祛風壯骨顆粒濃縮工藝及質量評價研究 *

李昕沛 呂琴琴 劉建峰 劉軍鋒 段海潔 張紅 梁文 王吉利 黨秋萍

(1.西安市第五醫(yī)院，陜西 西安 710082；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003)

祛風壯骨顆粒具有補腎、強筋骨、止痛的功效，主要用于骨關節(jié)炎病、骨質增生、骨質疏松癥。祛風壯骨顆粒原劑型為糖漿劑，在臨床上應用取得了較滿意的療效，獲得了患者的好評，取得了較好的社會效益和經濟效益，是我院骨性關節(jié)炎臨床治療的重要制劑[1-2]。該方由熟地黃、鹿銜草、雞血藤、骨碎補、肉蓯蓉(炙)、淫羊藿(油炙)、萊菔子(炒)七味藥組成，其中淫羊藿的特征性成分為淫羊藿苷，現(xiàn)代藥理研究表明淫羊藿苷具有抗衰老、抗腫瘤、補腎壯陽等功效，能增加心腦血管血流量，促進造血功能、增強免疫功能及骨代謝[3]。本研究以淫羊藿苷含量為指標，考察祛風壯骨顆粒大生產中常用的濃縮和干燥方式對淫羊藿苷的影響，為大生產中的工藝優(yōu)化提供參考。對熟地黃、雞血藤、骨碎補、淫羊藿(油炙)、萊菔子(炒)進行薄層色譜鑒別，并采用HPLC法對淫羊藿苷進行含量測定，以有效控制本品的內在質量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；OSB-2100旋轉蒸發(fā)器(上海愛朗儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱(北京科偉永鑫實驗儀器設備廠)；ZKF040型真空干燥箱(上海實驗儀器廠有限公司)；Waters2695高效液相色譜儀(美國沃特斯，包括自動進樣器，四元泵，柱溫箱，2489紫外檢測器)；GB204電子天平(瑞士梅特勒托利多)；SHB-Ⅱ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；SB-3200D超聲清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；硅膠G薄層板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；硅膠G(青島海浪硅膠干燥劑廠，批號：111101)；硅膠GF254薄層板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；甲醇、乙腈(Fisher公司，色譜純)。

1.2試藥 淫羊藿苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110737-200413)；柚皮苷(中國藥品生物制品檢定所，批號：110722-200610)；熟地黃對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121196-201105)；雞血藤對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：1173-200001)；骨碎補對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：1169-200001)；萊菔子對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：120928-201007)；祛風壯骨顆粒(醫(yī)院制劑室自制，批號：1105211、1105212、1105213)。

2 濃縮工藝

2.1復方提取液的制備 按處方比例稱取熟地黃15 g，鹿銜草10 g，雞血藤10 g，骨碎補10 g，肉蓯蓉(炙)10 g，淫羊藿(油炙)10 g，萊菔子(炒)10 g，其中萊菔子用布包和其余六味，加水煎煮三次，第一次加8倍量水，煎煮2.5小時；第二、第三次加6倍量水，煎煮1.5小時，合并煎煮液，濾過，得復方提取液備用。

2.2淫羊藿苷含量測定方法[1]

2.2.1對照品溶液配制 精密稱取淫羊藿苷對照品1.38 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后即得。

2.2.2供試品溶液的制備 精密移取復方提取液2 mL，加60%乙醇稀釋并定容至10 mL棕色容量瓶中，搖勻，取上清液過濾即得。

2.2.3色譜條件及系統(tǒng)適應性實驗 色譜柱：SunFire C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動相乙腈-水溶液(30∶70)，等度洗脫7.5 min；流速1 mL·min-1；檢測波長270 nm；進樣量10 μL；柱溫20 ℃。

2.2.4線性范圍考察 分別精密吸取“2.2.1”項下制備好的對照品溶液1、3、5、7、9 μL，在“2.2.3”項下條件測定峰面積。以對照品質量濃度 (X)與峰面積 (Y)作標準曲線，得對照品淫羊藿苷的回歸方程為Y=2×106X+3002.4，r=0.999，在0.138～1.242μg范圍內峰面積與對照品質量濃度呈良好線性關系。

