解旋酶依賴性擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展

劉 迪 滕新棟（通信作者） 青島海關(guān)（山東，青島，266071）

閆吉輝 山東檢疫處理有限公司（山東，青島，266000）

隨著全球一體化進(jìn)程不斷推進(jìn)，人員流動(dòng)與貨物流通的日益頻繁增加了傳染病傳播風(fēng)險(xiǎn)，黃熱病、埃博拉、瘧疾和新型冠狀病毒肺炎等疾病給人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了巨大的災(zāi)難，也對(duì)我國(guó)口岸衛(wèi)生檢疫提出了考驗(yàn)［1］。 傳染病快速精確的檢測(cè)對(duì)保障口岸正常運(yùn)行、及時(shí)應(yīng)對(duì)口岸突發(fā)公共衛(wèi)生事件、防止境外疫情傳入國(guó)內(nèi)和保障國(guó)民生命安全有重要意義。

核酸擴(kuò)增技術(shù) （nucleic acid amplification testing，NAAT）在疾病輔助診斷中占有重要地位，廣泛應(yīng)用于國(guó)境口岸衛(wèi)生檢疫工作中［2］，其中等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（isothermal amplification technology，ITA）與普通PCR 技術(shù)相比，對(duì)使用場(chǎng)景及儀器的精密度要求更低，靈敏度和特異性相當(dāng)，在分子診斷尤其是床旁檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)篩查方面有較好的應(yīng)用前景［3］。 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要包括環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、核酸序列依賴的擴(kuò)增技術(shù) （nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、 重組酶聚合酶擴(kuò)增 （recombinase polymerase amplification，RPA） 和解旋酶依賴性擴(kuò)增技術(shù)（helicase-dependent amplification，HDA）等。 本文著重介紹HDA 技術(shù)在病原體檢測(cè)中的研究進(jìn)展。

1 HDA 技術(shù)原理

HDA 技術(shù)于2004 年首次提出，與PCR 需要變溫不同，HDA 在等溫條件下利用解旋酶解開(kāi)DNA 雙鏈［4］。 雙鏈DNA 首先被解旋酶分離為游離的單鏈形式，單鏈DNA 結(jié)合蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）與單鏈DNA 結(jié)合，穩(wěn)定ssDNA 并防止互補(bǔ)鏈重新結(jié)合；兩個(gè)序列特異性引物分別與穩(wěn)定的單鏈靶DNA 雜交， 由DNA 聚合酶通過(guò)添加脫氧核苷三磷酸（dNTPs）的方式延伸與模板退火的引物產(chǎn)生雙鏈DNA；最后兩條新合成的雙鏈DNA 產(chǎn)物作為DNA 解旋酶的底物進(jìn)入下一輪擴(kuò)增反應(yīng)。 如此的擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增。

HDA 技術(shù)最先使用大腸桿菌UvrD 解旋酶破壞雙鏈DNA 中互補(bǔ)堿基之間的氫鍵，從3' 到5' 方向解旋雙鏈DNA， 添加SSB 和甲基定向錯(cuò)配修復(fù)（MutL）蛋白，在37℃以指數(shù)方式擴(kuò)增DNA，稱為嗜溫形式HDA（mHDA）［5-6］。 隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)無(wú)需MutL 蛋白，熱穩(wěn)定解旋酶Tte-UvrD 與嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA 聚合酶（Bst-DNA 聚合酶）的組合可以在更高溫度（60-65 ℃）下擴(kuò)增，稱為嗜熱形式的HDA（tHDA），提高了擴(kuò)增反應(yīng)的效率和特異性［7］。 將Tte-UvrD 和Bst-DNA 聚合酶連接在一起構(gòu)成復(fù)合酶，該酶同時(shí)具有解旋酶和聚合酶功能，進(jìn)一步提高了擴(kuò)增效率和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度［8］。HDA技術(shù)優(yōu)化后建立單管等溫逆轉(zhuǎn)錄-嗜熱解旋酶依賴性擴(kuò)增技術(shù)（RT-tHDA），對(duì)RNA 分子、裝甲R(shí)NA顆粒和RNA 病毒等RNA 靶標(biāo)具有高度敏感性和特異性［9］。

2 HDA 產(chǎn)物檢測(cè)方法

2.1 瓊脂糖凝膠電泳或熒光DNA 結(jié)合劑檢測(cè)

HDA 產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或熒光DNA結(jié)合劑 （如溴化乙錠或SimplySafe、GelRed、Gel-Green）等方法來(lái)檢測(cè)，但難以對(duì)相似長(zhǎng)度的非特異性擴(kuò)增子定量或區(qū)分。

2.2 實(shí)時(shí)檢測(cè)

