番紅花花蕊分化期差異蛋白表達(dá)的鑒定與分析

張衡鋒，張煥朝

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 園林園藝學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，南京 210037)

花蕊分化是植物開花和花芽分化的核心階段，是一個(gè)復(fù)雜的生理生化和形態(tài)建成過程。蛋白質(zhì)組學(xué)通過尋找和篩選任何有意義因素引起的不同樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，用以揭示細(xì)胞生理的進(jìn)程與本質(zhì)，并對(duì)某些關(guān)鍵蛋白的定性和功能進(jìn)行分析。近年來，蛋白質(zhì)譜技術(shù)在植物開花和花芽分化方面的研究已取得了豐碩成果[1-4]。番紅花(CrocussativusL.)屬鳶尾科番紅花屬多年生三倍體鱗莖類球根花卉，原產(chǎn)于伊朗、小亞細(xì)亞半島和希臘等地，中國(guó)各地常見引種栽培[5]。番紅花以花柱入藥，稱西紅花，具有活血、化瘀、生新、通經(jīng)等功效，作為傳統(tǒng)名貴中藥收入《中華人民共和國(guó)藥典(2020)》。番紅花生境苛刻，產(chǎn)量極低(約8 kg/hm2)，致使價(jià)格昂貴(約10 $/g)，素有“植物黃金”之稱[6]，由于其三倍體特性，難以進(jìn)行有性繁殖，致使繁殖系數(shù)低、種球退化、病蟲害頻發(fā)，已成為制約中國(guó)番紅花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。為有效解決番紅花生產(chǎn)技術(shù)瓶頸，除傳統(tǒng)栽培技術(shù)研究外，王莉等[7]和陳書安等[8]學(xué)者創(chuàng)新開展了番紅花胚性愈傷組織調(diào)控和花柱-柱頭狀物誘導(dǎo)研究[7-9]，提高了番紅花胚性愈傷組織和花柱-柱頭狀物的分化頻率，但未能真正構(gòu)建起花柱定向離體培養(yǎng)體系，缺乏花柱分化分子機(jī)理理論支持。針對(duì)番紅花開花這個(gè)核心環(huán)節(jié)，張衡鋒等[10]、周琳等[11]、Qian等[12]學(xué)者對(duì)其花芽結(jié)構(gòu)和開花調(diào)控因子等進(jìn)行了研究，這些研究為番紅花生產(chǎn)提供了理論支持，但針對(duì)番紅花開花分子機(jī)理尤其是花蕊分化機(jī)理的研究較少。

本研究聚焦番紅花藥用器官花蕊的分化過程，應(yīng)用MALDI/TOF/TOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定與分析技術(shù)，比較分析花蕊分花期蛋白質(zhì)組的變化，確定與分化過程密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，分析其可能的功能后構(gòu)建番紅花花蕊分化的分子調(diào)控模型，旨在揭示番紅花花蕊分化的分子機(jī)理，為番紅花定向培養(yǎng)和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué) 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)所用番紅花(CrocussativusL.)生長(zhǎng)于江蘇中藥科技園(32°27′42″N, 119°55′57″E)，屬于亞熱帶季風(fēng)性氣候，年降水量1 020.5 mm，全年最高、最低和平均溫度分別為38.2 ℃，-7.2 ℃和14.9 ℃，全年光照1 746 h，土壤類型為高沙土，正常水肥管理。

1.2 試驗(yàn)材料

2020年5月10日收獲仔球并儲(chǔ)藏于陰涼通風(fēng)處，2020年7月5日(番紅花球莖處于休眠狀態(tài))挑選生長(zhǎng)完好，質(zhì)量(25±1)g的種球300個(gè)，置于溫度(25±0.5)℃，空氣濕度75%的智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，全程暗培養(yǎng)。自放入智能培養(yǎng)箱中開始，每3 d用電子顯微鏡觀察番紅花球莖花芽，以花序分化出第一朵小花為準(zhǔn)，在花被原基分花期(TD)、雄蕊原基分花期(SD)和雌蕊原基分花期(PD)(圖1)，每10個(gè)番紅花莖尖為1次生物學(xué)重復(fù)，重復(fù)3次。所有莖尖樣品取樣后立即用錫箔紙包裹并放入液氮速凍20 min，速凍后在-80 ℃條件下保存，備用。

