Choukroun′s富血小板纖維蛋白對人成骨細(xì)胞增殖分化及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2-Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2通路的影響

陳 昊，范文娟

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院武漢市第六醫(yī)院口腔科，湖北 武漢 430015)

口腔醫(yī)學(xué)中種植修復(fù)手術(shù)常因骨量不足導(dǎo)致治療效果不理想，尋找影響人成骨細(xì)胞分化的可靠手段有重要臨床意義。成骨細(xì)胞的骨結(jié)合效應(yīng)是種植體成功的關(guān)鍵，成骨細(xì)胞在種植體表面的黏附、增殖、分化等過程對形成理想的骨結(jié)合界面有重要意義。Choukroun′s富血小板纖維蛋白(Choukroun′s platelet-rich fibrin，PRF)取材簡單、制備過程簡易、無異體成分，在牙槽嵴保存[1]、牙移植[2]等方面已有報道，已成為骨組織工程材料研究的熱點。目前PRF的臨床應(yīng)用仍受到限制，應(yīng)用不廣泛，探討人源PRF對成骨過程的作用效果及具體調(diào)控機制對PRF的臨床推廣有重要意義。Kyyak等[3]研究顯示，PRF與人成骨細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞增殖活力和代謝活力得到顯著提升。報道顯示，相較于富含血小板的血漿制品，PRF可釋放更豐富的細(xì)胞因子，在促進血管生成、激活免疫系統(tǒng)方面更有優(yōu)勢，有助于促進骨結(jié)合與重建[4]。研究表明[5]，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2-Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(ERK1/2-Runx2)通路是成骨細(xì)胞分化的網(wǎng)絡(luò)中心，該通路能夠正性調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過程，但該通路在PRF促進人成骨細(xì)胞增殖分化中機制尚不確定。目前研究多選擇動物源成骨細(xì)胞開展PRF的研究，且多集中于細(xì)胞增殖方面[6]，而關(guān)于不同濃度PRF浸出液對人源成骨細(xì)胞的作用機制較少報道。本研究通過制備含多種細(xì)胞因子的人源PRF浸出液，應(yīng)用人牙槽骨制備人成骨細(xì)胞，觀察不同濃度PRF浸出液對人成骨細(xì)胞分化過程中ERK1/2-Runx2通路的影響，為PRF的臨床推廣提供更充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料牙槽骨取自本院口腔科2021年1～6月收治的拔牙后行牙槽骨修整術(shù)患者5例，年齡18～35歲，排除牙周病、全身性系統(tǒng)疾病、骨代謝疾病、骨折、酗酒或藥物濫用等患者；血樣取自體檢中心的健康志愿者5例，均經(jīng)受試者簽字同意后取材。含10%FBSDMEM完全培養(yǎng)基(武漢尚恩生物技術(shù)有限公司)，堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司)，I型膠原蛋白免疫組化染色試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，BCA蛋白定量分析試劑盒(武漢博爾夫生物科技有限公司)，茜素紅(美國Sigma)，兔抗人ERK1/2、磷酸化ERK1/2、Runx2(美國Abcam公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG單抗(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)。倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯，CKX53型)，酶標(biāo)儀(美國Bio-rad，iBIO-RADMark)。本研究獲得我院倫理委員會審批。

1.2 人成骨細(xì)胞制備無菌條件取臨床拔牙后行牙槽骨整修術(shù)患者的牙槽骨，采用組織塊法[7]原代培養(yǎng)：于DMEM培養(yǎng)基修整邊長1 mm的立方體組織塊，磷酸鹽緩沖液充分洗滌后，按照體積比1∶2加入紅細(xì)胞裂解液，室溫培養(yǎng)10 min后離心，取骨組織，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，血清濕潤后翻轉(zhuǎn)，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)同條件培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2、95%濕度)，換液頻率1～2次/周，80%細(xì)胞融合后傳代培養(yǎng)，取第二代細(xì)胞進行堿性磷酸酶染色法鑒定，顯微鏡下見細(xì)胞內(nèi)較多藍(lán)紫色顆粒即為人成骨細(xì)胞，用于后續(xù)實驗研究。

1.3 PRF及其浸出液的制備采集健康受試者空腹靜脈血10 ml，3000 r/min離心后，棄去上層血細(xì)胞血漿層，用無菌鑷取中間層(PRF凝膠)，剪去下層紅細(xì)胞層，PRF凝膠置于無菌紗布輕壓為膜狀[8]，-80 ℃保存?zhèn)溆?。修整PRF為7 mm×7 mm小膜片，置于24孔板取兩個孔，分別置入1片和2片PRF膜，均加不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液2.5 ml，培養(yǎng)箱孵育24 h后，1400 r/min離心5 min，上清液濾器(0.22 μm)過濾，獲得1×PRF浸出液(1×PRFe)和2×PRFe，4 ℃分別保存?zhèn)溆肹9]。

