強(qiáng)筋合劑對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠治療及相關(guān)基因ALP、Osteocalcin、Runx-2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用*

王青華 龔衛(wèi)月沈云方 謝海霞 蔣雪嫣 胡 鈞

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院 浙江 湖州 313000

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的代謝性骨病[1]。在數(shù)千年積累的中藥寶庫中，多種藥物存在抗OP作用，如淫羊藿、骨碎補(bǔ)、鹿茸、杜仲、山茱萸[2]等經(jīng)研究表明，不僅能緩解患者癥狀，提高骨密度，且不良反應(yīng)少而輕，不產(chǎn)生耐藥性。因此，筆者旨在研究強(qiáng)筋合劑對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用及相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物：取3月齡健康雌性SPF級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量約220g。強(qiáng)筋合劑20世紀(jì)80年代獲得制劑批準(zhǔn)文號(hào)（批準(zhǔn)文號(hào)：浙藥制Z20100176）。強(qiáng)筋合劑[3]由淫羊藿、骨碎補(bǔ)、杜仲葉、熟地、丹參、五加皮、川續(xù)斷、雞血藤、白芍各20g煮制而得。

2 研究方法

30只SD大鼠采用卵巢切除術(shù)制備骨質(zhì)疏松大鼠：大鼠麻醉后，取仰臥位固定進(jìn)行腹部剃毛并消毒，打開腹腔后切除雙側(cè)卵巢。低鈣飼養(yǎng)3個(gè)月后，隨機(jī)抽取6只大鼠，以檢測(cè)骨密度(BMD)及血清堿性磷酸酶（ALP）及磷離子（P+）、鈣離子（Ca2+）含量確認(rèn)造模成功。大鼠分為模型組、低劑量組和高劑量組，另取10只SD大鼠為假手術(shù)組，操作同模型大鼠，打開腹腔，但不切除卵巢。確定造模成功后，低劑量組給藥10mL/(kg·d)，高劑量組給藥20mL/(kg·d)，同時(shí)假手術(shù)組和模型組用等量生理鹽水灌胃，各組給藥3個(gè)月，每天2次。

2.1 觀察指標(biāo)：①血清中磷離子（Phosphorusion,P+），鈣離子（Calciumion,Ca2+），鎂離子（Magnesiumion,Mg2+）濃度：給藥3個(gè)月大鼠腹主動(dòng)脈采血，離心制得血清，測(cè)定血清P+，Ca2+，Mg2+的含量；②骨形態(tài)檢測(cè)；③骨顯微結(jié)構(gòu)觀察；④RT-PCR檢測(cè)堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）、骨鈣素（Osteocalcin）和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx-2）表達(dá)。各基因引物如下。

表1 RT-PCR各基因引物設(shè)計(jì)

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件分析。其中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，均以P＜0.05表示差異具有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 兩組大鼠血清P+，Ca2+，Mg2+含量的比較：從表2可得，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清P+含量顯著上升（P＜0.05），Ca2+與Mg2+含量顯著下降（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組大鼠血清P+含量顯著下降（P＜0.05），Ca2+與Mg2+含量顯著上升（P＜0.05）。

表2 血清P+、Ca2+和Mg2+含量變化情況（±s，n=10）

表2 血清P+、Ca2+和Mg2+含量變化情況（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

Mg2+(mmol/L)2.90±0.28 1.77±0.19**2.42±0.24##2.69±0.28##組別假手術(shù)組模型組低劑量組高劑量組P+(mmol/L)1.80±0.19 2.87±0.30**2.49±0.26#2.35±0.26##Ca2+(mmol/L)1.80±0.20 1.20±0.14**1.40±0.15#1.57±0.20##

3.2 大鼠股骨HE染色比較：由表3可知，與模型組比較，給藥大鼠半定量評(píng)分顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。由圖1可得，與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠骨小梁局灶性壞死，排列稀疏、不整齊，部分?jǐn)嗔?，骨髓腔?nèi)造血細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)改變；給藥組與模型組比較，大鼠骨小梁數(shù)量減少不明顯，排列較規(guī)則，連續(xù)性、完整性較好；且高劑量組比低劑量組損傷更少；兩組與模型組比較，骨形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 SD大鼠軟骨組織HE半定量評(píng)分表（±s，n=10）

表3 SD大鼠軟骨組織HE半定量評(píng)分表（±s，n=10）

注：與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

半定量評(píng)分（分）-2.67±0.58 0.33±0.58#0.67±0.58##組別假手術(shù)組模型組低劑量組高劑量組

圖1 鼠股骨組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化情況（HE染色，200倍）

3.3 Micro-CT檢測(cè)大鼠股骨形態(tài)比較：由Micro-CT數(shù)據(jù)可得，骨小梁密度（Tb.Th）、骨小梁相對(duì)體積（BV/TV）和骨密度（BMD）指標(biāo)，模型組比假手術(shù)組明顯下降，且有顯著性差異（P＜0.05）。給藥組相較于模型組明顯上升，且有顯著性差異（P＜0.05），詳見表4。各組小鼠的股骨顯微結(jié)構(gòu)改變見圖2。

