兩種纖維素醚類親水膠體對冷凍面團中面筋蛋白的影響

韓可陽，劉亞偉，劉 潔

河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

面筋蛋白是面團的重要組分之一，因其具有較強的持水性、起泡性以及黏彈性，對面團的延展性和持氣性起重要作用[1]。凍藏過程中，面筋蛋白中的二硫鍵減少，從而發(fā)生部分解聚，冰晶使面筋蛋白分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生變化，導(dǎo)致冷凍面團的品質(zhì)發(fā)生劣變[2-3]。親水膠體良好的親水性和持水性能夠減少冷凍面團中的游離水含量，從而減少冰晶對面筋蛋白的破壞[4]。羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose, CMC)是一種纖維素醚類親水膠體，廣泛應(yīng)用在食品、材料、醫(yī)學等領(lǐng)域[5]。CMC與面筋蛋白相互作用，不僅能夠改善冷凍面團的流變學特性，還能抑制冷凍面團中冰晶的形成與生長，減少冰晶對面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞，提高面團的持氣能力和穩(wěn)定性[6-8]。羥丙基甲基纖維素鈉(hydroxypropyl methyl cellulose, HPMC)是纖維素經(jīng)環(huán)氧丙烷和氯甲烷通過醚化反應(yīng)生成的纖維素醚類衍生物[9]。將HPMC、阿拉伯樹膠、魔芋葡甘聚糖和蘋果果膠添加到面粉中，結(jié)果表明HPMC能夠更好地改善面筋蛋白的流變學特性和延伸性[10]。目前研究多為將不同多糖基材分別添加到面團中進行效果比較[9-10]，而將CMC和HPMC混合復(fù)配應(yīng)用還未見報道。

本課題組之前的研究表明，添加不同復(fù)配比例的CMC和HPMC能夠減緩凍藏過程中冷凍面團及其饅頭的品質(zhì)劣變，作者將進一步探究不同復(fù)配比例的CMC和HPMC對冷凍面團中面筋蛋白結(jié)構(gòu)和特性的影響，為其改善冷凍面團的品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉：益海嘉里金龍魚糧油股份有限公司。

酵母：安琪酵母股份有限公司；CMC(食品級)：河南萬邦實業(yè)有限公司；HPMC(食品級)：鄭州鴻瑞食品有限公司；氯化鈉(分析純)、脲、甘氨酸：天津市科密歐化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷：天津市光復(fù)精細化工研究所；5,5′-二硫基(2-硝基苯甲酸)：北京百奧萊博科技有限公司；8-苯胺-1萘磺酸：北京沃凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AY-120電子分析天平、UV-2700紫外分光光度計：日本島津公司；MB45鹵素水分測定儀：美國OHAUS公司；HR-1流變儀、Q20差示掃描量熱儀(DSC)：美國TA公司；FD-1A-80冷凍干燥機：北京博愿實驗有限公司；Nicolet6700傅里葉紅外光譜儀：美國Thermo Scienctific公司；熒光分光光度計：FLUKO公司；Seven Multi pH計：瑞士METTLER-TOLEDO公司；Quanta250掃描電子顯微鏡：美國FEI公司；磁力攪拌器：德國IKA儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 CMC和HPMC不同復(fù)配比例面粉的配制

保持面粉與CMC和HPMC的總質(zhì)量不變，向面粉中添加CMC和HPMC(CMC和HPMC的質(zhì)量比分別為0.5∶ 0.3、0.5∶ 0.5、0.5∶ 0.7、0.7∶ 0.3、0.7∶ 0.5、0.7∶ 0.7、0.9∶ 0.3、0.9∶ 0.5、0.9∶ 0.7)，混合均勻后備用，以未添加CMC和HPMC的面粉為空白對照。

1.3.2 冷凍面團及面筋蛋白的制備

冷凍面團的制備參照GB/T 35991—2018并稍加修改。稱500 g面粉置于和面機的面缽中，倒入265 mL蒸餾水，先慢速攪拌6 min至形成面團，然后快速攪拌1 min，使面團表面光滑。將面團分割成100 g/個，壓片8次，手工搓圓，然后用保鮮膜包裹置于速凍機中，-30 ℃速凍1 h，然后于-18 ℃冰柜中凍藏0、7、14、21、28 d，得到不同凍藏時間的冷凍面團。

面筋蛋白的制備：(1)取出凍藏相應(yīng)時間的面團樣品，解凍，將面團放在手掌心中，用2%NaCl溶液以50 mL/min洗滌8 min，同時用手不停地揉搓面團，將已經(jīng)成形的面筋球繼續(xù)用自來水沖洗、揉捏，直至面筋中的淀粉洗凈為止。(2)用手反復(fù)擠壓面筋球，直到稍感面筋粘手為止(擠壓約15次)。(3)將排水后的面筋置于-18 ℃的冰箱中凍藏12 h，然后冷凍干燥24 h。(4)將冷凍干燥后的面筋蛋白研磨，過80目篩。

