miR-150、Beclin-1 及ELOVL6在原發(fā)性痛風(fēng)患者外周血單個核細胞中的表達及與病情的關(guān)系研究

鄭 冰，顧維杰，汪 池，吳旭強

(成都市第五人民醫(yī)院，四川 成都 611130)

痛風(fēng)是由于嘌呤代謝紊亂，血液中尿酸(UA)生成過多以及排泄減少，尿酸鹽結(jié)晶在關(guān)節(jié)滑膜、軟骨、滑囊或其他組織中沉積而引起的反復(fù)發(fā)作性炎性疾病[1]。隨著飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣的改變，痛風(fēng)發(fā)病率為逐年上升趨勢，探究原發(fā)性痛風(fēng)發(fā)病機制，對患者的預(yù)防及治療有積極意義。有研究認(rèn)為微小RNA可能參與機體的代謝性疾病、自身免疫疾病、炎性疾病等，在痛風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展中也扮演著重要的角色，但其機制還需進一步研究[2]。Beclin-1是酵母自噬相關(guān)基因6中的同系物，有研究顯示，自噬通過直接或間接影響炎性體，對白細胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)具有限制作用，并與痛風(fēng)炎癥反應(yīng)有直接的聯(lián)系[3]。ELOVL6為ELOVL家族中的一員，可表達于肝、腦、腎上腺等組織中，有研究發(fā)現(xiàn)，ELOVL6可參與胰島素敏感性的調(diào)節(jié)，對TOLL樣受體、NLRP3等炎性因子、炎性細胞可具有直接或間接的調(diào)節(jié)作用[4]?；诖?，本文通過分析miR-150、Beclin-1 及ELOVL6在原發(fā)性痛風(fēng)患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中的表達情況，并探討三者與患者病情之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集本院2018年3月至2021年5月我院收治的原發(fā)性痛風(fēng)患者98例(GA組)，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國風(fēng)濕病學(xué)會中有關(guān)原發(fā)性痛風(fēng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②患者家屬均知曉并同意本次研究，已簽署知情同意書；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有痛風(fēng)石形成；②合并存在尿酸鹽腎病、尿酸性尿路結(jié)石者；③存在內(nèi)分泌、心、肝、腎等系統(tǒng)存在嚴(yán)重疾病者；④近期3個月內(nèi)有使用激素藥物治療者；⑤為繼發(fā)性痛風(fēng)者。98例患者中男67例，女31例，年齡為30～74歲[(51.26±4.15)歲]，病程1～10年[(5.14±2.33)年]。并根據(jù)患者臨床癥狀分為急性期(AGA組)47例與非急性期(NAGA組)51例，AGA組中男33例，女14例，年齡30～74歲[(50.33±3.61)歲]，病程1～10年[(5.35±1.64)年]；NAGA組中男34例，女17例，年齡30～74歲[(51.11±3.59)歲]，病程1～10年[(4.93±1.73)年]，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。另選取本院同期健康體檢志愿者84例(對照組)，身體健康，無痛風(fēng)史、感染史、心血管疾病者，實驗室檢查均正常，其中男55例，女29例，年齡30～75歲[(51.54±4.61)歲]，GA組與對照組在性別、年齡等一般資料上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法①miR-150、Beclin-1 及ELOVL6檢測方法：患者均在入院后次日清晨空腹抽取靜脈血液3 ml，對照組則在體檢當(dāng)日清晨空腹抽取靜脈血液3 ml，使用人淋巴細胞分離液無菌分離出PBMC，分離液由天津灝洋生物公司提供。miR-150、Beclin-1 及ELOVL6均使用Western blotting 技術(shù)檢測。將所獲PBMC行SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)膜封閉，使用CST公司提供的兔抗人miR-150、Beclin-1 及ELOVL6(1∶1000)、北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供GAPDH(1∶1000)，二抗為京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供分山羊抗兔IgG(1∶3 000)，進行孵育，隨后通過洗膜、ECL顯色后使用相關(guān)軟件進行分析，以GAPDH為內(nèi)參，所得miR-150、Beclin-1 、ELOVL6 灰度值 /GAPDH 灰度值作為miR-150、Beclin-1 及ELOVL6蛋白相對表達量。②UA檢測：入選者與清晨空腹抽取靜脈血液3 ml，獲取患者血液標(biāo)本，使用離心機離心后使用DxC800全自動生化儀分析UA，試劑由齊一生物科技(上海)有限公司提供。

1.3 觀察指標(biāo)①對比不同人群中miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表達情況；②對比AGA、NAGA組miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表達情況及視覺模擬評分(visual analogue scale，VAS)。在入院時均使用VAS評估患者疼痛情況，得分越高代表患者疼痛情況越嚴(yán)重[6]。③分析miR-150、Beclin-1 及ELOVL6與UA、VAS評分相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以n(%)表示，采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同人群miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表達情況比較GA組miR-150、Beclin-1 、ELOVL6蛋白表達均明顯低于對照組，UA表達則明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 AGA組與NAGA組miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表達情況及VAS評分比較AGA組患者miR-150、Beclin-1 、ELOVL6表達低于NAGA組，UA、VAS評分高于NAGA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 miR-150、Beclin-1 及ELOVL6與UA、VAS評分相關(guān)性分析miR-150、Beclin-1 及ELOVL6與UA、VAS評分之間均為負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表1 不同人群miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表達情況比較