1.4 分組及干預(yù)方法96孔板接種細(xì)胞密度8×103/ml的第二代人成骨細(xì)胞，分為對照組、PRF1組和PRF2組(5個復(fù)孔)。PRF1組用含1×PRFe的DMEM完全培養(yǎng)基(1∶1)培養(yǎng)，PRF2組用含2×PRFe的DMEM完全培養(yǎng)基(1∶1)培養(yǎng)，對照組用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1細(xì)胞增殖活力檢測 取第二代人成骨細(xì)胞，按照上述“1.4”中的分組和干預(yù)方法，每隔2 d換液，培養(yǎng)至1、3、7 d，加入現(xiàn)配MTT20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上層液，加入DMSO150 μl/孔，充分混勻使溶液澄清，酶標(biāo)儀測定吸光度(A)570 nm。

1.5.2堿性磷酸酶(ALP)活性檢測 取培養(yǎng)至1、3、7 d時的各組細(xì)胞，傾去培養(yǎng)液，每孔用PBS輕柔沖洗2次，加入0.1%的Triton X-100 0.5 ml/孔，4 ℃靜置8～10 h，震蕩后按照ALP檢測試劑盒(磷酸苯二鈉比色法)說明書操作，酶標(biāo)儀測定A510 nm。

1.5.3I型膠原檢測 取培養(yǎng)至7 d時的各組細(xì)胞，傾去培養(yǎng)基，PBS×2次，加4%多聚甲醛固定20 min，蒸餾水×3次，按照試劑盒說明書步驟染色，Image-Pro-Plus 6.0軟件分析I型膠原平均灰度值，代表其表達(dá)水平。

1.5.4茜素紅礦化結(jié)節(jié)檢測 取培養(yǎng)至14、21 d時的各組細(xì)胞，傾去培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，用4%多聚甲醛固定10 min，1%茜素紅染色25 min(37 ℃)，ddH2O沖洗，顯微鏡下觀察，并用Image-Pro-Plus 6.0軟件分析紅色鈣結(jié)節(jié)情況，以積分光密度表示。

1.5.5Western blot法檢測蛋白表達(dá) 取培養(yǎng)至7 d時的各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解25 min、沸水浴8 min，12000 r/min離心15 min，取上清測總蛋白含量，進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，加入稀釋一抗(1∶300 p-ERK1/2、1∶500 ERK1/2、1∶200 Runx2)，4 ℃過夜，加入稀釋二抗(1:2000)，室溫2 h，電化學(xué)發(fā)光顯色，軟件分析蛋白條帶灰度值，與內(nèi)參β-actin的比值即為p-ERK1/2、ERK1/2、Runx2的相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，兩組間比較采用LSD-t檢驗；多組間比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。校驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人成骨細(xì)胞鑒定組織塊消化培養(yǎng)48 h后可見細(xì)胞從骨組織邊緣爬出，多角形為主，72 h后細(xì)胞數(shù)量明顯增多，以骨組織為中心呈小梁網(wǎng)絡(luò)狀向周圍生長，7 d開始逐漸匯集成單層細(xì)胞，見圖1a；經(jīng)堿性磷酸酶染色，人成骨細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)較多藍(lán)色顆粒，見圖1b，1c。

2.2 各組成骨細(xì)胞增殖活力比較與對照組比較，PRF1組和PRF2組MTT實驗A值均升高，且PRF2組高于PRF1組(P<0.05)；與培養(yǎng)1天比較，培養(yǎng)3、7天時三組MTT實驗A值均升高，且培養(yǎng)7天高于培養(yǎng)3天(P<0.05)。見表1。

2.3 各組成骨細(xì)胞ALP活性比較與對照組比較，PRF1組和PRF2組ALP活性升高，且PRF2組高于PRF1組(P<0.05)；隨時間的延長，對照組、PRF1組和PRF2組ALP活性均升高(P<0.05)。見表2。

圖1 人成骨細(xì)胞分離及鑒定a：培養(yǎng)7 d后倒置相差顯微鏡觀察(×100)；b：培養(yǎng)14 d TNAP活性(ALP染色，×40)c：培養(yǎng)14 d TNAP活性(ALP染色，×400)

表1 各組成骨細(xì)胞增殖活力比較

表2 各組成骨細(xì)胞ALP活性比較

2.4 各組成骨細(xì)胞I型膠原免疫組化比較培養(yǎng)7天，對照組、PRF1組和PRF2組I型膠原平均灰度值分別為(30.26±4.51)、(58.30±4.87)、(71.44±6.05)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=82.281，P<0.001)。PRF1組和PRF2組I型膠原平均灰度值高于對照組(t=9.446；t=12.203，均P<0.001)，PRF2組高于PRF1組(t=3.783，P=0.005)。見圖2。

圖2 三組成骨細(xì)胞I型膠原免疫組化染色 a:對照組; b:PRF1組； c:PRF2組(×200)

2.5 各組成骨細(xì)胞茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)積分光密度比較培養(yǎng)14、21天，與對照組比較，PRF1組和PRF2組鈣結(jié)節(jié)積分光密度較高，且PRF2組高于PRF1組(P<0.05)；培養(yǎng)21天三組鈣結(jié)節(jié)積分光密度均高于14天(P<0.05)。見圖3、表3。