從添加CMC和HPMC質(zhì)量比分別為0.5∶ 0.3、0.5∶ 0.5、0.5∶ 0.7、0.7∶ 0.3、0.7∶ 0.5、0.7∶ 0.7、0.9∶ 0.3、0.9∶ 0.5、0.9∶ 0.7的面團中提取面筋蛋白，分別記為CH1、CH2、CH3、CH4、CH5、CH6、CH7、CH8、CH9。從未添加CMC和HPMC的面團中提取面筋蛋白作為對照。

1.3.3 面筋蛋白流變學特性的測定

取1.3.2中排水后的面筋球2 g置于流變儀樣品臺上，進行如下程序。(1)應(yīng)變掃描：采用Ф40 mm的不銹鋼平板，間距1 000 μm，靜置5 min，掃描范圍0.1%～100%，頻率1 Hz。(2)動態(tài)頻率掃描：掃描范圍0.1～10 Hz，應(yīng)變值0.5%，所用夾具、間距、靜置時間等都與應(yīng)變掃描試驗相同。頻率每增加10倍在流變曲線中記錄8個數(shù)據(jù)點。

1.3.4 面筋蛋白熱力學特性的測定

通過差示掃描量熱儀測定蛋白質(zhì)的熱變性溫度(Td)和焓(ΔH)。Td反映蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，ΔH則代表蛋白質(zhì)中疏水性基團與親水性基團的分布情況，還可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度。稱取過80目篩的面筋蛋白樣品8.5 mg，密封于鋁制坩堝中。測定程序：溫度20～100 ℃，升溫速率5 ℃/min。

1.3.5 面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定

取面筋蛋白樣品與KBr按照質(zhì)量比1∶ 100混合于研缽中，研磨均勻。傅里葉紅外光譜儀光譜分辨率4 cm-1，波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，用軟件Peakfit對酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)進行擬合數(shù)據(jù)，求出面筋蛋白的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋以及無規(guī)則卷曲的相對百分含量。

1.3.6 面筋蛋白游離巰基含量的測定

參考文獻[11]的方法并稍做修改，稱取200 mg 面筋蛋白樣品，溶于20 mL標準緩沖溶液中(8 mol/L脲、86 mmol/L三羥甲基氨基甲烷、90 mmol/L甘氨酸，pH 8.0)，25 ℃攪拌30 min，然后4 000 r/min離心10 min。采用考馬斯亮藍法測定上清液蛋白質(zhì)濃度。向比色管中加入5 mL標準緩沖液，然后加入1 mL上清液，最后加入0.04 mL 5,5′-二硫基(2-硝基苯甲酸)，混合均勻后于25 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min，在412 nm處測定該溶液的吸光度。

式中：73.53為消光系數(shù)；A412為吸光度；D為稀釋因子；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.7 面筋蛋白表面疏水性的測定

參考文獻[12]的方法并稍做修改，稱取0.2 g面筋蛋白粉末分散于30 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 7.0)中，磁力攪拌30 min，4 000 r/min離心10 min。采用考馬斯亮藍法測定上清液蛋白質(zhì)濃度。用磷酸鹽緩沖溶液分別將上清液稀釋為5個濃度(0.02～0.5 mg/mL)。吸取4 mL蛋白質(zhì)樣品于比色管中，加入40 mL 8-苯胺-1萘磺酸(15.00 mmol/L)混合均勻，避光反應(yīng)10 min，用熒光分光光度儀測定吸光度。測試條件：激發(fā)、發(fā)射波長分別為365、484 nm。對以吸光度為縱坐標、蛋白質(zhì)濃度為橫坐標的曲線進行線性回歸分析，得到的斜率表征蛋白質(zhì)表面疏水性。

1.3.8 面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的測定

將冷凍干燥后的面筋蛋白固定于樣品臺上，經(jīng)過電子濺射儀噴金，然后置于電子顯微鏡上進行掃描拍攝，工作電壓15 kV。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 20、Origin 2019進行數(shù)據(jù)處理和制圖；采用Duncan檢驗法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋流變特性的影響

