基于雙位點(diǎn)同步微透析技術(shù)的青藤堿微乳凝膠皮膚及血液藥代動(dòng)力學(xué)研究

丁楊,錢珊珊,郭健,桂雙英

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所,安徽 合肥 230012;3.現(xiàn)代藥物制劑安徽省教育廳工程技術(shù)研究中心,安徽 合肥 230012;4.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012;5.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230061)

青藤堿(Sinomenine)為中藥青風(fēng)藤的根莖中提取分離得到的一種生物堿單體,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等藥理活性[1-3],臨床上用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[4-5]。青藤堿口服給藥后存在生物利用度低、半衰期短、經(jīng)體循環(huán)后到達(dá)病變部位藥物含量少等缺點(diǎn)[6]。經(jīng)皮給藥系統(tǒng)避免了口服給藥可能發(fā)生的肝臟首過效應(yīng)和胃腸道降解失活,可以延長藥物在體內(nèi)的半衰期,增加局部藥物濃度,從而提高藥物生物利用度[7-8]。因此選用微乳凝膠作為青藤堿載體,并通過經(jīng)皮給藥方式給藥,有助于提高青藤堿在病灶局部的有效藥物濃度,發(fā)揮長效治療作用。采用精準(zhǔn)的技術(shù)方法監(jiān)測青藤堿微乳凝膠(Sinomenine microemulsion gel,SMG)給藥后的皮膚和血液中藥物濃度,對于探究和評價(jià)SMG的經(jīng)皮釋藥行為具有重要意義。

微透析(Microdialysis)是一種生物取樣技術(shù),指在麻醉或活動(dòng)狀態(tài)的動(dòng)物體內(nèi)植入探針,聯(lián)合運(yùn)用HPLC、HPLC-MS等技術(shù)手段,檢測灌流液中的藥物濃度,實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測藥物成分在機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化[9]。與傳統(tǒng)藥代動(dòng)力學(xué)研究方法相比,雙位點(diǎn)微透析技術(shù)不僅可以進(jìn)行皮膚和血液的同步取樣,還可以減少組織液取樣損失和操作誤差。此外,微透析在不影響動(dòng)物正常生理狀態(tài)下進(jìn)行在體、在線取樣,減少了動(dòng)物使用量,降低了動(dòng)物間個(gè)體差異所帶來的實(shí)驗(yàn)誤差[10-11]。因此,采用雙位點(diǎn)同步微透析技術(shù)能夠精準(zhǔn)、真實(shí)地檢測SMG經(jīng)皮給藥后皮膚和血液中的藥物濃度。

本研究首先建立了青藤堿微乳凝膠中青藤堿的UPLC含量測定方法,然后在大鼠腹部和頸部分別埋入線性探針和血液探針,采用雙位點(diǎn)同步微透析技術(shù)進(jìn)行SMG經(jīng)皮給藥后大鼠皮下和血液藥代動(dòng)力學(xué)研究,為青藤堿微乳凝膠的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC?H-Class超高液相系統(tǒng):包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、TUV可變波長紫外檢測器和Empower色譜工作站(美國Waters公司);微透析系統(tǒng):包括灌注器推進(jìn)泵(CMA400 Syringe pump),灌注器(CMA 2.5 mL Exmire Microsyringe Ms-gan250),收集器(CMA470 Refrigerated fraction collector);線性微透析探針(CMA30,透析膜長度10 mm,膜直徑0.24 mm,截留相對分子質(zhì)量6 000 Da);血液微透析探針(MAB7,透析膜長度10 mm,膜直徑0.6 mm,截留相對分子質(zhì)量1 500 Da);85-2A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠);AG285電子天平(德國Sartorious);SevenMulti型pH測試儀[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試藥

青藤堿對照品(中國藥品生物制品鑒定所,批號:110774-200507);青藤堿原料藥(純度≥98%,成都曼斯特生物科技有限公司，批號:12101704);油酸(化學(xué)純,天津光夏精細(xì)化工研究所);吐溫-20(化學(xué)純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);無水乙醇(分析純,南京化學(xué)試劑一廠);薄荷醇(廣州化工廠);林格氏液(Ringer's液:144 mmol·L-1Na+,1.5 mmol·L-1Ca2+,4.0 mmol·L-1K+,2.3 mmol·L-1Mg2+,用前過0.22 μm膜);三乙胺(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);磷酸二氫鈉(上海中試化工總公司);三乙醇胺(化學(xué)純,上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司);肝素鈉注射液(天津生物化學(xué)制藥有限公司);戊巴比妥鈉(上海麥克林生化科技有限公司);水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD雄性大鼠,體質(zhì)量240～270 g,安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號:SYXK(皖)2012002。動(dòng)物飼養(yǎng)條件:溫度25 ℃左右,自由飲食飲水,動(dòng)物室保持自然光暗周期。實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，倫理批號：1107261911002543。

