克班寧貼劑在大鼠體內(nèi)的藥動學與藥效學評價

崔利利,李婧瑜,徐鶴,楊子賢,馬云淑,4,5

(1.云南中醫(yī)藥大學中藥學院,云南 昆明 650500;2.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;3.云南省疾病預防控制中心,云南 昆明 650000;4.云南省傣彝學重點實驗室,云南 昆明 650500;5.云南省南藥可持續(xù)利用重點實驗室,云南 昆明 650500)

克班寧(Crebanine,Cre)提取自防己科千金藤屬植物云南地不容StephaniayunnanensisLo塊根中[1],屬于異喹啉類阿樸菲型生物堿。阿樸菲型生物堿對離子通道、神經(jīng)系統(tǒng)、腎上腺受體等有一定的生物活性[2],其中離子通道作用主要表現(xiàn)為對Na2+通道、K+通道、Ca2+通道的阻滯。馬云淑等[3-7]對克班寧的抗心律失常作用做過深入研究,結(jié)果表明克班寧具有顯著的抗心律失常作用,具有較好的開發(fā)研究前景。目前研究表明，克班寧靜注抗心律失常治療指數(shù)小,安全范圍窄,劑量不當易導致中毒或死亡,且經(jīng)靜注或灌胃給藥的克班寧抗心律失常雖起效快,但持續(xù)時間短且作用不穩(wěn)定。

因此本研究將克班寧制備成透皮貼劑,以延長作用時間,降低毒副作用。通過對比克班寧經(jīng)透皮和灌胃2種不同給藥方式的藥動學參數(shù),比較經(jīng)皮和胃腸道吸收的差別。建立氯化鋇(BaCl2)致大鼠心律失常模型,考察克班寧貼劑抗心律失常的作用,在分子水平上探究克班寧抗心律失常的機制,為滿足臨床多途徑給藥及藥物增效減毒提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent，1260);生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰萌科技有限公司,BL-420E);氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司,HSC-12A);微量紫外分光光度計(Eppendorf，D30)；數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon，1550B)；信號放大器(Axon，200B)；電極拋光儀(Narishige，MF-830)；水平程控電極拉制儀(SUTTER Instrument，P97)；玻璃電極(World Precision Instrument，P97)。

1.2 試藥

克班寧(實驗室自制,含量96.17%);克班寧標準品[8]:實驗室自制(純度98%);丁香(Flos Caryophyllii)購于昆明市螺螄灣中藥材專業(yè)市場,經(jīng)鑒定為桃金娘科番櫻桃屬植物丁香EugeniacaryophyllataThunb.的干燥花蕾,按照2020版《中國藥典》揮發(fā)油測定法提取丁香揮發(fā)油,收率為9.63%,經(jīng)GC-MS檢測,主要含丁香酚(66.10%)、β-石竹烯(25.02%)、乙?；∠惴?4.17%);鹽酸維拉帕米(中國食品藥品檢定研究院,批號：100223-200102)；甲醇(色譜純,MERCK);乙酸乙酯(分析純,天津市大茂化學試劑廠,批號：20150513)。

1.3 實驗動物

SD大鼠,SPF級,體質(zhì)量250～300 g,雌雄各半,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(湘)2013-0004,倫理號:No.R-062016002。

2 方法

2.1 克班寧貼劑的制備[9]

精密稱取處方量Eudragit EPO(0.625 g)、鄰苯二甲酸二乙酯(0.187 5 g)、丁二酸(0.031 25 g)、甘油(0.125 g)于燒杯中,加入克班寧(0.125 g),加入適量70%乙醇攪拌使完全溶解,而后分別加入基質(zhì)比1%的氮酮、基質(zhì)比3%的丁香揮發(fā)油制備含不同促滲劑的貼劑。將上述溶液均勻涂布于30 cm2的模具,45 ℃烘箱干燥1 h,取出,冷卻至室溫,覆合保護膜,即得克班寧貼劑。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取15 mg克班寧對照品于10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度線,得到1.5 mg·mL-1的克班寧對照品溶液,進一步稀釋為0.033、0.833、1.667、3.333、6.667、16.667 μg·mL-1系列的克班寧對照品溶液,-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 內(nèi)標溶液的配制 精密稱取維拉帕米10 mg至10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,進一步稀釋得到100 μg·mL-1維拉帕米內(nèi)標液,-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 克班寧溶液配制 稱取克班寧對照品100 mg于10 mL容量瓶中,加入1%檸檬酸水溶液適量超聲溶解,用飽和NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至6～7,再用生理鹽水定容至刻度,即得10 mg·mL-1的克班寧溶液。