動態(tài)頻率掃描在0.1～10 Hz范圍內(nèi)，所有的濕面筋樣品的G′都大于G″(圖1)，表現(xiàn)為類固體的流變學特征，即面筋蛋白不僅具有黏性流體的特性，還具有彈性固體的特性[13]。含有CMC和HPMC的濕面筋的G′和G″均大于對照濕面筋的，其中CH4的最大。隨著凍藏時間的增加，濕面筋的G′和G″有不同程度的下降。這與潘治利等[14-17]的研究結(jié)果相同，凍藏破壞了麥谷蛋白分子中的部分氫鍵和二硫鍵，改變了面筋蛋白的功能特性，從而導(dǎo)致面團結(jié)構(gòu)的功能性和穩(wěn)定性很大程度地下降。在凍藏過程中，低溫導(dǎo)致面團中的水分發(fā)生結(jié)晶，由于凍藏時間的延長、溫度的變化等還會造成冰晶重結(jié)晶。通過與對照濕面筋對比發(fā)現(xiàn)，凍藏28 d后，含有不同復(fù)配比例的CMC和HPMC的面筋的G′和G″變化減小，其中CH4的變化最小，說明復(fù)配膠體的加入有效地抑制了面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被冰晶的破壞。這與Julianti等[18]的研究相似，親水膠體中的親水基團能與面筋蛋白發(fā)生相互作用，使面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)達到最佳的水合狀態(tài)，改變其流變學特性。

注：a—e分別為面筋蛋白凍藏0、7、14、21、28 d的彈性模量(G′); A—E分別為面筋蛋白凍藏0、7、14、21、28 d的黏性模量(G″)。圖1 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋蛋白的G′和G″的影響Fig.1 Effects of different ratios of CMC and HPMC and frozen storage time on G′ and G″ of gluten

2.2 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋蛋白熱力學特性的影響

未凍藏時對照面筋蛋白的Td和ΔH分別為56.02 ℃(表1)、1.294 J/g(表2)，凍藏28 d后Td減少了4.48 ℃，ΔH減少了0.421 J/g，可能是因為在凍藏過程中，冰晶使面筋蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，使面筋蛋白的伸展程度增加。這與Wang等[19]的研究結(jié)果相同，凍藏后面筋蛋白的有序結(jié)構(gòu)減少，從而使面筋蛋白的ΔH減小。含有不同復(fù)配比例CMC和HPMC的面團，不僅可以提高面筋蛋白的Td和ΔH，并且凍藏28 d后，面筋蛋白的Td和ΔH的變化減小，其中CH4的變化最小，分別減少了1.59 ℃和0.182 J/g，說明不同復(fù)配比例的CMC和HPMC能夠減少面筋蛋白在凍藏過程中受到的破壞，維持面筋蛋白的穩(wěn)定性。親水膠體可以通過物理纏結(jié)和非共價鍵相互作用與面筋蛋白相互作用，從而保持面筋蛋白的熱穩(wěn)定性[20]。

表1 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋蛋白熱變性溫度(Td)的影響Table 1 Effects of different ratios of CMC and HPMC and frozen storage time on thermal denaturation temperature of gluten

表2 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋蛋白熱變性焓(ΔH)的影響Table 2 Effects of different ratios of CMC and HPMC and frozen storage time on thermal denaturation enthalpy of gluten

2.3 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

隨著凍藏時間的延長，面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)有著不同程度的變化，其中β-折疊、α-螺旋含量增加，β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲含量減小(表3)，表明隨著凍藏時間的增加，面筋蛋白穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被破壞，這可能是因為面筋蛋白的β-轉(zhuǎn)角含量與麥谷蛋白多肽鏈的β-回旋空間域的結(jié)構(gòu)相關(guān)[21]。無規(guī)則卷曲的含量隨著凍藏時間的延長顯著減小，可能是由于冰晶擠壓造成的。

表3 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effects of different ratios of CMC and HPMC and frozen storage time on the secondary structure of gluten

不同復(fù)配比例的CMC和HPMC使未凍藏面筋蛋白的β-折疊、無規(guī)則卷曲含量增加，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角的含量減少，這可能是因為CMC和HPMC與面筋蛋白之間存在著相互作用，形成了新的氫鍵，進而影響了蛋白的構(gòu)象[22]。凍藏28 d，對照面筋蛋白的β-折疊、α-螺旋的含量分別增加了9.60%、20.88%，β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的含量分別減少了14.80%、19.38%，而添加了不同復(fù)配比例CMC和HPMC的面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化減小，其中CH4的變化最小(CH4的β-折疊、α-螺旋的含量分別增加了3.38%、12.22%，β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的含量分別減少了7.60%、7.40%)，說明添加不同復(fù)配比例的CMC和HPMC能夠減少面筋蛋白在凍藏過程中二級結(jié)構(gòu)的變化。這與汪星星[23]的研究結(jié)果相似，親水膠體能夠抑制面筋蛋白的變性，減小面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)中各結(jié)構(gòu)含量的變化。