2 方法與結(jié)果

2.1 青藤堿微乳凝膠的制備

青藤堿微乳凝膠的處方組成為:4%青藤堿，2%油酸,16.7%吐溫-20,33.3%乙醇,3%薄荷醇,2%卡波姆,39%水。制備工藝如下:按處方的量將乳化劑吐溫-20和助乳化劑乙醇均勻混合,在25 ℃恒溫磁力攪拌器下將油酸和薄荷醇混勻,用滴管將吐溫-20和乙醇的混合物緩慢滴加到油酸中,滴加過程不停攪拌,直至得到澄清透明的空白微乳。在空白微乳中加入處方量的青藤堿,再加24%的水,不斷攪拌得無色透明青藤堿微乳液。再稱取處方量的卡波姆,加15%水,靜置24 h使其溶脹完全，得卡波姆液。將制備的青藤堿微乳緩慢加入溶脹完全的卡波姆液,用適量的三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至6.0～6.5,攪拌均勻,即得4%的青藤堿微乳凝膠。

2.2 經(jīng)皮藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉(40∶60,v/v),添加0.1%三乙胺調(diào)pH為7;檢測波長:263 nm;流速:0.2 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:2 μL。

2.2.2 樣品的處理 微透析實(shí)驗(yàn)全過程使用的溶液均過0.22 μm濾膜,經(jīng)過透析膜所得的透析液干凈、無高分子蛋白,故不對微透析樣品進(jìn)行任何預(yù)處理,直接進(jìn)行UPLC定量分析。

2.2.3 專屬性考察 按上述建立的色譜條件,分別將對照品溶液、空白透析液、樣品透析液進(jìn)樣。結(jié)果表明空白透析液在青藤堿出峰位置無吸收峰出現(xiàn),透析液中雜質(zhì)峰與青藤堿得到良好分離,可見在該色譜條件下的分析方法具有良好的專屬性,分析方法可行。相關(guān)圖譜見圖1。

圖1 專屬性考察的UPLC色譜圖

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取青藤堿對照品適量,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容得質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4、8、10、20 μg·mL-1的系列溶液,按照上述色譜條件進(jìn)樣測定,以青藤堿峰面積(Y)對進(jìn)樣濃度(X)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:Y=9 390X-13 254(r=0.999 0),表明青藤堿質(zhì)量濃度在0.5～20 μg·mL-1之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度 取高(20 μg·mL-1)、中(4 μg·mL-1)、低(0.5 μg·mL-1)3個(gè)質(zhì)量濃度的青藤堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,結(jié)果青藤堿峰面積RSD分別為1.2%、1.05%、0.92%,表明儀器精密度良好。

2.2.6 探針回收率的測定 當(dāng)青藤堿微乳凝膠微透析藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后,用肝素鈉溶液浸泡探針,擦去探針透析膜表面吸附的雜質(zhì),用純水充分沖洗2 h。清洗完成后將微透析探針分別浸沒在2個(gè)空白Ringer's溶液的100 mL燒杯中,用保鮮膜覆蓋,磁力攪拌轉(zhuǎn)速為200 r·min-1,溫度維持在37 ℃。以質(zhì)量濃度為75 μg·mL-1(Cin)青藤堿溶液為灌流液,灌流速度為2 μg·mL-1,平衡1 h開始采集樣品,采集量為40 μL,采集4份透析液樣品。Cout為透析液中青藤堿的濃度。通過減量法公式計(jì)算青藤堿探針的回收率R=(Cin-Cout)/Cin×100%。得線性探針回收率為(23.58±0.16)%,血液探針的回收率為(28.80±0.74)%。