1.3 蛋白提取

采用TCA/丙酮沉淀法[13]提取番紅花樣品蛋白，略作修改。1 000 mg樣品(鮮質(zhì)量)研磨成粉，在-20 ℃條件下用含有100 g/L三氯乙酸(TCA)、0.7 g/L DTT和1 mmol/L PMSF的丙酮溶液(-20 ℃預(yù)冷)懸浮萃取2 h。在4 ℃條件下15 000 r/min離心20 min，棄上清，再用預(yù)冷丙酮溶液漂洗萃取3次，室溫下放置1 h，待丙酮揮發(fā)完全后，將沉淀物冷凍干燥后-80 ℃條件下保存。

1.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用Bradford法[14]進(jìn)行番紅花花芽樣品蛋白含量的測(cè)定，略作修改。以100 mL 95%乙醇、200 mL 85%磷酸和500 mg考馬斯亮藍(lán)G-250制成Bradford儲(chǔ)備液。由425 mL雙蒸水、15 mL 95%乙醇、30 mL 85%磷酸和30 mL Bradford儲(chǔ)備液制成工作液，雙層濾紙過濾后，4 ℃棕色瓶保存。以1 mg/mL的BSA溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，吸取100 μL的樣品液和標(biāo)準(zhǔn)液加入到5 mL的Eppendorf管中，加入3 mL Bradford儲(chǔ)備液混合搖勻，2 min后在分光光度計(jì)595 nm處測(cè)定吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品蛋白質(zhì)含量。

1.5 雙向電泳(2-DE)、凝膠染色和圖譜分析

取1.0 mg的樣品蛋白粉末，加入適量的IEF裂解液[7 mol/L urea+2 mol/L Thiourea+ 40 g/L CHAPS+0.5%(V/V)IPG buffer(24 cm linear, pH 4～7)]溶解，注入每一條IPG膠條(24 cm，pH 4～7)上。第一向固相pH梯度聚焦電泳：采用Ettan IPG-phor系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))，電泳條件為20 ℃，50 μV/trip，200 V電流1 h，500 V電流1 h，1 000 V電流1 h，8 000 V電流4 h，8 000 V電流6 h。聚焦結(jié)束后，膠條進(jìn)行2次平衡。第二向SDS-PAGE垂直板電泳：平衡好的膠條配置成12%的聚丙烯酰氨凝膠，灌入玻板后加飽和正丁醇封膠，凝膠完全聚合后置于SDS-PAGE膠面上，加入蛋白分子量Marker，并用 0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠。待低熔點(diǎn)瓊脂糖凝固后將玻板置于Ettan IPG-phor系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))中開始電泳，1 W/膠條先電泳1 h，之后5W/膠條繼續(xù)電泳，至溴酚藍(lán)跑至離膠底1.0 cm時(shí)停止電泳。

電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色6 h，之后超純水清洗至凝膠背景無(wú)色透明，蛋白點(diǎn)清晰為止。

所有染色的電泳凝膠用300 dpi的Image Scanner Ⅲ(GE Healthcare Life Sciences，瑞典)掃描成像，并用PDQuest 7.2軟件進(jìn)行圖譜分析，只有蛋白點(diǎn)差異表達(dá)超過1.5倍和P<0.05(LSD)的變化被認(rèn)定為差異表達(dá)點(diǎn)。所有待測(cè)樣品雙向電泳分析和凝膠圖譜分析重復(fù)3次。

1.6 蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解、鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢

參照Kumarathasan等[15]方法進(jìn)行蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解，略作調(diào)整。從凝膠上切1～2 mm的蛋白點(diǎn)凝膠放入Eppendorf管中，加入100 μL的100 mmol/L的NH4HCO3和100 μL的50%的ACN進(jìn)行脫色，凍干后加入10 μL的 12.5 ng/μL胰蛋白酶溶液酶解12 h，加入20 μL的100 mmol/L的NH4HCO3和20 μL的50% ACN和0.1% TFA，取上清液，凍干，在干燥的樣品中加入10 μL的0.1%的TFA和10 μL的C18Zip脫鹽，用以質(zhì)譜鑒定。