2.3 血漿樣品的處理方法

精密吸取大鼠血漿樣品200 μL,加入100 μg·mg-1維拉帕米甲醇溶液20 μL,加入1 200 μL乙酸乙酯,渦旋振蕩3 min,4 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液于50 ℃水浴上氮氣流吹干,加入150 μL甲醇渦旋3 min復溶,經(jīng)0.22 μm微孔過濾器過濾,HPLC進樣分析。記錄色譜圖與峰面積。

2.4 方法學考察

2.4.1 色譜條件 Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)。色譜柱:Agilent ZORBAX Extend-C18(5 μm,4.6 nm×250 nm);流動相:甲醇-0.01%三乙胺(75∶25);流速:1 mL·min-1;檢測波長:280 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:25 μL。

2.4.2 專屬性考察 空白血漿，空白血漿中加入內(nèi)標和克班寧溶液(由180 μL空白血漿、20 μL內(nèi)標、20 μL克班寧甲醇溶液組成)以及克班寧貼劑給藥2 h后的血漿樣品分別按照“2.3”項處理方法(空白血漿內(nèi)標溶液以同體積甲醇替代)處理進樣,記錄色譜圖。分離度大于1.5,拖尾因子皆在0.95～1.05,理論塔板數(shù)大于4 000,克班寧與內(nèi)標分離度好,均大于1.5,且內(nèi)源性物質(zhì)無干擾。結(jié)果見圖1。

注：A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標+克班寧溶液;C.克班寧貼劑給藥；1.維拉帕米;2.克班寧

2.4.3 標準曲線 精密吸取200 μL大鼠空白血漿,分別加入25 μL克班寧對照品溶液和20 μL內(nèi)標溶液,按照“2.3”項處理方法處理進樣。以克班寧和維拉帕米峰面積比值作為縱坐標(Y),克班寧濃度(X)作為橫坐標進行線性回歸。得標準曲線為:Y=0.543 5X-0.102 1(R2=0.999 3)。結(jié)果表明:克班寧血漿溶液在0.033～16.667 μg·mL-1之間線性關(guān)系較好。

2.4.4 精密度 于1 d內(nèi)3個不同時間精密吸取空白血漿200 μL,加入高(100 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)劑量克班寧甲醇溶液25 μL,n=3。按照“2.3”項處理方法處理進樣,計算日內(nèi)精密度RSD分別為6.54%、7.53%、12.93%。連續(xù)3 d內(nèi)測定并處理進樣,計算日間精密度RSD分別為5.57%、8.96%、10.44%。

2.4.5 回收率 精密量取空白血漿200 μL,分別加入配制的高(100 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)劑量克班寧甲醇溶液25 μL,n=3。按照“2.3”項處理方法處理進樣,計算平均方法回收率,分別為(91.85±0.027)%、(96.90±0.016)%、(99.99±0.097)%,RSD分別為3.20%、2.34%、10.64%。計算平均回收率,分別為(105.75±0.038)%、(96.19±0.046)%、(98.50±0.160)%,RSD分別為3.39%、4.04%、11.11%。

2.4.6 穩(wěn)定性 精密量取空白血漿200 μL,室溫放置12 h,加入高(100 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)劑量克班寧甲醇溶液25 μL各3份,按照“2.3”項處理方法處理進樣,計算室溫放置12 h穩(wěn)定性RSD分別為5.13%、4.89%、3.56%。另取上述高、中、低劑量克班寧甲醇溶液的血漿樣品各3份,于-20 ℃保存72 h后取出,按照“2.3”方法處理進樣,計算-20 ℃凍融穩(wěn)定性RSD分別為4.94%、4.22%、2.42%。

2.5 克班寧貼劑給藥

取大鼠18只,體質(zhì)量250～300 g,雌雄各半,禁食24 h,不禁水。分別在給藥前一天脫去大鼠腹部毛,脫毛面積30 cm2,洗凈、飼養(yǎng)、待用。給藥劑量400 mg·kg-1。隨機分成克班寧貼劑陰性組(不含促滲劑的克班寧貼劑)、陽性組(含1%氮酮的克班寧貼劑)、實驗組(含3%丁香揮發(fā)油的克班寧貼劑)。給藥時貼劑黏貼于大鼠脫毛皮膚上,并用醫(yī)用膠帶固定。各組在給藥后0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、30、36、48、60、72 h眼后叢靜脈采血于肝素鈉抗凝管中,離心后取上層血漿。

2.6 克班寧灌胃給藥

取大鼠6只,雌雄各半,禁食24 h,不禁水。給藥劑量為40 mg·kg-1?？税鄬幑辔附o藥后分別在0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h眼后叢靜脈采血于肝素鈉抗凝管中,離心后取上層血漿。