2.2.7 皮膚和血液同步微透析

2.2.7.1 探針預(yù)處理與植入 由于藥代動(dòng)力學(xué)取樣時(shí)間的原因,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)前將探針的透析膜浸泡于肝素鈉注射液中,以2 μL·min-1的灌流速度灌流Ringer's溶液30 min,使探針透析膜內(nèi)外充分飽和肝素鈉注射液,防止在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)凝血現(xiàn)象。

皮下探針植入:SD大鼠實(shí)驗(yàn)前一晚用動(dòng)物剃毛器將大鼠腹部毛發(fā)剃除干凈。禁食12 h,正常飲水。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)麻醉,將大鼠腹部朝上固定于鼠板上。用標(biāo)記筆在皮膚上標(biāo)注植入點(diǎn)和出點(diǎn)部位(植入點(diǎn)和出點(diǎn)之間的距離至少長于透析膜的長度4 mm以上)。將線性探針引導(dǎo)針從標(biāo)記的植入點(diǎn)插入,使其在皮下穿過探針的植入點(diǎn)和出點(diǎn)。再將線性探針?biāo)腿脶樄苤?將探針從針頭尾端慢慢拉出,一直拉到透析膜靠近引導(dǎo)針頭的斜面端(注意不要將透析膜拉進(jìn)針頭,避免損壞透析膜)。緩慢將引導(dǎo)針往外拉,探針膜隨著引導(dǎo)針的拉動(dòng)慢慢進(jìn)入目的部位。當(dāng)針頭全部抽出后,調(diào)整探針位置,使透析膜位于植入點(diǎn)和出點(diǎn)的中間部位,則皮下探針植入完成。整個(gè)操作過程結(jié)束后以2 μL·min-1流速灌流空白Ringer's溶液保持探針膜處于濕潤狀態(tài),持續(xù)灌流1 h。

血液探針植入:SD大鼠實(shí)驗(yàn)前一天,禁食12 h,正常飲水。將大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)麻醉,用細(xì)繩將大鼠四肢和頭部仰位固定于鼠板上。在大鼠頸部右側(cè)剪去毛發(fā),露出潔凈皮膚。剪開一小口,用鈍性手術(shù)鉗將大鼠的右頸靜脈分離出來,手術(shù)線結(jié)扎遠(yuǎn)心端,將鑷子墊在頸靜脈血管下,眼科剪在頸靜脈上剪一小口,用自制的引導(dǎo)管輕輕插入切口處,然后將血液探針小心地插入引導(dǎo)管中,朝心室方向插入,慢慢抽出引導(dǎo)管。用手術(shù)線將探針與頸靜脈綁定好,探針植入完成。整個(gè)操作過程結(jié)束后以2 μL·min-1流速灌流空白Ringer's溶液保持探針透析膜處于濕潤狀態(tài),持續(xù)灌流1 h。

探針植入完成后以2 μL·min-1流速灌流空白Ringer's溶液,持續(xù)灌流1 h,以緩解探針植入導(dǎo)致的局部微創(chuàng)狀態(tài)。

2.2.7.2 給藥與采樣 機(jī)體平衡1 h后,收集皮膚和血管部位的空白透析液各2份,每份40 μL。將4%青藤堿微乳凝膠均勻涂抹在面積為2.0 cm×1.0 cm裸露大鼠腹部皮膚上,劑量為60 mg·kg-1,用保鮮膜包住,膠帶固定,如圖2所示。經(jīng)皮給藥后同時(shí)采用皮膚微透析和血液微透析技術(shù)采集樣品,每隔20 min采集1份透析液,采集量為每次40 μL,持續(xù)采集時(shí)間為10 h。將透析液樣品放于冰箱中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 探針植入圖

將樣品于-20 ℃冰箱中取出,置于室溫解凍,按2.1.1項(xiàng)方法進(jìn)行檢測,根據(jù)皮下探針和血液探針各自對應(yīng)的回收率值(R)對各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的藥物質(zhì)量濃度(C測得)進(jìn)行校正,按照以下公式求得各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)際藥物質(zhì)量濃度(C實(shí)際)。

C實(shí)際=C測得/R

采用3P97藥代動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,大鼠腹部涂抹SMG后,皮膚組織、血液中青藤堿濃度-時(shí)間曲線見圖3。各主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示。