實(shí)時(shí)檢測(cè)包括熒光檢測(cè)和電化學(xué)檢測(cè)。 熒光檢測(cè)利用熒光嵌入劑（EvaGreen）或熒光標(biāo)記探針，進(jìn)一步分析超過(guò)熒光強(qiáng)度閾值所需的時(shí)間獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 熒光嵌入劑僅在與dsDNA 結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光，從而降低背景信號(hào)； 熒光標(biāo)記探針被DNA 聚合酶的5'-3' 核酸外切酶消化， 熒光基團(tuán)脫離淬滅基團(tuán)從而發(fā)出熒光［10］。 電化學(xué)檢測(cè)用電活性嵌入劑替代熒光探針，檢測(cè)時(shí)限少于1 h，可以在一次性電化學(xué)微孔板中進(jìn)行高通量測(cè)量［11］。 熒光檢測(cè)和電化學(xué)檢測(cè)均可通過(guò)DNA 熔解曲線分析區(qū)分特異性和非特異性擴(kuò)增。

2.3 擴(kuò)增子捕獲方法檢測(cè)

擴(kuò)增子捕獲方法包括側(cè)向流動(dòng)裝置（lateral flow devices，LFD）和基于雜交的擴(kuò)增子捕獲方法。 側(cè)向流動(dòng)裝置包含結(jié)合生物素化擴(kuò)增子的鏈霉親和素包覆的金納米粒子，對(duì)稱或不對(duì)稱擴(kuò)增后的雙標(biāo)記擴(kuò)增子進(jìn)入LFD，檢測(cè)線處固定化抗體在此處捕獲熒光素標(biāo)記擴(kuò)增子并形成可見(jiàn)紅色線［12］。 基于雜交的目標(biāo)捕獲是一種更簡(jiǎn)單且具有成本效益的方法，特定短捕獲探針通常錨定在表面上，與擴(kuò)增產(chǎn)物的生物素化鏈部分互補(bǔ)來(lái)捕獲擴(kuò)增產(chǎn)物。 目前已經(jīng)研發(fā)了多種擴(kuò)增子捕獲方法，包括基于聚丙烯片或氮化硅晶片的DNA 芯片檢測(cè)方法、 基于磁性顆粒的夾心檢測(cè)法等［13-15］。

3 HDA 技術(shù)優(yōu)勢(shì)

3.1 使用場(chǎng)景要求低

HDA 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了等溫?cái)U(kuò)增， 反應(yīng)機(jī)制簡(jiǎn)單，不需要昂貴且耗電的熱循環(huán)儀，易于實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化，適用于口岸現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

3.2 檢測(cè)流程簡(jiǎn)單

靶序列僅需2 個(gè)側(cè)翼引物進(jìn)行擴(kuò)增。 相比之下，其它等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)往往需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和流程，例如SDA 技術(shù)需要4 個(gè)引物產(chǎn)生初始擴(kuò)增子和修飾的脫氧核苷酸以提供鏈特異性切口［16］。

3.3 應(yīng)用廣泛

HDA 技術(shù)適用于多種類型樣本， 如基因組、 質(zhì)粒DNA、RNA、血液樣本、細(xì)菌培養(yǎng)物和糞便樣本等［12，17-18］。

3.4 反應(yīng)迅速、靈敏度高

已在多種病原體檢測(cè)中得到證明，HDA 技術(shù)的反應(yīng)時(shí)間通常在30～90 min 之間， 且靈敏度和特異性高［19］。

4 HDA 技術(shù)在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

4.1 黃熱病毒

通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、基因組序列擴(kuò)增或抗原免疫檢測(cè)方法直接檢測(cè)黃熱病毒（Yellow fever virus，YFV）是確認(rèn)病毒感染的首選方法，但這些方法通常不適用于一線診斷和監(jiān)測(cè)。 而RT-tHDA 技術(shù)對(duì)YFV 特異性強(qiáng)且靈敏度高，適用于在自然感染和接種后病毒血癥階段檢測(cè)血清樣品中的YFV 基因組，擴(kuò)增產(chǎn)物可用肉眼在試紙上直接讀取， 簡(jiǎn)化了操作流程，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)［20］。

4.2 埃博拉病毒

Goldmeyer 等［9］研發(fā)的等溫單管一步RT-tHDA平臺(tái)使用水浴或加熱塊等簡(jiǎn)單的儀器即可擴(kuò)增特定的RNA 序列。 通過(guò)在反應(yīng)中加入一種極端耐熱的單鏈DNA 結(jié)合蛋白，可以在10 min 內(nèi)將埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）的裝甲R(shí)NA 擴(kuò)增一百萬(wàn)倍，僅需30 min 即可讀取結(jié)果。 該技術(shù)對(duì)EBOV 高度靈敏，擴(kuò)增效率高，契合口岸檢測(cè)精確高效的要求。

4.3 瘧原蟲(chóng)