表4 骨質(zhì)疏松大鼠Micro-CT檢測(cè)結(jié)果（±s）

表4 骨質(zhì)疏松大鼠Micro-CT檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

BMD 241.17±29.16 189.45±17.63**230.75±21.64##239.79±22.57##組別假手術(shù)組模型組低劑量組高劑量組BV/TV 0.24±0.03 0.16±0.01*0.20±0.01#0.21±0.01#Tb.Th（1/mm）3.42±0.08 1.84±0.14**2.74±0.21##2.97±0.23##

圖2 Micro-CT觀察大鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)的改變

圖3 各組大鼠Micro-CT檢測(cè)結(jié)果

3.4 X光觀察大鼠股骨結(jié)構(gòu)的改變：X光圖片可觀察到，模型組相較于假手術(shù)組，骨密度明顯降低，說明模型組出現(xiàn)骨質(zhì)疏松病癥。給藥組相較于模型組，骨密度有所增加。

圖4 X光觀察大鼠股骨結(jié)構(gòu)的改變

3.5 RT-PCR檢測(cè)ALP、Osteocalcin、Runx-2表達(dá)：通過RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組的ALP、Osteocalcin、Runx-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P＜0.05)；與模型組比較，給藥組ALP、Osteocalcin、Runx-2 mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P＜0.05)，證實(shí)強(qiáng)筋合劑治療骨質(zhì)疏松癥過程中對(duì)ALP、Osteocalcin、Runx-2表達(dá)有上調(diào)作用。

圖5 RT-PCR檢測(cè)ALP、Osteocalcin、Runx-2表達(dá)水平

4 討論

骨質(zhì)疏松是老年患者常見疾病，隨著我國老齡化與日俱增，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年增高[4,5]，如何預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為相關(guān)學(xué)科研究的重要任務(wù)。有文獻(xiàn)報(bào)道淫羊藿其主要成分可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，以淫羊藿苷和淫羊藿次苷效果最佳[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究也表明骨碎補(bǔ)可以多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的抗OP[7]。因此，本研究擬大鼠去卵巢模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)強(qiáng)筋合劑可以治療大鼠骨質(zhì)疏松的效果及可能機(jī)制。

強(qiáng)筋合劑為50多年前我院名老中醫(yī)錢世勛先生根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)和經(jīng)方創(chuàng)建的“名方好藥”，符合我國中藥方劑學(xué)的君臣佐使配伍，多種藥物發(fā)揮協(xié)同作用，達(dá)到治療作用。

本研究結(jié)果顯示，給藥3個(gè)月后，模型組大鼠較假手術(shù)組血清P+含量顯著上升，Ca2+與Mg2+含量顯著下降。給藥組大鼠與模型組比較，血清P+含量顯著下降（P＜0.05），Ca2+與Mg2+含量顯著上升（P＜0.05），且成劑量依賴性。HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠的骨小梁壞死，細(xì)胞形態(tài)改變且數(shù)量明顯減少，給藥組大鼠骨小梁較模型組明顯增加，排列較整齊。此外，CT顯示大鼠的骨結(jié)構(gòu)明顯改善，骨密度增加。通過以上研究初步證實(shí)了強(qiáng)筋合劑對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用，本研究進(jìn)一步對(duì)相關(guān)因子如堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、Runx-2表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的ALP、Osteocalcin和Runx-2表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少（P＜0.05），給藥組的以上基因表達(dá)明顯高于模型組。證實(shí)強(qiáng)筋合劑治療骨質(zhì)疏松癥過程中對(duì)ALP、Osteocalcin、Runx-2表達(dá)有上調(diào)作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞合成。ALP是成骨細(xì)胞成熟重要標(biāo)志，參與成骨細(xì)胞分化全過程，可用于代表成骨細(xì)胞分化活性和分化水平[8]。Osteocalcin是反映骨更新的生化指標(biāo)，也能反映機(jī)體骨形成、骨代謝變化、骨細(xì)胞的功能狀況[9]。Runx-2與其下游基因Osterix在骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）誘導(dǎo)的前成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要作用[10]。多項(xiàng)報(bào)道研究顯示以上3種因子在骨細(xì)胞成型過程中發(fā)揮重要作用[11]。

綜上所述，強(qiáng)筋合劑能有效改善骨質(zhì)疏松大鼠股骨形態(tài)學(xué)，增加細(xì)胞數(shù)量，提高骨小梁密度（Tb.Th）、骨小梁相對(duì)體積（BV/TV）和骨密度，上調(diào)ALP、Osteocalcin、Runx-2表達(dá)水平，且安全性較好。