圖3 大鼠皮膚和血液青藤堿濃度-時(shí)間曲線

表1 青藤堿皮膚和血液主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

測得數(shù)據(jù)分析可得青藤堿在皮膚和血液中的Cmax分別為(10.91±3.05)(6.74±1.91)μg·mL-1;Tmax分別為(180.00±39.80)(239.98±40.85)min;AUC0→t分別為(736.51±45.30)(426.43±30.18)μg·min·mL-1。從圖3可以看出,大鼠腹部給予青藤堿微乳凝膠后,由于微乳凝膠的促透作用,青藤堿經(jīng)皮給藥后吸收平穩(wěn)迅速,皮膚中青藤堿的質(zhì)量濃度在給藥后3 h左右達(dá)到最大值,而血液中藥物濃度在4 h左右達(dá)到峰值。

3 討論

經(jīng)皮給藥的藥物透過皮膚吸收進(jìn)入體循環(huán)有2條途徑,其中透過角質(zhì)層和表皮進(jìn)入真皮,被毛細(xì)血管吸收進(jìn)入體循環(huán),是藥物透皮吸收的主要途徑[12]。在以往的藥代動(dòng)力學(xué)研究中,藥物的濃度-時(shí)間曲線常常通過在不同時(shí)間點(diǎn)處死數(shù)只動(dòng)物來獲得。這種方法得到的樣品在進(jìn)行含量測定之前要經(jīng)過一系列樣品前處理,使得藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)比較間接、粗糙,結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性不高,不能完全反映藥物在體內(nèi)的變化過程[13]。本文應(yīng)用微透析取樣技術(shù),通過皮膚、血液雙位點(diǎn)同步進(jìn)行微透析取樣,獲得青藤堿在大鼠皮膚、血液組織中隨時(shí)間變化的藥物濃度動(dòng)態(tài)變化過程。采樣時(shí)間充足,一只動(dòng)物可以獲得完整的體內(nèi)濃度-時(shí)間過程曲線。這與傳統(tǒng)研究方法相比,不但減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)目，而且增加了時(shí)間分辨性,使藥代動(dòng)力學(xué)信息更準(zhǔn)確[14-15]。

從圖3可見,青藤堿微乳凝膠經(jīng)皮給藥后,在皮膚中形成較高的濃度梯度,皮膚和血液兩者之間的濃度差異性明顯,可能是由于微乳具有高滲透性,可以在皮膚角質(zhì)層形成藥物儲庫[16]。Hu等[17]將3,5,4′-三甲氧基反式二苯乙烯(BTM)為外用載體的微乳凝膠(MBH)制劑用于治療骨關(guān)節(jié)炎,結(jié)果發(fā)現(xiàn)外用BTM-MBH顯示出良好的抗骨關(guān)節(jié)炎作用,并降低了促炎細(xì)胞因子的水平。Mehanna等[18]制備了負(fù)載雙氯芬酸鈉的微乳凝膠,發(fā)現(xiàn)其可以使皮膚滲透性提高,延長藥物釋放時(shí)間且治療效果顯著。因此微乳凝膠制劑可以有效地提高藥物療效,而青藤堿在臨床上主要用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性疾病,將青藤堿制備成微乳凝膠經(jīng)皮給藥后,可以在給藥部位形成藥物儲庫,使藥物緩慢持續(xù)釋放,從而有助于局部藥效發(fā)揮。

除此之外,血液中達(dá)到最大藥物濃度的時(shí)間較皮膚滯后近60 min。分析可能原因有:①經(jīng)皮給藥的藥物要經(jīng)過皮膚吸收進(jìn)入真皮,由毛細(xì)血管吸收,再經(jīng)過全身的血液循環(huán)才會(huì)到達(dá)頸靜脈。這需要一段時(shí)間,皮膚較血液容易濃度富集,較早達(dá)到最大藥物濃度。②大鼠四肢一直處于捆綁狀態(tài),導(dǎo)致動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)初步的腫脹發(fā)紫,影響血液循環(huán)的速度,延長了藥物運(yùn)輸?shù)窖禾结樀臅r(shí)間。

通過微透析取樣技術(shù)直接從大鼠皮膚和血液中采集青藤堿樣品,并繪出藥物濃度-時(shí)間曲線,比較皮膚和血液中藥物濃度的變化,與傳統(tǒng)藥代動(dòng)力學(xué)方法相比,可以更好地評價(jià)外用制劑的經(jīng)皮吸收動(dòng)力學(xué)和生物等效性。