2.7 克班寧貼劑對BaCl2誘發(fā)大鼠心律失常模型的藥效學研究

SD大鼠60只,雌雄各半，于實驗前一天將大鼠腹部毛去除干凈(30 cm2),禁食不禁水待用，分別為空白對照組(給予不含克班寧的空白基質(zhì)貼劑)、陽性組(30 mg·kg-1維拉帕米灌胃)、陰性組(腹部脫毛后醫(yī)用膠帶給予束縛處理)、克班寧低劑量組(79 mg·kg-1)、克班寧中劑量組(158 mg·kg-1)、克班寧高劑量組(316 mg·kg-1)。陽性對照組給藥30 min后、其他各組給藥10 h后,麻醉并仰臥固定于鼠板上,連接BL-420E生物機能實驗系統(tǒng),穩(wěn)定5 min后記錄正常Ⅱ?qū)?lián)心電圖,2 min后舌下靜脈注射0.4%BaCl24 mg·kg-1,觀察記錄心律失常心電圖和恢復的心電圖。

2.8 膜片鉗Whole Cell記錄方法

選擇T-type和L-type兩種鈣通道,利用Patch Clamp技術(shù),Whole Cell記錄檢測克班寧對這些通道電流的影響。選取邊緣清晰、形態(tài)飽滿、細胞膜平滑的細胞,控制微電極操作儀使玻璃電極輕觸到所選細胞的細胞膜,給予負壓抽吸,當封接電阻Rt值達到GΩ封接時,補償快慢電容。破膜成功后將加藥管中空氣排出,使加藥管滴速保持在1～2滴·s-1,在顯微鏡下動作輕且慢地將加藥管尖端放入胞外液中并懸至待測細胞上方。打開刺激程序,開始記錄。

2.9 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 克班寧貼劑及灌胃給藥的藥動學結(jié)果

克班寧貼劑給藥在大鼠體內(nèi)消除慢,具有緩釋作用。在克班寧貼劑陰性組(克班寧貼劑)、陽性組(含1%氮酮的克班寧貼劑)、實驗組(含3%丁香揮發(fā)油的克班寧貼劑)中，克班寧貼劑實驗組的克班寧吸收程度最大,在大鼠體內(nèi)的停留時間最長，給藥后迅速進入大鼠體內(nèi),消除慢,且血藥濃度較高。與經(jīng)皮給藥比較,克班寧灌胃給藥在大鼠體內(nèi)血藥濃度變化符合一室模型,達峰時間顯著縮短,達峰濃度顯著提高,但血藥濃度下降快,維持時間短,結(jié)果見圖2～3、表1。

圖2 克班寧貼劑給藥血藥濃度-時間曲線

圖3 克班寧灌胃給藥血藥濃度-時間曲線

表1 克班寧經(jīng)皮、灌胃給藥在大鼠體內(nèi)的房室模型參數(shù)

3.2 克班寧透皮給藥與灌胃給藥對BaCl2致大鼠心律失常的影響

與陰性組比較,克班寧低、中、高劑量組恢復竇性心律所需的時間縮短(P<0.01)，給藥后10 min內(nèi)恢復竇性心律的鼠數(shù)增多(P<0.01，P<0.001),給藥后20 min內(nèi)恢復竇性心律的鼠數(shù)明顯增多(P<0.001)，恢復竇性心律后維持時間大于20 min的鼠數(shù)也顯著增多P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 克班寧貼劑經(jīng)皮與灌胃給藥對BaCl2致大鼠心律失常的影響

3.3 克班寧對心肌鈣通道的作用

結(jié)果顯示,30 μmol·L-1克班寧對T型鈣通道和L型鈣通道均有抑制作用,且這種抑制作用有劑量依賴性。對L-type鈣通道：3 μmol·L-1克班寧的抑制率為26%，10 μmol·L-1的抑制率為31%，30 μmol·L-1的抑制率為46%，100 μmol·L-1的抑制率為96%，300 μmol·L-1的抑制率為100%,通過Hill方程擬合出其IC50為46.62 μmol·L-1。對T-type鈣通道：3 μmol·L-1克班寧的抑制率為11%，10 μmol·L-1的抑制率為16%，30 μmol·L-1的抑制率為31%，50 μmol·L-1的抑制率為39%，100 μmol·L-1的抑制率為69%，300 μmol·L-1的抑制率為89%,通過Hill方程擬合出其IC50為72.70 μmol·L-1,結(jié)果見圖4～5。