血涂片顯微鏡檢查是診斷瘧疾（Malaria）感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床實(shí)驗(yàn)室很難正確識(shí)別患者血液中的瘧原蟲(chóng)種類，且血清學(xué)檢測(cè)對(duì)瘧原蟲(chóng)種類特異性不足［21-22］。 目前已研發(fā)多種基于LAMP 技術(shù)的瘧原蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)，但LAMP 技術(shù)的復(fù)雜性增加了檢測(cè)工作流程［23-24］。 基于tHDA 技術(shù)的瘧疾檢測(cè)僅用2 μL未處理的人類全血即可檢測(cè)5 種瘧原蟲(chóng)，且可以使用簡(jiǎn)單的手持式一次性檢測(cè)設(shè)備特異性區(qū)分惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)， 靈敏度和特異性分別為96.6%和100%，1～2 h 即可獲得結(jié)果［25］。該技術(shù)簡(jiǎn)單高效、靈敏快速，適合口岸現(xiàn)場(chǎng)病原體檢測(cè)。

4.4 結(jié)核分枝桿菌

結(jié)合微小等溫核酸定量系統(tǒng)（TINY）和等溫?cái)U(kuò)增裝置的HDA 技術(shù)可以通過(guò)靶向結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb） 基因組中的IS6110 序列來(lái)定性檢測(cè)口腔拭子中M.tb 的存在，從標(biāo)本制備到結(jié)果解釋僅需不到1.5 h， 且特異性強(qiáng)，靈敏度高［26］。 基于HDA 技術(shù)的電化學(xué)檢測(cè)磁性平臺(tái)可以用于檢測(cè)痰、尿和胸水樣本中的M.tb，對(duì)目標(biāo)基因序列的檢測(cè)限低至30 拷貝［27］。

4.5 生物戰(zhàn)劑相關(guān)病原體

基于HDA 技術(shù)的等溫實(shí)時(shí)TaqMan 平臺(tái)（HDA-TaqMan） 結(jié)合了HDA 和TaqMan 檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)， 對(duì)攜帶炭疽芽孢桿菌DNA 純化質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度可達(dá)至少300 fg（大約50 個(gè)基因組拷貝）；對(duì)霍亂弧菌基因組的檢測(cè)靈敏度也較高，可在1 h 內(nèi)檢測(cè)到至少50 個(gè)拷貝［10］。

5 展望

口岸傳染病監(jiān)測(cè)是守衛(wèi)國(guó)門(mén)安全、防止國(guó)際傳染病跨境傳播、保障國(guó)家生物安全的關(guān)鍵一環(huán)。 在當(dāng)前全球傳染病傳播形勢(shì)嚴(yán)峻，尤其是新冠肺炎疫情尚不能有效控制，突變毒株持續(xù)變異的情況下，口岸衛(wèi)生檢疫的第一要?jiǎng)?wù)就是對(duì)傳染病及其病原體的精準(zhǔn)識(shí)別和控制。 能匹配可移動(dòng)、便攜式設(shè)備，且檢測(cè)結(jié)果快速精準(zhǔn)、穩(wěn)定可靠的病原體檢測(cè)方法對(duì)于口岸傳染病監(jiān)測(cè)意義重大。HDA 檢測(cè)技術(shù)作為一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)流程簡(jiǎn)單、用途廣泛的檢測(cè)方法，高度契合口岸對(duì)于傳染病監(jiān)測(cè)精準(zhǔn)高效的需求，進(jìn)而為口岸傳染病監(jiān)控及重大新發(fā)突發(fā)傳染病疫情處置提供更廣闊的發(fā)展平臺(tái)。 盡管有以上諸多優(yōu)點(diǎn)，HDA 技術(shù)仍有一些局限需要克服：例如更容易受到引物二聚體產(chǎn)物的擴(kuò)增子污染，不同樣本中潛在抑制劑導(dǎo)致的假陰性以及低溫?cái)U(kuò)增過(guò)程中因錯(cuò)誤配對(duì)產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)致的假陽(yáng)性等，因此仍需進(jìn)一步改進(jìn)優(yōu)化［19］。

HDA 技術(shù)自研發(fā)至今已經(jīng)有了較大發(fā)展，目前也已有成熟的市售試劑盒：BioHelix（美國(guó)馬薩諸塞州貝弗利）公司生產(chǎn)的IsoAmp?II 通用tHDA 試劑盒和IsoAmpIII 通用tHDA 試劑盒。 此外，通過(guò)與其它技術(shù)的結(jié)合，HDA 技術(shù)檢測(cè)水平更高效、高通量：與微流控技術(shù)結(jié)合的HDA-高通量微芯片裝置［28］，HDA-ELISA 技術(shù)［29］，HDA/薄膜生物傳感器等［30］。Ramalingam 等［28］設(shè)計(jì)的基于HDA 技術(shù)的微流體裝置，可在30 min 內(nèi)完成對(duì)SARS 冠狀病毒的實(shí)時(shí)檢測(cè)， 而利用HDA 技術(shù)對(duì)SARS-CoV-2 病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)有待進(jìn)一步研究。