黃酮醇化合物對自噬的作用研究進(jìn)展

易 奔，張春澤，張慶懷

自噬（Autophagy）是一種高度保守的細(xì)胞降解過程，其在缺氧、氧化應(yīng)激和饑餓等應(yīng)激條件下被激活，自噬能夠增強(qiáng)細(xì)胞存活能力,但在特殊條件下也能導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1]。細(xì)胞死亡作為一種穩(wěn)態(tài)機(jī)制發(fā)生在生理和病理?xiàng)l件下，當(dāng)其用以調(diào)節(jié)異常狀態(tài)或平衡細(xì)胞的內(nèi)部環(huán)境時，這種情況下的細(xì)胞死亡稱為調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡（RCD），自噬是參與RCD的重要機(jī)制之一，闡明RCD確切的機(jī)制和信號通路，研究某些藥物對RCD的影響，將有希望開發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病[2]、癌癥[3]等的特殊藥物。黃酮醇化合物是一類天然的藥物，山奈酚、槲皮素、高良姜素、桑色素、楊梅素是常見的幾種黃酮醇化合物，能夠靶向自噬發(fā)揮治療作用。本文的目的是介紹這幾種常見黃酮醇類化合物對自噬的作用機(jī)制。

1 自噬的分子機(jī)制

自噬是在各種細(xì)胞應(yīng)激條件下誘導(dǎo)的高度保守的分解代謝過程，它能防止細(xì)胞損傷并在能量或營養(yǎng)缺乏的情況下促進(jìn)細(xì)胞存活，并對各種細(xì)胞毒性損傷做出反應(yīng)[4]，自噬過程涉及4個主要步驟，即起始/成核、延伸、成熟和降解。

自噬過程與自噬相關(guān)基因（ATGs）和AMP激活蛋白激酶（AMPK）的密切相關(guān)。哺乳動物雷帕霉素（mTOR）被認(rèn)為是控制細(xì)胞自噬的中心分子，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生饑餓、缺氧、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)聚集、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等情況時[4]，mTOR活性被抑制，其對ULK1激酶復(fù)合體的抑制解除，自噬啟動[5]。AMPK在自噬發(fā)生的調(diào)控中也發(fā)揮重要作用，在某些情況下，AMPK可以通過磷酸化ULK1直接激活ULK1[6]，誘導(dǎo)自噬的起始。Beclin-1是參與自噬進(jìn)展的關(guān)鍵蛋白之一，在自噬的成核步驟中，ULK1復(fù)合物磷酸化并激活Beclin-1-VPS34（vacuolar protein sorting 34）復(fù)合物。在成熟步驟中，ATG7和ATG3將LC3（ATG8）綴合至PE（脂質(zhì)磷脂酰乙醇胺）。ATG5-ATG12共軛物與ATG16L1形成復(fù)合物通過WIPI-2b錨定在新的自噬體膜的VPS34產(chǎn)生的PI3P上。而LC3-Ⅰ向具有膜結(jié)合能力的LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，隨著酯化形式的LC3-Ⅱ分子不斷整合到自噬前體的雙層膜上，新生的自噬體膜得以擴(kuò)展延伸，自噬體逐漸成熟[7]。貨物的最終降解涉及與溶酶體的融合，并嚴(yán)格依賴于p62（SQSTM1）蛋白，這是有效自噬通量的可靠標(biāo)志物[8]。

2 自噬的功能

自噬對于在病理和生理?xiàng)l件下維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。一方面，自噬可以應(yīng)對如營養(yǎng)匱乏、生長因子耗竭和低氧或缺氧等代謝應(yīng)激，能清除有缺陷的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器，防止異常蛋白積聚并清除細(xì)胞內(nèi)的病原體；另一方面，自噬的過度活躍則會形成自噬應(yīng)激，損傷細(xì)胞器，促進(jìn)自噬性細(xì)胞死亡[9]。自噬異常與組織器官發(fā)育、個體衰老、炎癥、細(xì)胞免疫、腫瘤[10]和神經(jīng)退行性疾病[11]等的發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，自噬是腫瘤起始和惡性轉(zhuǎn)化期間的腫瘤抑制機(jī)制，其通過去除受損的細(xì)胞和細(xì)胞器來發(fā)揮對癌癥的抑制作用，從而限制了細(xì)胞的增殖和基因組的不穩(wěn)定性。但是相反，自噬對癌細(xì)胞也可能起著保護(hù)作用，也就是通常所說的“保護(hù)性自噬”，高度新興的癌細(xì)胞需要細(xì)胞構(gòu)件來代謝和產(chǎn)生能量，而在癌癥發(fā)展的這個階段，自噬提供所有必需的細(xì)胞中間體，以滿足致癌細(xì)胞增殖的代謝需求[12]。在腫瘤發(fā)展后期，自噬還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療、放療或其他療法的耐受性。這表明自噬在癌癥發(fā)展的不同階段發(fā)揮的作用可能不同。