圖4 30 μmol·L-1克班寧對L-type、T-type Ca2+通道的抑制作用

圖5 克班寧對L-type、T-type Ca2+通道的劑量效應關(guān)系

4 討論

克班寧灌胃給藥在大鼠體內(nèi)血藥濃度變化符合一室模型,在胃腸道中吸收快,可以迅速進入體內(nèi),但藥效結(jié)果表明灌胃給藥作用時間不夠持久,易反復。汪紅梅等[7]提出克班寧灌胃可對抗BaCl2致大鼠實驗性心律失常。從本研究藥動學結(jié)果可知,克班寧貼劑可長時間持續(xù)緩慢釋放藥物,相對灌胃組可減少給藥次數(shù),延長給藥時間?？税鄬幑辔附o藥的Cmax=(8.991±2.343)mg·L-1,克班寧貼劑實驗組Cmax=(1.968±0.147)mg·L-1；且藥效學實驗結(jié)果提示，克班寧貼劑雖起效時間有延遲,但恢復竇性心律后大部分大鼠均不再出現(xiàn)心律失常反復?？税鄬庂N劑實驗組AUC0-∞、Cmax明顯高于克班寧貼劑陰性組和陽性組,提示含有3%丁香揮發(fā)油的克班寧貼劑實驗組有較好的促滲作用,在體內(nèi)的吸收程度大,生物利用度高。綜上所述可知,與灌胃給藥相比,克班寧貼劑給藥在較低血藥濃度下就可發(fā)揮抗心律失常作用,且能長時間保持一定血藥濃度水平,延長作用時間,達到了減毒增效預期目標。

在本實驗中,貼劑藥動學與藥效學給予的劑量不一致,是由于貼劑經(jīng)皮給藥劑量低,進入血液含量較低,采用HPLC檢測不到藥物,故采用400 mg·kg-1給藥進行藥動學研究;而在藥效學實驗過程中,通過預實驗發(fā)現(xiàn)給予較低劑量即可發(fā)揮抗心律失常作用?？税鄬巵碓从趯嶒炇易蕴?提取過程中需要大量的試劑及原藥材,出于節(jié)約資源等方面考慮,在藥效研究中選取低(79 mg·kg-1)、中(158 mg·kg-1)、高(316 mg·kg-1)三個給藥劑量。

據(jù)前期實驗研究結(jié)果,克班寧的靜脈注射半數(shù)致死量(LD50)是9.382 mg·kg-1,鹽酸克班寧氰基丙烯酸正丁酯微粒LD50是9.984 mg·kg-1,鹽酸克班寧PLGA納米粒LD50是13.619 mg·kg-1，鹽酸克班寧PELGE納米粒LD50是14.839 mg·kg-1,克班寧脂質(zhì)體LD50是16.085 mg·kg-1。而本研究中克班寧經(jīng)皮貼劑吸收穩(wěn)定且血藥濃度峰谷波動小,經(jīng)預實驗發(fā)現(xiàn)在較大載藥量與給藥面積(400 mg·kg-1)下也未觀察到大鼠中毒跡象,其呼吸、飲食、二便、日?；顒?、精神狀態(tài)均表現(xiàn)正常,無一例死亡,故未能求出經(jīng)皮給藥LD50。顯示了克班寧貼劑經(jīng)皮給藥安全高,毒性不明顯。

心律失常是一種常見病、多發(fā)病,分為快速性心律失常和緩慢性心律失常。臨床上治療快速性心律失常最有效的方法是導管消融。安裝起搏器仍是治療緩慢性心律失常唯一有效的治療措施,但這種治療措施會對身體造成創(chuàng)傷且費用昂貴,不能廣泛使用。藥物治療還是患者首選的治療方案[10]。然而當前臨床上用于治療心律失常的藥物仍是舊品種,常具有不良反應[11-12]。劉景文等[13]提出胺碘酮和異丙腎上腺素聯(lián)用抗心律失常療效確切,有效率可達81.25%,但對緩慢性心律失常的治療效果不好。因此,開發(fā)治療效果好、副作用少的抗心律失常藥物是非常必要的。結(jié)合課題組前期研究可知,克班寧對KCNQ1/KCNE1、Kv1.5、T-type、L-type、Nav1.5這5個通道都有比較明顯的抑制作用,屬于多靶點抑制劑,對N型鈣離子通道和P/Q型離子通道沒有作用,這2種通道主要分布于神經(jīng)而不存在于心臟中。同樣值得關(guān)注的是克班寧對TRP通道的作用,克班寧能夠激活TRPA1通道而抑制TRPM8通道。初步探究的結(jié)果證實克班寧符合新Ⅲ類抗心律失常藥物的特點,且制備為經(jīng)皮給藥后,對大鼠心律失常有明顯抑制作用,毒副作用顯著降低、安全性高,具有較好的開發(fā)研究前景。