生長激素釋放肽基因多態(tài)性與青春期前特發(fā)矮小患兒重組人生長激素治療療效的關(guān)系研究

雷巧容，李自尊，宋芬芳，石海燕，李 科

(邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒童康復(fù)保健科，湖南 邵陽 422000)

特發(fā)性矮小屬于多基因遺傳病，是一種暫時(shí)性、原因不明的身材矮小癥[1]?？赡苁怯捎诓±砘蛘呱淼榷喾N原因引起的身材矮小。診斷標(biāo)準(zhǔn)主要是特發(fā)性矮小癥孩子的身高低于相同同種族、地區(qū)、性別、年齡正常標(biāo)準(zhǔn)參考范圍平均值兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差[2]。關(guān)于特發(fā)性矮小癥材致病機(jī)理至今尚未闡明，但皮下注射重組人生長激素(rhGH)是治療特發(fā)性矮小公認(rèn)的方法。rhGH是采用DNA重組技術(shù)合成的激素類物質(zhì)[3]，能夠促進(jìn)脂肪組織分解、合成代謝、肝糖原分解及骨骺軟骨細(xì)胞增殖合成基質(zhì)[4]，所以除了治療各類矮小癥外，還廣泛應(yīng)用于其他的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。生長激素釋放肽(Ghrelin)在外周、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸道中均勻分布，相關(guān)研究證實(shí)，Ghrelin可能具有旁分泌和內(nèi)分泌的作用[5]，Ghrelin在生長激素調(diào)節(jié)方面起著重要作用[6]。本研究探討Ghrelin基因多態(tài)性與青春期前特發(fā)矮小患兒rhGH治療療效的相關(guān)性，旨在為臨床特發(fā)矮小的治療提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年9月1日至2021年12月30日在邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒童保健科門診診治的特發(fā)性矮小癥兒童及青少年48例作為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡8～14歲；②符合《矮身材兒童診斷指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；③身高低于本種族、同年齡以及同性別正常健康兒童身高第3百分位數(shù)或2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上；④生長速率(GV)≤5 cm/年；⑤生長激素激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定生長激素(Growth hormone ,GH)峰值≥10 μg/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①遺傳代謝病，GH缺乏癥等引起的矮??；②器質(zhì)性疾病患兒；③嚴(yán)重的肝、臟、腎器官異常或惡性腫瘤患兒。選取本院同期體檢健康兒童48例為對(duì)照組。本研究在通過倫理委員會(huì)審核后實(shí)施，所有患者監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1治療方式 對(duì)照組不予任何干預(yù)，研究組48例受試兒童注射重組人生長激素治療，治療效果具有劑量依賴性應(yīng)存在個(gè)體差異，參考我國《基因重組人生長激素兒科臨床規(guī)范應(yīng)用的建議》[7]，治療建議中rhGH治療應(yīng)采用個(gè)體化治療，宜從小劑量開始，在治療過程中，宜根據(jù)生長情況以及生化檢測(cè)結(jié)果等適時(shí)進(jìn)行劑量調(diào)整。重組人生長激素注射液(長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字：S20050024)劑量為0.125～0.20 IU/(kg·d)，每天1次，臨睡前半小時(shí)皮下注射，每天1次，連續(xù)干預(yù)1年。

1.2.2基因測(cè)序 治療前和治療后1年采集受試兒童的靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸抗凝，利用血液試劑盒提取基因組DNA,收集所得DNA溶液,進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物,通過PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增rs696217和rs26312位點(diǎn) SNP的片段。設(shè)計(jì)的引物分別為rs696217上游引物：AGCAAACACGCTATTACGT，下游引物：TCACACGGACAGGCTCCAAG；rs26312-上游引物：TGGAATGGTCGTATATGAG；下游引物：CATGATTACGGCATTAGCGCA；PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系為 20 μl，符合PCR擴(kuò)增的條件，進(jìn)行PCR 產(chǎn)物純化，變性，用ABI 3500DX測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物未預(yù)期的目的基因片段。

