天麻素全載藥可溶性微針的制備及體外經(jīng)皮滲透性研究

王舒慧,楊明,朱衛(wèi)豐,陳麗華,李哲,吳文婷,管詠梅

(江西中醫(yī)藥大學(xué)/現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330004)

天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖,含苷類、酚類、甾醇、有機(jī)酸及糖類等多種成分,天麻素是天麻的主要活性成分[1]。天麻素藥理作用廣泛,不良反應(yīng)小,在預(yù)防和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病中發(fā)揮著積極作用。目前,天麻素臨床上主要給藥方式為口服和注射給藥。口服后由于其首過效應(yīng)明顯,生物利用度較低,且有胃腸道不良反應(yīng);注射劑由于直接注射入血液中,毒副作用較大且患者耐受性差[2-5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的特點(diǎn)是患者精神壓力較大,且一般病程較長,往往需要多次給藥[6]。將天麻素開發(fā)成經(jīng)皮制劑則更加安全有效,能夠?qū)⑵溲帩舛确€(wěn)定在治療窗,避免了肝首過效應(yīng),減少胃腸道副反應(yīng),提高生物利用度;具有一定緩釋作用,能夠減少給藥次數(shù),提高患者順應(yīng)性[7-9]。

微針是指多個(gè)長度小于1 mm的細(xì)小針尖以陣列方式連接在基座上組成的貼片[10]。微針作為一種新型經(jīng)皮遞藥技術(shù),能突破皮膚角質(zhì)層的屏障作用,提供一種將藥物輸送到皮膚的微創(chuàng)途徑,可以使親水性小分子藥物、生物大分子藥物以及疫苗等原本不適合于經(jīng)皮給藥的藥物通過皮膚吸收[11-12]。其中可溶性微針因其載藥量高、生物相容性好、制備簡單等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[13-14]。相比于僅針尖或背襯載藥可溶性微針,全載藥可溶性微針可實(shí)現(xiàn)針尖和背襯全方位載藥,提高藥物的載藥量和皮膚透過量,實(shí)現(xiàn)藥物透皮遞送[15]。因此,本研究進(jìn)行天麻素全載藥可溶性微針制備工藝研究,以實(shí)現(xiàn)天麻素經(jīng)皮給藥的目的,為天麻素和此類水溶性小分子藥物經(jīng)皮給藥提供借鑒。

1 材料

微針模具(臺(tái)州微芯醫(yī)藥科技有限公司);BS124S電子分析天平(德國Sartorius公司);TGL-20MC臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘鑫儀器儀表有限公司);KQ3200E超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司);EPED-ESL-10TH實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司),Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司);QUANTA 250掃描電子顯微鏡(美國FEI公司);TA.newplus物性分析儀(美國ISENSO公司)；GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

天麻素對(duì)照品(批號(hào):JOT-10053,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.47%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司);聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30,批號(hào):JO629A,大連美侖生物技術(shù)有限公司);透明質(zhì)酸(HA,批號(hào):C12295411,上海麥克林生化科技有限公司);氯化鈉注射液(批號(hào):2009220721,辰欣藥業(yè)股份有限公司);乙腈(色譜級(jí),批號(hào):DW194121201,湖北弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司);超純水[電阻率:18.2 MΩ·cm(25 ℃),南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司];臺(tái)盼藍(lán)(批號(hào):1019JO53，北京索萊寶科技有限公司)。

SPF級(jí)健康SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)：SCXK(贛)2019-0004。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定,均符合3R原則，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批號(hào)：JZLLSC20220534。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱為ACE Excel C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(5∶95),柱溫25 ℃;檢測(cè)波長為280 nm;體積流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取天麻素對(duì)照品25 mg,加入超純水溶解,定容至25 mL,得1 mg·mL-1天麻素對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 將制得的可溶性微針,分別加15 mL超純水使其完全溶解,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.1.4 專屬性檢驗(yàn) 將對(duì)照品、空白可溶性微針及全載藥可溶性天麻素微針制得的溶液進(jìn)樣分析,記錄色譜圖(圖1)。

圖1 空白可溶性微針(A)、天麻素對(duì)照品(B)、全載藥天麻素可溶性微針(C)HPLC圖

2.1.5 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液,用超純水稀釋成4、25、50、100、250、400、500 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液,在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為Y=17.909X-5.347 2,r=0.999 9,結(jié)果表明天麻素在4～500 μg·mL-1時(shí),質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取低、中、高3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液(25、200、400 μg·mL-1),在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,結(jié)果表明,天麻素低、中、高質(zhì)量濃度溶液的精密度RSD分別為0.15%、0.14%、0.05%,表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取天麻素可溶性微針6份,分別溶解配制成質(zhì)量濃度約為146.21 μg·mL-1的供試品溶液,過0.22 μm微孔濾膜,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定質(zhì)量濃度,結(jié)果表明,天麻素實(shí)際質(zhì)量濃度平均值為(146.47±0.21)μg·mL-1,RSD為0.14%,該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液,于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示,24 h之內(nèi)樣品的RSD為0.06%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取9份供試品溶液,分別加入同體積質(zhì)量濃度為25、100、200 μg·mL-1對(duì)照品溶液,渦旋混合,過0.22 μm微孔濾膜,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定質(zhì)量濃度。以計(jì)算的質(zhì)量濃度值和真實(shí)質(zhì)量濃度值之比計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示低、中、高質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為(100.52±1.17)%、(97.86±0.54)%、(99.01±0.04)%,RSD分別為1.17%、0.55%、0.04%,結(jié)果表明加樣回收率符合方法學(xué)要求。