2.6 各組成骨細(xì)胞ERK1/2-Runx2信號通路蛋白表達(dá)比較各組ERK1/2相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PRF1組和PRF2組p-ERK1/2、Runx2蛋白相對表達(dá)量高于對照組，且PRF2組高于PRF1組(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 免疫印跡法檢測成骨細(xì)胞ERK1/2-Runx2信號通路蛋白表達(dá)

表4 各組成骨細(xì)胞ERK1/2-Runx2信號通路蛋白表達(dá)比較

3 討論

口腔種植修復(fù)在臨床上已廣泛應(yīng)用，但牙槽嵴或牙槽骨壁缺損、上頜竇位置低等骨量不足問題增加了種植修復(fù)困難程度，限制了種植修復(fù)的適應(yīng)癥。骨移植、生物膜覆蓋引導(dǎo)骨再生是臨床常用解決骨量不足的方法，但前者存在二次手術(shù)、免疫排斥等問題，后者存在創(chuàng)口閉合困難、繼發(fā)感染的問題[10，11]。骨痂形成、骨改建等過程中成骨細(xì)胞分化起重要作用，同時多種細(xì)胞因子、纖維蛋白等參與調(diào)控成骨細(xì)胞增殖分化過程，因此利用自體血液成分制品成為種植修復(fù)的新思路[12]。PRF含血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生因子等細(xì)胞因子，參與成骨相關(guān)細(xì)胞分化過程[13]。本研究設(shè)置不同濃度PRF浸出液，通過檢測PRF對人成骨細(xì)胞增殖分化過程中ERK1/2-Runx2通路蛋白表達(dá)的變化，以探究PRF在此過程中的作用機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，PRF1組和PRF2組MTT實驗A值及ALP活性均升高，且PRF2組高于PRF1組，隨時間的延長，3組MTT實驗A值及ALP活性呈升高趨勢，提示PRF浸出液可顯著促進人成骨細(xì)胞增殖，且2個PRF膜制備的浸出液促進效果更好。研究顯示，應(yīng)用注射型PRF可促進兔成骨細(xì)胞增殖，且呈時間依賴性[14]，與本研究結(jié)果相符。2個PRF膜制備的浸出液效果更好，可能為雙層膜在37 ℃孵育后可獲得更豐富的細(xì)胞生長因子，從而發(fā)揮促進細(xì)胞增殖的作用。本研究PRF1組和PRF2組I型膠原平均灰度值及鈣結(jié)節(jié)積分光密度均高于對照組，且PRF2組高于PRF1組，提示PRF浸出液可顯著促進人成骨細(xì)胞的成骨能力，且2個PRF膜制備的浸出液效果更佳。成骨細(xì)胞可合成和分泌有機骨基質(zhì)，其主要成分為I型膠原，在參與調(diào)控骨礦化和維持骨架完整方面起關(guān)鍵作用，同時在細(xì)胞外微環(huán)境中可傳遞細(xì)胞信號[15]。ALP是早期成骨分化特異性酶，可水解有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷，參與骨細(xì)胞礦化過程。Shah等[16]在仿生種植體表面涂布含有可注射PRF的成骨樣細(xì)胞系MG-63，結(jié)果顯示，相較于未涂布組，涂布組具有更強的增殖礦化能力，由此推測PFR更有利于成骨細(xì)胞增殖分化，利于形成種植體骨結(jié)合界面。

ERK1/2與多種細(xì)胞增殖、凋亡等過程關(guān)系密切，ERK1/2被上游信號磷酸化激活后，可調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子，從而發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[17]。目前認(rèn)為，Runx2是成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，是聯(lián)系細(xì)胞內(nèi)外成骨相關(guān)信息的中心樞紐[18]。ERK1/2可直接影響下游Runx2的轉(zhuǎn)錄活性。Yuh等[19]研究顯示，外源性局部給予ERK1/2-Runx2信號通路上游基因發(fā)育內(nèi)皮基因座1(DEL-1)，可逆轉(zhuǎn)DEL-1缺陷小鼠骨再生缺陷，活化ERK1/2-Runx2信號通路，促進成骨細(xì)胞分化。Park等[20]在體外研究中發(fā)現(xiàn)，紫玉苷I可通過激活ERK1/2-Runx2促進成骨細(xì)胞增殖和分化。ERK1/2-Runx2在成骨細(xì)胞增殖和分化中起重要調(diào)控中，本研究結(jié)果顯示1個或2個PRF的浸出液干預(yù)后，p-ERK1/2、Runx2表達(dá)上調(diào)，且2個PRF的浸出液更高，提示PRF可能通過促進ERK1/2磷酸化，上調(diào)Runx2表達(dá)，激活ERK1/2-Runx2信號通路參與人成骨細(xì)胞增殖分化。

綜上，Choukroun′s富血小板纖維蛋白可能通過激活ERK1/2-Runx2信號通路參與人成骨細(xì)胞增殖分化過程，為Choukroun′s富血小板纖維蛋白的臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。