1.3 觀察指標(biāo)①收集兩組受試兒童的臨床資料，包括年齡、身高、體重、骨齡年齡差(BAD)、骨齡指數(shù)(BAI)、血清生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)和胰島素樣生長因子1(IGF-1)水平；②對(duì)比Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)不同基因型的生長速率；③分析Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)不同基因型與特發(fā)矮小的相關(guān)性；④對(duì)比特發(fā)矮小治療前和治療1年后臨床相關(guān)指標(biāo)，包括年齡、生長速率(GV)、年齡對(duì)應(yīng)身高標(biāo)準(zhǔn)差積分(HtSDSca)、骨齡對(duì)應(yīng)身高標(biāo)準(zhǔn)差積分(HtSDSba)、IGFBP-3和IGF-1水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(%)表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用M(Q1，Q3)表示，比較采用秩和檢驗(yàn)；Logistic 回歸分析發(fā)生特發(fā)矮小的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童臨床資料比較兩組兒童年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)；特發(fā)矮小組的身高、體重、BAI、BAD、IGF-1和IGFBP-3水平均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表1。

表1 兩組兒童臨床資料比較

2.2 Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)多態(tài)性分析對(duì)照組和特發(fā)矮小組Ghrelin基因rs696217位點(diǎn)有G和T兩種基因，三種基因型GG、GT和TT，見圖1a；對(duì)照組和特發(fā)矮小組Ghrelin基因rs26312位點(diǎn)有C和T兩種基因，三種基因型CC、CT和TT，見圖1b。

2.3 Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)的基因分布對(duì)照組和特發(fā)矮小組rs696217位點(diǎn)和rs26312位點(diǎn)基因分布情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.4 兩組治療前生長速率基本情況比較特發(fā)矮小組中Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)不同基因型的GV明顯低于對(duì)照組 (P<0.05)，見表3。

圖1 Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)多態(tài)性切割位點(diǎn) a：1、3、11:rs696217位點(diǎn)GG；5、6、7、8、9:rs696217位點(diǎn)GT；4、10、12、13、15:rs696217位點(diǎn)TT ；b:1、8、9、11、13：rs26312位點(diǎn)TT;4、5、7、12：rs26312位點(diǎn)CT;2、3、6、10、14 ：rs26312位點(diǎn)CC

表2 Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)的基因分布頻次

表3 Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)治療前GV比較 (cm/年)

2.5 Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)不同基因型與特發(fā)矮小的關(guān)系分析以rs696217和rs26312不同基因型為自變量，Logistic 回歸分析顯示，rs696217位點(diǎn)中GT、TT基因型是特發(fā)矮小患病的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)不同基因型與特發(fā)矮小的關(guān)系分析

2.6 特發(fā)矮小患兒治療后臨床指標(biāo)比較治療前，特發(fā)矮小組患兒Ghrelin rs696217和rs26312各基因型中年齡、GV、HtSDSca、HtSDSb、IGFBP-3和IGF-1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后,特發(fā)矮小組患兒Ghrelin rs696217基因型GG型中GV、IGFBP-3和IGF-1水平明顯高于GT型和TT型(P<0.05)，而HtSDSca、HtSDSb差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；特發(fā)矮小組患兒Ghrelinrs26312各基因型中GV、HtSDSca、HtSDSb、IGFBP-3和IGF-1水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 特發(fā)矮小患兒Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)治療后臨床相關(guān)指標(biāo)比較

3 討論

目前矮小癥的發(fā)病率高達(dá)30%以上[8]，其中遺傳因素作為影響身高最主要的因素，約占70%以上，對(duì)兒童的心理能力和社會(huì)適應(yīng)能力產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響[9]。GH是一種肽類激素，是人類促生長的最主要激素[10]，而Ghrelin是調(diào)節(jié)GH分泌的內(nèi)源性物質(zhì)，不但具有內(nèi)分泌的作用，而且還能夠增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)和促進(jìn)食欲[11]。Akalu等研究提示，Ghrelin能夠快速的刺激GH分泌，且該生理作用具有一定的依賴性[12]。目前關(guān)于Ghrelin基因多態(tài)性在GHD患兒心臟病變[13]等疾病中出現(xiàn)過相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于Ghrelin基因多態(tài)性在特發(fā)性矮小患兒的相關(guān)報(bào)道較少，所以本研究主要探討Ghrelin基因多態(tài)性rs696217和rs26312位點(diǎn)與青春期前特發(fā)矮小患兒rhGH治療療效的相關(guān)性，為指導(dǎo)青春期前特發(fā)矮小個(gè)性化治療提供理論依據(jù)。