2.2 天麻素全載藥可溶性微針的制備

通過預(yù)試驗(yàn)最終篩選出PVP K30為制備微針針尖的最佳材料,HA為制備微針背襯層的最佳材料。

品牌的資產(chǎn)評(píng)估有比較成熟的模型可以借鑒，在沒有統(tǒng)一的閱讀推廣評(píng)估系統(tǒng)情況下，品牌資產(chǎn)評(píng)估不失為閱讀推廣服務(wù)直觀的評(píng)估方式。

采用兩步離心法制備可溶性微針。針尖材料的制備:按一定比例分別稱取天麻素與PVP K30于燒杯中,并加入一定量的超純水,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的PVP K30溶液。背襯材料的制備:按一定比例分別稱取天麻素與HA于燒杯中,并加入一定量的超純水,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的HA溶液。將背襯材料倒入微針模具中,3 000 r·min-1離心10 min,刮去針尖外多余的基質(zhì)溶液,干燥器室溫干燥30 min后,倒入背襯材料,3 000 r·min-1離心10 min,將模具置于干燥器內(nèi)30 ℃干燥24 h后脫模即得。

2.3 天麻素全載藥可溶性微針的表征

參照“2.2”項(xiàng)下方法制備天麻素全載藥可溶性微針,用HPLC法測(cè)定其載藥量,并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、機(jī)械性能、皮膚穿刺性能和恢復(fù)性能考察。

2.3.1 形態(tài)學(xué)考察 將所制備的微針置于掃描電子顯微鏡下,觀察其形態(tài)學(xué)特征,見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn),微針整體排列整齊,分布均勻,針體呈四棱錐狀、粗細(xì)均勻,長度為800 μm,底部直徑為410 μm,中心間距為800 μm。

圖2 天麻素可溶性微針掃描電鏡圖

2.3.2 微針含藥量測(cè)定 取6片制得的天麻素全載藥可溶性微針,分別溶于15 mL超純水中,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定質(zhì)量濃度,結(jié)果顯示所得每片微針含藥(5.45±0.14)mg。

2.3.3 機(jī)械性能檢查 利用物性分析儀來表征可溶性微針機(jī)械性能,選擇1/2探頭,設(shè)置測(cè)前速率為0.5 mm·s-1,測(cè)時(shí)速率為0.5 mm·s-1,測(cè)后速率為15 mm·s-1;觸發(fā)力為0.049 N[16]。通過物性分析儀測(cè)量微針針尖在探頭下壓過程中所受的應(yīng)力與探頭位移之間的關(guān)系,所得的壓變曲線見圖3。隨著物性分析儀探頭的移動(dòng),所受的應(yīng)力逐漸變大,力與位移曲線并未出現(xiàn)中斷或突然下降的情況,說明微針在受力過程中并未出現(xiàn)斷裂[17]。由圖3可知,當(dāng)位移壓縮至0.8 mm時(shí),應(yīng)力可達(dá)(1.215±0.05)N。微針刺破皮膚所需的刺入力需大于0.05 N[18],本研究制得的天麻素全載藥可溶性微針的斷裂力要遠(yuǎn)大于皮膚的刺入力,表明微針有較好的力學(xué)力度保證順利刺入皮膚。

圖3 天麻素全載藥可溶性微針壓變-應(yīng)力曲線(n=3)

2.3.4 皮膚穿刺性能 離體皮膚的處理:取健康SD大鼠,腹腔注射10%水合氯醛,麻醉后用剃毛器剔干凈腹部的毛,取下皮膚,剝離脂肪組織和筋膜,用生理鹽水反復(fù)清洗后,用濾紙吸干,再用錫箔紙包裹,然后放入-20 ℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,處死大鼠。

圖4 經(jīng)微針扎過后皮膚臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果

(2)組織學(xué)檢查 將SD大鼠用水合氯醛麻醉,腹部去毛擦干后,將載藥微針快速壓入脫毛的皮膚處按壓30 s后移除微針,1 min內(nèi)立即剝離微針穿刺后的皮膚,放到4%多聚甲醛中固定24 h,脫水、浸蠟、包埋、切片、干燥、HE染色后,拍照觀察離體皮膚的刺入情況。如圖5所示,皮膚最外層呈深紫色的部分為薄薄的一層角質(zhì)層,中間較薄的紫色為表皮層,最下面很厚的淡紫色部位為真皮層。天麻素可溶性微針可以成功刺破了皮膚角質(zhì)層,進(jìn)入到表皮層,表明微針突破了角質(zhì)層的屏障,且未觸及到真皮層神經(jīng)末梢,能夠起到無痛給藥的效果。