3 黃酮醇化合物及其自噬調(diào)節(jié)特性

黃酮類化合物是母核結(jié)構(gòu)為2-苯基色原酮（2-phenylchromone）的多酚類化合物，多以糖苷形式存在，作為二級代謝產(chǎn)物廣泛分布于各種植物中[13]。山奈酚、槲皮素、高良姜素、桑色素、楊梅素等都屬于黃酮醇化合物，羥基在芳香環(huán)上的位置跟數(shù)量決定了這些化合物之間的差異，它們具有多種藥理活性，如抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗癌、心臟保護(hù)等[14]。因此，黃酮醇化合物對自噬的調(diào)節(jié)作用可能與黃酮醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3.1 山奈酚 山奈酚（3，5，7，4'-四羥基黃酮）是一種黃色的黃酮醇化合物，存在于茶、卷心菜、西蘭花[15]等蔬菜水果以及傳統(tǒng)藥用植物中。山奈酚因其多種生物和治療活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、心臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)作用等[16]，在醫(yī)學(xué)中被廣泛使用。關(guān)于山奈酚的自噬調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了許多研究，Kim等[17]用山奈酚處理胃癌細(xì)胞后，癌細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ、Beclin-1和ATG-5的表達(dá)增加，p62水平降低，提示細(xì)胞自噬增加，其誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡的主要途徑包括AMPK-ULK1通路及與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)IRE1-JNK-CHOP通路。EL-kott等[3]研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚可通過觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞毒性自噬，在山奈酚處理的A2780卵巢癌細(xì)胞中，LC3-Ⅰ蛋白水平顯著降低，LC3-Ⅱ、ATG5和beclin 1的蛋白水平顯著增加，同時癌細(xì)胞增殖受到抑制，且癌細(xì)胞死亡增加。miR-340被廣泛報道為胃癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等的抑癌因子，Han等[18]發(fā)現(xiàn)，在肺癌A549細(xì)胞內(nèi)，山奈酚上調(diào)了miR-340的表達(dá)，并通過促進(jìn)ATG7，LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)，抑制p62的表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞自噬，達(dá)到了抑制肺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡的作用。山奈酚還能通過調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，在Varshney等[19]的研究中，山奈酚通過誘導(dǎo)AMPK/mTOR途徑介導(dǎo)的自噬，減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)儲存、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島β細(xì)胞功能障礙，其可能成為預(yù)防肥胖相關(guān)糖尿病并發(fā)癥的潛在候選治療藥物。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）已被報道可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）凋亡并促進(jìn)動脈粥樣硬化，山奈酚通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路上調(diào)人內(nèi)皮細(xì)胞自噬，減輕ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，具有抗動脈粥樣硬化的作用[20]。

3.2 槲皮素 槲皮素（3，3'，4'，5，7-五羥基黃酮）是類黃酮類（黃酮醇亞類）的一種多酚化合物，廣泛存在于羽衣甘藍(lán)、洋蔥、還有各種水果中[21]，具有抗糖尿病、抗腫瘤、保肝、腎保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)等作用[22]。有關(guān)槲皮素對SMMC7721肝癌細(xì)胞的作用體內(nèi)外研究表明，槲皮素以劑量和時間依賴的方式顯著上調(diào)肝癌細(xì)胞中LC3A/B-Ⅱ和beclin1的蛋白水平，下調(diào)p62蛋白水平，通過抑制AKT/mTOR信號通路和激活MAPK通路促進(jìn)自噬，其顯著抑制了與凋亡誘導(dǎo)和自噬刺激相關(guān)的腫瘤生長[23]。槲皮素能夠刺激人白血病HL-60細(xì)胞的凋亡和自噬，但是值得注意的是，其誘導(dǎo)的自噬對HL-60細(xì)胞具有保護(hù)作用，而抑制自噬可以促進(jìn)槲皮素誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡[24]。Taylor等[25]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的保護(hù)性自噬，在營養(yǎng)缺乏的條件下誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬以后，槲皮素和丁酸鈉的給藥導(dǎo)致Beclin-1和LC3II水平降低，提示自噬被抑制。這種組合導(dǎo)致凋亡癌細(xì)胞數(shù)量增加。為了探究槲皮素對肝纖維化的影響，Wu等[26]進(jìn)行了研究，在BDL和四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，槲皮素降低了Beclin-1和LC3的表達(dá)，增加了P62的表達(dá)。槲皮素通過抑制TGF-β1/Smads信號通路和激活PI3K/Akt信號通路抑制自噬來減輕肝損害。為了研究槲皮素對氧化損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞的潛在保護(hù)作用，Zhi等[27]進(jìn)行了研究，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明槲皮素通過激活ERK信號通路促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的自噬，并以劑量依賴的方式減少了ox-LDL（氧化低密度脂蛋白）引起的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡，還改善了ox-LDL處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞中的管形成、遷移和粘附，將細(xì)胞功能恢復(fù)到與非ox-LDL處理的細(xì)胞相似的水平，這種保護(hù)作用是通過誘導(dǎo)自噬來實(shí)現(xiàn)的。