2.2.5精密度試驗 精密吸取對照品溶液1份，連續(xù)重復進樣6次，按“2.2.3”項下條件測定峰面積，結果淫羊藿苷峰面積的RSD為1.40%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 按“2.2.3”項下色譜條件測定峰面積，結果淫羊藿苷峰面積的RSD為1.71%，表明本品12 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復性試驗 取同一批處方量藥材6份，按照“2.2.2”項下方法制備，在“2.2.3”項下條件測定，結果淫羊藿苷峰面積的RSD為1.8%，表明本方法重復性好。

2.2.8加樣回收試驗 稱取處方量藥材6份，每份加淫羊藿苷適量，按“2.2.2”項下方法制備，再按“2.2.3”項下條件測定峰面積，計算回收率，淫羊藿苷的平均回收率為98.5%，RSD為1.06%。

2.3濃縮工藝的考察 將復方提取液平均分為3份，第一份不做處理，第二份置于旋轉蒸發(fā)儀中60℃(-0.07 MPa～-0.08 MPa)條件下濃縮到60 mL，第三份置于100℃水浴條件下濃縮到60 mL，備用。分別取提取液適量，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，得供試品溶液，測定淫羊藿苷的含量，并計算淫羊藿苷的轉移率(見表1)。

表1 濃縮條件考察結果表

常用的濃縮方法包括常壓濃縮和減壓濃縮，常壓濃縮由于操作時間較長，容易破壞成分，轉移率比減壓濃縮低，因此選用減壓濃縮。

2.4干燥工藝的考察 將上述減壓濃縮的稠膏，分成2份，第一份置于80 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥，第二份置于60 ℃真空干燥箱中干燥，備用。取稠膏適量用60%乙醇溶解后，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，得供試品溶液，測定淫羊藿苷的含量，并計算淫羊藿苷的轉移率(見表2)。

表2 干燥條件考察結果表

實驗表明，在60 ℃、-0.08 MPa～-0.09 MPa條件下干燥較佳。

3 質量評價

3.1鑒別

3.1.1熟地黃的薄層鑒別[1,4]取本品5 g，熟地黃對照藥材0.5 g和熟地黃陰性樣品5 g，加20 mL乙醇超聲提取30 min，濾液蒸干后加2 mL甲醇溶解，分別制成供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照溶液。參照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)作為展開劑，展開，取出，晾干后在紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材薄層色譜相應的位置顯相同顏色熒光斑點，陰性無干擾(見圖1)。

1,2,3-供試品溶液;4-熟地黃對照藥材溶液;5-熟地黃陰性對照溶液

3.1.2雞血藤的薄層鑒別[1,5]取本品5 g，雞血藤對照藥材0.5 g和雞血藤陰性樣品5 g，加水50 mL溶解后用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并萃取液，蒸干后加乙酸乙酯1 mL使溶解，制取供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照溶液。參照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(20∶1)為展開劑，展開，取出晾干，放入含濃氨水的展開缸中約3 min后取出，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材薄層色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾(見圖2)。

1,2,3-供試品溶液;4-雞血藤對照藥材溶液;5-雞血藤陰性對照溶液

3.1.3骨碎補的鑒別[1,6]取本品5 g，骨碎補對照藥材0.5 g和骨碎補陰性樣品5 g，加20 mL乙醇，70 ℃水浴溫浸30 min，濾液蒸干，殘渣加2 ml乙醇溶解，即得供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照溶液。另取柚皮苷對照品0.1 g，加2 mL甲醇溶解，作為對照品溶液；參照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以水飽和正丁醇溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品薄層色譜相應位置上，顯相同顏色熒光斑點，陰性無干擾(見圖3)。

1,2,3-供試品溶液;4-骨碎補對照藥材溶液;5-柚皮苷;6-骨碎補陰性對照溶液

3.1.4淫羊藿的鑒別[1,7-8]稱取取本品5 g，淫羊藿陰性樣品5 g，加50 mL水溶解后用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加1 mL乙酸乙酯溶解，制取供試品溶液、陰性對照溶液。另取淫羊藿苷對照品0.1 g，加2 mL甲醇溶解，即得對照品溶液。參照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(6.5∶3.5∶1) 10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品薄層色譜相應位置顯相同顏色熒光斑點，陰性無干擾(見圖4)。