圖5 微針刺入大鼠皮膚后的組織切片圖(×100)

2.3.5 皮膚恢復(fù)考察 對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉并固定四肢,將微針壓入大鼠背部脫毛處皮膚,并用醫(yī)用膠布固定。5 min后,拔出微針,觀察皮膚的恢復(fù)情況,期間每隔0.5 h對(duì)微針扎入的皮膚部位拍照,直至皮膚完全恢復(fù),結(jié)果見圖6。皮膚恢復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,微針拔出后可以明顯地在皮膚表面看到規(guī)則排列的微小針孔。微針在拔出1 h內(nèi)皮膚恢復(fù)較快,針孔逐漸變得模糊。2 h后,微針扎過的皮膚部位幾乎觀測(cè)不到針孔,與周圍的皮膚紋理一致,已經(jīng)完全恢復(fù)。因此,本研究制備的微針生物相容性好,對(duì)皮膚無明顯損傷。

圖6 皮膚經(jīng)微針扎過后的恢復(fù)情況

2.4 體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)

向Franz透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(有效擴(kuò)散面積為1.13 cm2,接收室容積為15 mL)內(nèi)注入生理鹽水作為接收液,另按“2.3.5”項(xiàng)下方法取下大鼠腹部皮膚,將鼠皮置于供給池與接收池之間,角質(zhì)層朝向供給池,皮膚組織朝向接收室,封口后置于池中[水浴(37±0.2)℃,350 r·min-1]平衡30 min。將制備好的微針剪掉針尖周圍背襯[面積為0.9 cm×0.9 cm,載藥量為(1.92±0.14)mg],并施加一定力度的力使微針刺入鼠皮,同時(shí)設(shè)立溶液對(duì)照組(藥物含量同載藥微針),排除氣泡使藥物貼合皮膚上層,開始計(jì)時(shí)。此后于1、2、4、6、8、10、12 h取樣0.8 mL,同時(shí)補(bǔ)充等量的37 ℃接收液,將透皮接收樣品液用0.22 μm微孔濾膜濾過,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其中藥物含量。通過公式(1)計(jì)算累積滲透量(Qn),通過公式(2)計(jì)算累積滲透率。以累積滲透率為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)作圖,繪制藥物累積滲透曲線。對(duì)透皮實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合,求出的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率Jss,見表1。

(1)

累計(jì)滲透率(%)=Qn/載藥量×100%

(2)

式中Qn為第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)的單位面積累計(jì)透過量,A表示有效透皮面積,Cn為第n個(gè)點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度,V為接收池體積,Vi為每次取樣體積。

結(jié)果見圖7,微針組天麻素在前4 h內(nèi)快速釋放,累積滲透率為(84.60±15.79)%,隨后釋藥速率變緩,12 h后累積滲透率為(87.98±9.84)%。而溶液對(duì)照組天麻素在前12 h的累積滲透率僅為(12.10±5.88)%。因此，天麻素可溶性微針可大大地提高天麻素的皮膚透過量,并能增加藥物經(jīng)皮滲透速率,顯著提高藥物的透皮效果。

圖7 天麻素全載藥可溶性微針及其溶液對(duì)照的透皮累積滲透曲線

3 討論

本研究通過兩步離心法,成功制備了天麻素全載藥可溶性微針。微針由針尖與背襯層2部分構(gòu)成,針尖的主要組成材料為PVP K30,背襯層則由HA構(gòu)成,其中針尖和背襯層均含有藥物天麻素。制成的微針呈四棱錐狀,針尖機(jī)械性能良好,可刺穿大鼠皮膚,背襯層柔韌平整,貼合皮膚。微針處理后的皮膚在2 h內(nèi)即可恢復(fù)到原來的狀態(tài),安全性良好。體外透皮試驗(yàn)表明,微針對(duì)天麻素經(jīng)皮遞藥具有極大的促進(jìn)作用,全載藥微針前4 h內(nèi)快速釋放天麻素，其累積滲透率已大于80%,在12 h內(nèi)藥物基本釋放完全,藥物累積滲透率約為87%,而溶液對(duì)照組天麻素12 h內(nèi)累積滲透率僅為12%。

本文所制備的天麻素全載藥可溶性微針能有效穿透皮膚,克服角質(zhì)層屏障,經(jīng)皮遞送效率高,成功實(shí)現(xiàn)了水溶性藥物經(jīng)皮給藥,有望應(yīng)用于親水性藥物高效精準(zhǔn)、無痛微創(chuàng)的經(jīng)皮遞送,并為給藥劑量大、給藥次數(shù)頻繁、生物利用度低的藥物給藥方式設(shè)計(jì)提供了思路。此外,研究過程中發(fā)現(xiàn)由于制備微針的材料PVP K30極易吸潮,受外界環(huán)境濕度的影響大,所制備的可溶性微針必須密封儲(chǔ)存,故針尖層的設(shè)計(jì)有必要開展進(jìn)一步研究。