2.4 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋蛋白表面疏水性的影響

凍藏0～28 d，在相同凍藏時間下，添加CMC和HPMC不同復(fù)配比例的面筋蛋白表面疏水性均小于對照樣品，并且凍藏21 d的未添加親水膠體的面筋蛋白表面疏水性為36.61，大于凍藏28 d的CH2、CH4、CH5、CH8的表面疏水性(圖2)。隨著凍藏時間的延長，冷凍面團中冰晶生長、重結(jié)晶，破壞了面筋蛋白的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生變化，面筋蛋白分子內(nèi)部的疏水基團暴露，從而使面筋蛋白表面疏水性提高[24]。凍藏28 d后，無論是否添加CMC和HPMC的面筋蛋白的表面疏水性均顯著增加，CMC和HPMC的存在減小了面筋蛋白表面疏水性的增加量。說明在凍藏過程中添加不同復(fù)配比例的CMC和HPMC能夠抑制蛋白質(zhì)的變性程度。DSC測定面筋蛋白的變性溫度也表明添加不同復(fù)配比例的CMC和HPMC能夠抑制蛋白質(zhì)的變性程度，這是因為其能夠抑制冰晶對面筋蛋白的破壞，減少冷凍過程中面筋蛋白的解聚。

圖2 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effects of different ratios of CMC and HPMC and frozen storage time on the surface hydrophobicity of gluten

2.5 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋蛋白游離巰基含量的影響

在凍藏各個時期，不同復(fù)配比例CMC和HPMC的面筋蛋白中游離巰基含量均顯著小于對照樣品中游離巰基的含量(表4)。凍藏0～28 d所有樣品中游離巰基含量有不同程度的增加，其中對照樣品增加了3.63 μmol/g。不同復(fù)配比例CMC和HPMC的面筋蛋白中游離巰基含量變化減小，其中CH4的變化最小，為1.81 μmol/g。這可能是因為隨著凍藏時間的延長，冰晶的生長對面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的擠壓作用越明顯，使部分分子內(nèi)與分子間的二硫鍵斷裂，導(dǎo)致面筋蛋白中游離巰基含量增加。而添加不同復(fù)配比例的CMC和HPMC可以降低由于冰晶擠壓對面筋蛋白造成的破壞，從而抑制面筋蛋白的解聚[25-26]。

表4 CMC和HPMC不同復(fù)配比例及凍藏時間對面筋蛋白游離巰基含量的影響Table 4 Effects of different ratios of CMC and HPMC and frozen storage time on free sulfhydryl content in gluten

2.6 CMC和HPMC及凍藏時間對面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

對照面筋蛋白以及添加CH4的面筋蛋白在凍藏前(圖3a、3c)孔室較為均勻和密集。凍藏28 d后(圖3b、3d)，面筋蛋白的孔室變大、分布不均勻、形狀不規(guī)則，這可能是因為在凍藏過程中，冰晶的擠壓破壞了面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性，與Kontogiorgos等[27]研究結(jié)果相近，由于冷凍收縮使面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)孔室受到了擠壓，使其完整性降低。另外，面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)被破壞，會導(dǎo)致水分的遷移和重分布，使部分不可凍結(jié)水轉(zhuǎn)變成可凍結(jié)水。添加CH4的面筋蛋白孔室變化相對較小，仍保持較好的完整性和連續(xù)性，表明CMC和HPMC的存在可以幫助支撐面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及抑制冰晶的重結(jié)晶對面筋蛋白的傷害。

注：a、b分別為對照面筋蛋白凍藏0 、28 d；c、d分別為添加CH4(CMC和HPMC的質(zhì)量比為0.7∶ 0.3)的面筋蛋白凍藏0 、28 d。圖3 面筋蛋白的微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructures of gluten

3 結(jié)論

研究了不同復(fù)配比例的CMC和HPMC經(jīng)過不同凍藏時間(0、7、14、21、28 d)對面團中面筋蛋白的影響。結(jié)果表明：在凍藏的各個階段，添加不同復(fù)配比例的CMC和HPMC能夠增加面筋蛋白的G′和G″，提高面筋蛋白的Td和ΔH，降低面筋蛋白的表面疏水性以及游離巰基含量，減小面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化。不同復(fù)配比例的CMC和HPMC通過保持冷凍面團中面筋蛋白的結(jié)構(gòu)和特性從而改善其品質(zhì)，其中以CMC和HPMC的質(zhì)量比為0.7∶ 0.3時的作用最大。后續(xù)深入研究CMC和HPMC對冷凍過程中面筋蛋白的影響，需要縮短測試周期，并增加對面筋蛋白的測定指標，建立面筋蛋白的在冷凍過程中的品質(zhì)變化模型。