表2 AGA組與NAGA組miR-150、Beclin-1 、ELOVL6、UA表達情況及VAS評分比較

表3 miR-150、Beclin-1 及ELOVL6與UA、VAS評分相關(guān)性分析

3 討論

Beclin-1是自噬的特異性基因。在以往有研究顯示，Beclin-1蛋白表達情況可反應(yīng)出機體中自噬活性，通過饑餓誘導(dǎo)細胞自噬實驗發(fā)現(xiàn)，自噬進程十分快速，Beclin-1 蛋白在饑餓誘導(dǎo)后1h表達上調(diào)，3h后到達峰值后逐漸降低[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1 表達降低說明原發(fā)性痛風(fēng)患者機體中存在自噬異常激活，并可通過自噬溶酶體途徑進行降解[8]。在本研究中發(fā)現(xiàn)原發(fā)性痛風(fēng)患者其體內(nèi)Beclin-1蛋白表達明顯低于對照組，且隨著患者病情進展為逐漸降低趨勢，Beclin-1蛋白異常表達提示原發(fā)性痛風(fēng)患者體內(nèi)自噬異常，Beclin-1蛋白與原發(fā)性痛風(fēng)發(fā)生、發(fā)展間存在一定聯(lián)系。

miRNA通過轉(zhuǎn)錄后水平在機體中發(fā)揮著作用，參與細胞分化、增殖、發(fā)育應(yīng)答過程[9]。多項研究中均提示，miRNA可通過和TLRs、NLRP3、NF-κB等靶點進行結(jié)合，從而參與痛風(fēng)炎癥的發(fā)生、發(fā)展[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在痛風(fēng)患者與骨關(guān)節(jié)炎患者的PBMC中的表達，明顯低于健康人群。與本研究結(jié)果相符，且在本研究中，AGA組miR-150低于NAGA組，與以往研究結(jié)果相符，提示miR-150可能參與痛風(fēng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其表達水平則與炎癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[11]。在Shi等[12]研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-150表達水平與痛風(fēng)患者急性期的白細胞、中性粒細胞之間為負(fù)相關(guān)，與慢性患者的炎癥指標(biāo)則為正相關(guān)。

在以往有動物實驗證明，ELOVL6(-/-)鼠對SREBP-1、過氧化物酶體增殖物活化受體下游的脂代謝基因表達有抑制作用，從而改變細胞內(nèi)脂肪酸成分，有利于恢復(fù)胰島素受體(IRS-2)的敏感性；同時對肝蛋白激酶Cε具有抑制作用，恢復(fù)IRS-1、2絡(luò)氨酸激酶磷酸化，并維持IRS-1、2功能，降低機體胰島素抵抗[13]。有研究顯示，原發(fā)性痛風(fēng)患者具有明顯代謝紊亂及胰島素抵抗現(xiàn)象，ELOVL6可改變細胞內(nèi)脂質(zhì)、穩(wěn)定機體能量，對胰島素受體敏感性有調(diào)節(jié)作用，從而參與了胰島素抵抗與原發(fā)性痛風(fēng)發(fā)病過程[14]。在本研究中GA組ELOVL6蛋白表達低于對照組，且隨著GA組患者病情加重ELOVL6的表達也更低。

在臨床中發(fā)現(xiàn)，血液中UA濃度與痛風(fēng)之間關(guān)系密切，UA濃度升高者其痛風(fēng)發(fā)生概率明顯升高。如果大量的尿酸鹽在患者的關(guān)節(jié)及周圍的組織中大量的沉積，一旦受到外界環(huán)境改變或創(chuàng)傷觸發(fā)，可導(dǎo)致晶體大量的被釋放到關(guān)節(jié)腔間隙，炎性細胞則可在局部大量聚集，導(dǎo)致痛風(fēng)急性發(fā)作[15]。VAS評分則是臨床中評估患者疼痛的有效指標(biāo)，得分越高代表患者疼痛更嚴(yán)重。在本研究中miR-150、Beclin-1 及ELOVL6與UA、VAS評分之間均為負(fù)相關(guān)，進一步支持miR-150、Beclin-1 及ELOVL6表達異常在痛風(fēng)發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用，隨著患者病情進展，三者表達也明顯降低。

綜上所述，miR-150、Beclin-1 及ELOVL6在原發(fā)性痛風(fēng)患者PBMC中的表達均下調(diào)，與患者病情關(guān)系密切。臨床中可以三者作為相關(guān)潛在靶基因研究，為臨床靶向治療原發(fā)性痛風(fēng)提供新方向。