特發(fā)矮小需要及時(shí)干預(yù)，以防低于遺傳的靶身高。隨著rhGH激素的批量生產(chǎn)，rhGH在國內(nèi)得到廣泛應(yīng)用，大量的研究表明，特發(fā)矮小接受rhGH治療取得了較好的療效，而且rhGH治療不良反應(yīng)較少，安全有效，對(duì)改善了特發(fā)矮小的生長率療效確切[14]。rhGH是重組DNA技術(shù)而獲得的激素類物質(zhì)，和內(nèi)源性GH的作用相同。步佳霖等研究表明，rhGH治療矮小癥患兒的臨床療效顯著，且與改善骨代謝具有一定的關(guān)系[15]。

rs696217(Leu72Met)位于Ghrelin基因的第二外顯子區(qū)域，由G→T，此突變導(dǎo)致亮氨酸變成甲硫氨酸[16]。rs26312(-994C/T)位于啟動(dòng)子區(qū)域，由C→T，此突變導(dǎo)致在前驅(qū)蛋白羧基端的精氨酸變?yōu)楣劝滨０穂17]。相關(guān)研究表明，rs696217位點(diǎn)在代謝綜合征及肥胖等疾病中都有相關(guān)報(bào)道[18]。通過臨床資料對(duì)比發(fā)現(xiàn)，特發(fā)矮小組的身高、體重、BAI、BAD、IGF-1和IGFBP-3水平明顯低于對(duì)照組，緊接著對(duì)Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)rs696217位點(diǎn)有G和T兩種基因,三種基因型GG、GT和TT；而rs26312位點(diǎn)有C和T兩種基因，三種基因型CC、CT和TT，且對(duì)照組和特發(fā)矮小組rs696217位點(diǎn)和rs26312位點(diǎn)基因分布情況對(duì)比無顯著性差異。又繼續(xù)驗(yàn)證了rs696217和rs26312位點(diǎn)不同基因的生長速率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特發(fā)矮小組中Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)不同基因型的生長速率明顯低于對(duì)照組，且rs696217位點(diǎn)中GT、TT基因型可能是特發(fā)矮小患兒患病的影響因素,而rs26312位點(diǎn)不同基因型可能不構(gòu)成對(duì)特發(fā)矮小的患病影響因素。最后對(duì)治療前和治療1年后的臨床指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療前，特發(fā)矮小組患兒rs696217和rs26312各基因型的相關(guān)指標(biāo)無明顯變化，治療后，特發(fā)矮小組患兒rs696217 GG型中GV明顯高于GT、TT型，IGF-1和IGFBP-3水平也明顯高于GT、TT型，而其他指標(biāo)以及rs26312位點(diǎn)各基因型指標(biāo)對(duì)比無明顯差異。從而說明rs26312位點(diǎn)GT、TT型可能對(duì)特發(fā)性矮小發(fā)病和rhGH治療有一定的影響。相關(guān)研究表明，兒童特發(fā)性矮小癥患兒應(yīng)用rhGH治療效果滿意，可明顯改善特發(fā)性矮小癥患兒體內(nèi)血清Ghrelin及IGF-1水平,安全無副作用,促進(jìn)患兒健康成長[19]。胡玲等研究表示，rHGH聯(lián)合常規(guī)治療可更有效地治療小兒特發(fā)性矮小癥，其機(jī)制可能與rHGH具有調(diào)節(jié)Ghrelin、IGF-1 水平,從而提高代謝并促進(jìn)細(xì)胞生長有關(guān)[20]。

綜上，Ghrelin基因rs696217位點(diǎn)GT、TT型與特發(fā)性矮小發(fā)病及rhGH的療效可能存在一定的關(guān)系，對(duì)臨床rhGH治療青春期前特發(fā)矮小具有一定的指導(dǎo)意義。本研究存在一定的不足，由于樣本量有限,納入的樣本較少,需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行繼續(xù)驗(yàn)證Ghrelin基因rs696217和rs26312位點(diǎn)和青春期特發(fā)矮小患兒rhGH治療的關(guān)系，為疾病的預(yù)防提供一定的理論基礎(chǔ)。