耳蝸，4天后在耳蝸發(fā)現(xiàn)較明顯的炎癥反應，但移植細胞仍可以遷移到整個耳蝸并存活4周。但Mustafa等[17]并未將小鼠iPS細胞進行誘導，而是直接植入4月齡成年Wistar大鼠耳蝸，發(fā)現(xiàn)細胞移植組與耳聾組的ABR閾值并無明顯差異，并且通過耳蝸切片觀察并未發(fā)現(xiàn)有移植的iPS細胞存活，即這種方案是失敗的。

與圓窗入路不同的是，未經(jīng)進一步誘導的iPS細胞經(jīng)耳蝸底轉(zhuǎn)植入內(nèi)耳后并不能很好的存活，只有向神經(jīng)向或者內(nèi)耳祖細胞誘導后才能表現(xiàn)出一定的活力。

同時，動物模型的種類也影響iPS細胞移植的結(jié)果。無論是iPS細胞還是iPS細胞的誘導細胞，移植到豚鼠體內(nèi)的效果都是很不錯的。然而直接將iPS細胞移植到成年大鼠體內(nèi)的效果并不理想，也許選用更小年齡的大鼠或者使用iPS細胞的誘導細胞可以取得不錯的結(jié)果。但僅從目前來看，豚鼠是最適合用于iPS細胞內(nèi)耳移植相關(guān)實驗研究的動物。

2.3 子宮內(nèi)注射

這種方法主要用于研究遺傳性聾的治療方案。Takeda等[18]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)子宮將野生型CX30基因轉(zhuǎn)移到CX30缺失小鼠的耳囊中可以恢復聽力。隨后，該團隊將人iPS細胞來源的祖細胞移植到CX30缺失小鼠的內(nèi)耳當中，他們發(fā)現(xiàn)移植的細胞可以存活長達1周，并且可以在內(nèi)耳非感覺區(qū)表達CX30蛋白[18]。這是首次證明外源性細胞在小鼠胚胎發(fā)育過程中成功植入的報道。但在之前，他們團隊將未經(jīng)誘導的iPS細胞直接移植到CX30缺失小鼠體內(nèi)時，取得的結(jié)果并不理想，甚至還發(fā)現(xiàn)畸胎瘤的存在[19]。這說明，將iPS細胞向內(nèi)耳方向做進一步誘導后，更有利于其在內(nèi)耳中的生存與分化，這也為未來在胚胎發(fā)育階段治療遺傳性聾提供依據(jù)。

除上述途徑，還有一些途徑在其他類型干細胞進行內(nèi)耳移植時被使用，如：半規(guī)管途徑[20]、耳蝸外側(cè)壁[21]、靜脈注射[22,23]、前庭入路[24]、蛛網(wǎng)膜下腔穿刺[25]以及中階注射[26]，這些途徑也可以嘗試用于iPS細胞內(nèi)耳移植。從目前來看，圓窗入路是最適合iPS細胞進行內(nèi)耳移植的方案。

3 基因編輯

基因編輯是一種新興的、能比較精準的對生物體特定基因進行修飾的一種基因工程技術(shù)，基因編輯常用的核酸內(nèi)切酶包括：巨型核酸酶(Meganucleases,MNs)、鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases,ZNFs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9，現(xiàn)在已經(jīng)達到了可以臨床應用的水平[27]。其中，CRISPR/Cas9是近些年的大熱門，它將目標基因組編輯變得更方便、更有效[28]。

Hockemeyer等[29]通過回顧iPS細胞的產(chǎn)生和CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展時認為，現(xiàn)有的基礎(chǔ)對未來遺傳基因治療是至關(guān)重要的。事實上，iPS細胞及其衍生細胞已越來越多地用于研究遺傳性疾病的分子和細胞病理生理機制。然而，基于iPS細胞的研究的一個主要障礙就是致病突變的影響和遺傳背景。如果能控制或者選擇我們想要的基因或者基因型，那么研究會更深入，更具針對性。而CRISPR/Cas9正是使用使用一種非序列特異性蛋白質(zhì)結(jié)合一個小的引導RNA分子，高效準確地完成基因修飾，產(chǎn)生同基因?qū)φ栈蛲蛲蛔兊募毎?，以便集中于由特定基因改變所引起的機制[30]。目前，iPS細胞與CRISPR/Cas9相結(jié)合的技術(shù)在很多領(lǐng)域已投入研究，包括免疫、代謝、血液、神經(jīng)退行性和心臟疾病等的遺傳性疾病，取得的成績也是顯著的，更有學者創(chuàng)新性的將該技術(shù)應用于HIV和新冠病毒的防治當中[31]。

目前也有關(guān)于iPS細胞與CRISPR/Cas9相結(jié)合的技術(shù)治療耳聾方面的報道。對從MYO7A基因突變耳聾患者身上得到的iPS細胞進行基因編輯，恢復了MYO7A基因后發(fā)現(xiàn)，這些新細胞可以有毛細胞樣的形態(tài)，患者的聽覺功能也得以恢復[32]。這無疑也是基于iPS細胞治療遺傳病的又一手段，而且這種方案是可行的。

4 問題與展望

有學者認為，iPS細胞可視作干細胞療法最萬能的來源[33]，容易獲取，有極強的增殖分化能力。它在內(nèi)耳移植領(lǐng)域的前景也十分廣闊，但也有一些問題亟待解決。成瘤性便是其中之一[4]。目前很多實驗報道中均提及畸胎瘤的產(chǎn)生[12,19]，可能與iPS細胞自身增殖能力有關(guān)，但經(jīng)過再次誘導的iPS細胞往往不會產(chǎn)生畸胎瘤[12]，這也說明了對iPS細胞進行再次誘導對移植效果的重要性。

免疫排斥是另一個不可忽視的問題。單純將干細胞移植進內(nèi)耳，難免會產(chǎn)生炎癥反應，這樣不利于細胞的存活與分化，很難取得理想的結(jié)果。有學者在完成細胞移植之后，給動物注射環(huán)孢素，發(fā)現(xiàn)可以提升移植細胞的存活率和分化效果，這樣是可行的[17]。不過近些年，間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)能力備受關(guān)注，有報道指出[34]，同源性間充質(zhì)干細胞可以減少iPS細胞衍生的同種異體心肌細胞移植后的免疫排斥反應，Ishikawa等[15]在完成細胞移植后給豚鼠靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)移植細胞的存活率大大提高，這表明將iPS細胞或者其衍生細胞與間充質(zhì)干細胞進行共移植，是降低免疫排斥反應的不錯選擇。

如果能克服上述問題與困難，選擇目前最佳的圓窗途徑，并適度配合基因編輯技術(shù)，iPS細胞在治療感音神經(jīng)性聾方面定會取得重大突破，為患者帶來福音。