3.3 高良姜素 高良姜素（GA，3，5，7-三羥基黃酮）是天然活性黃酮醇化合物之一，是一種多酚類化合物，主要從高良姜、松柏、車前草和半枝蓮的根中提取。高良姜素素具有許多生物活性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、細(xì)胞保護(hù)等作用[28]。在Zhang等[29]的研究中，高良姜素通過激活A(yù)MPK和抑制HepG2細(xì)胞中mTOR的活性來誘導(dǎo)自噬，抑制HepG2細(xì)胞的增殖。自噬泡的形成和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)證實(shí)了高良姜素對自噬的誘導(dǎo)作用。不同的是，Kong等[30]研究表明，高良姜素同時誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡和保護(hù)性自噬，高良姜素通過激活膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的AMPK/mTOR途徑誘導(dǎo)保護(hù)性自噬，抑制自噬加重了高良姜素誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡和焦脫。岡田酸（OA）誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性可能被認(rèn)為是研究阿爾茨海默?。ˋD）病理學(xué)的新工具，Huang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，OA可以激活PC12細(xì)胞自噬并增加Beclin-1的表達(dá)，相反，高良姜素顯著降低Beclin-1的表達(dá)，促進(jìn)Akt和mTOR磷酸化，但抑制GSK3β磷酸化，起到抑制自噬的作用。Xuan等[32]使用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎樣模型研究了高良姜素給藥對腸道炎癥的潛在影響，與對照組相比，在結(jié)腸炎小鼠中觀察到自噬標(biāo)記蛋白（包括ATG5、ATG7、ATG12和LC3B）下調(diào)。而高良姜素通過增加上述自噬相關(guān)蛋白促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞自噬，減輕了腸道炎癥引起的損傷，以及臨床絞痛癥狀。Zhang等[33]用高良姜素治療增加了HFD小鼠和非酒精性脂肪肝細(xì)胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Atg3、AMPKα1和磷酸化AMPKα1蛋白的表達(dá)水平，并降低了mTOR的表達(dá)。高良姜素在體內(nèi)外誘導(dǎo)自噬改善肝細(xì)胞脂肪變性，具有肝臟保護(hù)作用。

3.4 桑色素 桑色素（2'，3，4'，5，7-五羥基黃酮）是一種生物活性化合物，尤其在?？浦参镏泻控S富。桑色素已被證明具有多種藥理活性，包括減輕炎癥、心臟保護(hù)、抗癌活性、免疫調(diào)節(jié)、抗菌活性等[34]。Singh等[35]研究發(fā)現(xiàn)，桑色素能減輕順鉑誘導(dǎo)的HEK-293人胚胎腎上皮細(xì)胞炎癥和自噬，桑色素和順鉑聯(lián)合治療能顯著抑制p-AMPK、BECN-1和LC3II的表達(dá)水平從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬和細(xì)胞死亡機(jī)制，其有望成為在順鉑化療期間的腎臟保護(hù)劑。無煙煙草提取物（STE）通過降低人類鱗狀上皮細(xì)胞SCC-25的活力，同時誘導(dǎo)凋亡和自噬信號，參與口服毒性。體外研究發(fā)現(xiàn)[36]，一定劑量的桑色素能夠抑制STE處理的人類鱗狀上皮細(xì)胞SCC-25細(xì)胞中活性氧誘導(dǎo)的自噬，消除STE誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）與影響認(rèn)知、記憶和行為的神經(jīng)退行性病變密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[37]，桑色素能抑制創(chuàng)傷性腦損傷小鼠模型的癡呆標(biāo)志物，降低炎癥標(biāo)志物和調(diào)節(jié)凋亡/抗凋亡參數(shù)，增強(qiáng)自噬過程（LC3BⅡ，Beclin-1水平升高），發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Zhang等[38]發(fā)現(xiàn)桑色素處理顯著上調(diào)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LC3的表達(dá)，下調(diào)了p62的表達(dá)，通過激活A(yù)MPK信號通路誘導(dǎo)自噬減輕氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的損傷，發(fā)揮血管保護(hù)作用。