3.1.5萊菔子的鑒別[1,9]取本品5 g，對照藥材0.5 g和陰性樣品5 g，加20 mL乙醇，70 ℃水浴溫浸30 min，濾液蒸干，殘渣加2 mL乙醇溶解，制取供試品溶液，對照藥材溶液和陰性對照溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(6.5∶3.5∶1) 10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出后晾干，置于有濃氨水的展開缸中約3 min后取出，在紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材薄層色譜相應位置顯相同顏色熒光斑點，陰性無干擾(見圖5)。

1,2,3-供試品溶液;4-淫羊藿苷對照品溶液;5-淫羊藿陰性對照溶液

1,2,3-供試品溶液;4-萊菔子對照藥材溶液;5-萊菔子陰性對照溶液

3.2含量測定

3.2.1對照品溶液配制 精密稱取淫羊藿苷1.38 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

3.2.2供試品溶液制備 取本品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇10 mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理40 min，放至室溫，再稱重，用60%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過即得。

3.2.3色譜條件及系統(tǒng)適應性實驗 色譜柱：SunFire C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；柱溫20 ℃；流動相乙腈-水溶液(30∶70)，等度洗脫7.5 min；流速1 mL·min-1；檢測波長270 nm；進樣量10 μL；對照品溶液和供試品溶液色譜圖如圖6所示。

圖6 對照品及樣品的高效液相色譜圖

3.2.4線性范圍考察 分別精密吸取對照品溶液1、3、5、7和9 μL，按“3.2.3”項下色譜條件進樣，測定峰面積。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得淫羊藿苷回歸方程Y=2×106X+3002.4，r=0.999，在0.138～1.242 μg范圍內峰面積與對照品質量濃度呈良好線性關系。

3.2.5精密度試驗 取對照品溶液1份，連續(xù)重復進樣6次，按“3.2.3”項下色譜條件測定峰面積，測得淫羊藿苷RSD為1.3%，表明該儀器精密度良好。

3.2.6穩(wěn)定性試驗 取“3.2.2”項下供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 進樣，按“3.2.3”項下色譜條件測定，結果淫羊藿苷峰面積的RSD為1.2%，表明供試品溶液12 h內穩(wěn)定性良好。

3.2.7重復性試驗 取同一批祛風壯骨顆粒6份，按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“3.2.3”項下色譜條件測定，結果淫羊藿苷峰面積的RSD為2.0%，表明該方法重復性良好。

3.2.8加樣回收試驗 稱取同一批祛風壯骨顆粒6份約0.50 g，精密稱定，每份加已知量的淫羊藿苷，按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液，參照“3.2.3”項下色譜條件分別測定峰面積，計算回收率，結果淫羊藿苷的平均回收率為98.1%，RSD為0.86%，結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果

3.2.9含量測定 稱取3批祛風壯骨顆粒適量，按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“3.2.3”項下方法測定峰面積，計算祛風壯骨顆粒中淫羊藿苷的含量(mg·g-1)，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果

由三批祛風壯骨顆粒含量測定結果可知，本品每批樣品含淫羊藿苷較為均勻，表明產品質量穩(wěn)定。

4 討論

從表1和表2可見，減壓濃縮、干燥時淫羊藿苷轉移率高于常壓濃縮、干燥，故采用減壓濃縮、干燥法進行復方的濃縮及干燥有利于防止活性成分的損失。常壓濃縮和常壓干燥下，淫羊藿苷的轉移率相對較低，可能是因為淫羊藿苷在溫度較高的環(huán)境中不穩(wěn)定造成的[10]，因此，為了確?；钚猿煞肿畲笙薅鹊谋槐Ａ?，建議在合適溫度條件下進行。

建立了5味中藥材熟地黃、雞血藤、骨碎補、淫羊藿(油炙)、萊菔子(炒)的TLC鑒別方法，該法簡便，重現(xiàn)性好。采用HPLC法測定了祛風壯骨顆粒中淫羊藿苷的含量，該法準確靈敏、快速簡便。本實驗建立的薄層鑒別和含量測定方法可用于祛風壯骨顆粒的質量控制[11-14]。