3.5 楊梅素 楊梅素（3，5，7，3'，4'，5'-六羥基黃酮醇）最初是從楊梅樹皮中分離得到的，它是一種由淡黃色晶體組成的多羥基黃酮醇化合物，常見于水果、蔬菜等日常食品中?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，楊梅素具有多種生物活性，如抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和和保護(hù)肝臟免受潛在損傷等[39]。關(guān)于楊梅素對自噬的作用的研究較少，Cao等[40]研究發(fā)現(xiàn)，用楊梅素處理增加了肝癌細(xì)胞LC3-Ⅱ和PI3KⅢ的水平，下調(diào)了P62的水平，并通過抑制mTOR磷酸化誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬，雖然使用楊梅素抑制了肝癌細(xì)胞的增殖，但是研究發(fā)現(xiàn)楊梅素誘導(dǎo)的自噬對肝癌細(xì)胞具有保護(hù)作用，而抑制自噬增加了肝癌細(xì)胞的凋亡。Kim等[41]和Nirmala等[42]證明楊梅素可以在體外和體內(nèi)抑制結(jié)直腸癌的生長。Zhu等[43]研究了楊梅素對誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和自噬的影響，結(jié)果表明，楊梅素處理后，HCT116和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1的水平升高，楊梅素通過抑制HCT116和SW620細(xì)胞的PI3K/Akt/mTOR信號誘導(dǎo)保護(hù)性自噬，而抑制楊梅素誘導(dǎo)的自噬可以增強(qiáng)楊梅素誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW620細(xì)胞凋亡。M10是楊梅素的一種衍生物，是在楊梅素的基礎(chǔ)上加入親水基團(tuán)設(shè)計的。這種化學(xué)改性可以提高M(jìn)10的溶解度，提高其生物活性，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。研究發(fā)現(xiàn)，M10可以顯著抑制自噬體、LC3-Ⅱ和Bcelin-1的形成，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬，抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生[44]。

4 其他黃酮醇化合物對自噬的影響

上文介紹了對自噬具有調(diào)節(jié)作用的五種黃酮醇化合物，除此之外，其他黃酮醇，如蘆丁和非瑟桐等，也具有調(diào)節(jié)自噬的作用，低濃度蘆?。?，3'，4'，5，7-五羥基黃酮-3-鼠李糖苷）治療可能通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制自噬減輕吡柔比星對心肌細(xì)胞的心臟毒性作用[45]，蘆丁還通過抑制自噬增加替莫唑胺對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞毒性[46]，非瑟桐（3，7，3'，4'-四羥基黃酮）不僅能抑制人類非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞中的mTOR信號通路通路，還能抑制上游激酶PI3K/Akt信號通路，對mTOR和PI3K/Akt的抑制均抑制癌細(xì)胞的存活和生長[47]。

5 結(jié)語

自噬是一種細(xì)胞存活機(jī)制，對于在生理和病理?xiàng)l件下保持體內(nèi)平衡至關(guān)重要，自噬異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在過去的幾十年里，天然化合物作為潛在的抗癌藥物獲得了許多關(guān)注，其具有豐富的藥理活性且比化療更安全。山奈酚、槲皮素、高良姜素、桑色素、楊梅素這幾種黃酮醇化合物通過影響 LC3-Ⅱ、ATG、p62和Beclin-1，P53等分子水平來下調(diào)或上調(diào)自噬，PI3K/Akt/mTOR/AMPK是常見的自噬調(diào)節(jié)通路。雖然許多黃酮醇化合物的體外功效已經(jīng)有了研究，但大多數(shù)化合物對自噬的作用缺乏有效的體內(nèi)證據(jù)以及臨床研究，研究人員在將這些天然化合物用作臨床環(huán)境中的治療之前仍面臨挑戰(zhàn)。此外，黃酮醇化合物的低生物利用度限制了其臨床應(yīng)用，已有一些方法來提高其利用度，如使用吸收促進(jìn)劑、結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換（如前藥、糖基化）和制藥技術(shù)（如載體復(fù)合物、納米技術(shù)、共晶）[48]等，但這些技術(shù)仍存在缺點(diǎn)，因此需要更多的研究來改善。