采用4800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行質(zhì)譜分析，采用正離子反射模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，PMF質(zhì)量掃描范圍700～3 500 ku，使用解釋模式自動(dòng)排除胰蛋白酶自解峰、常見的角蛋白污染峰，選擇強(qiáng)度最大的5個(gè)峰作為母離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。

所有肽植物圖譜通過MASCOT檢索引擎(http://www.matrixscience.com)在植物的NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索。最大允許漏切位點(diǎn)為1，質(zhì)量誤差范圍設(shè)置為PMF100×10-6，MS/MS為0.2 ku。

2 結(jié)果與分析

2.1 2-DE蛋白圖譜和差異蛋白

從2-DE圖譜中蛋白點(diǎn)分布來看(圖2)，蛋白點(diǎn)的等位點(diǎn)主要分布于4.0～7.0，分子質(zhì)量主要集中在18.5～117.0 ku，每塊膠條上有超過900個(gè)蛋白點(diǎn)重復(fù)表現(xiàn)，匹配率約79%～81%。所有蛋白點(diǎn)中，8個(gè)點(diǎn)在花被原基分化期特異表達(dá)，5個(gè)點(diǎn)在雄蕊原基分化期特異表達(dá)，2個(gè)點(diǎn)在雌蕊原基分化期特異表達(dá)。相鄰兩個(gè)時(shí)期中，各蛋白點(diǎn)表現(xiàn)出特異、升高、下降和持平4種變化(圖3)，共有81個(gè)蛋白點(diǎn)呈現(xiàn)出顯著差異(表達(dá)豐度值vol%>1.5倍，P<0.05)。

2.2 差異表達(dá)蛋白的鑒定和分類

探索番紅花花芽分化過程中差異蛋白的功能對(duì)探索番紅花開花機(jī)理具有重要意義。根據(jù)蛋白質(zhì)差異分析結(jié)果，番紅花花芽分化不同時(shí)期的81個(gè)差異表達(dá)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜分析及NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，75個(gè)差異蛋白得以鑒定，并對(duì)其功能進(jìn)行分類(表1)，可靠鑒定率達(dá)84.27%，功能類別包括：代謝(25個(gè)，33.33%)，能量(7個(gè)，9.33%)，細(xì)胞防御(8個(gè)，10.67%)，蛋白命運(yùn)(20個(gè)，26.66%)，細(xì)胞合成原件(5個(gè)，6.67%)，結(jié)合蛋白和輔助因子(3個(gè)，4.00%)，細(xì)胞周期和DNA加工(2個(gè)，2.67%)，細(xì)胞運(yùn)輸(5個(gè)，6.67%)。

2.3 蛋白差異表達(dá)分析

2.3.1 糖和能量代謝相關(guān)蛋白 由表1和圖4可知，在差異表達(dá)的蛋白中代謝類占比最大，其中25個(gè)為調(diào)控糖代謝和能量代謝的關(guān)鍵蛋白，說明在番紅花花蕊分化過程中，糖和能量代謝是最主要的生理反應(yīng)之一。番紅花花蕊分化期，功能葉尚未形成，因此此間糖代謝途徑應(yīng)主要是糖酵解和糖異生過程。在花蕊分化期內(nèi)，顆粒結(jié)合淀粉合成酶(GBSS)活性持續(xù)下降，GBSS是唯一可以對(duì)直鏈淀粉生物合成起作用的關(guān)鍵酶[16]，說明在此期間直鏈淀粉的合成能力在減弱。參與糖酵解代謝的關(guān)鍵酶FBA、UGPase、ATPase和UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而FRK、TPI、NSE和LOS2活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說明在眾多糖代謝路徑中，蔗糖經(jīng)F1P產(chǎn)生丙酮酸途徑應(yīng)是番紅花花蕊分化糖酵解的主要途徑。乙酰-CoA羧化酶活性降低，說明乙酰輔酶A作為TCA循環(huán)底物的能力也在增強(qiáng)。

2.3.2 氨基酸代謝和植物信號(hào)調(diào)控相關(guān)蛋白 甲硫氨酸t(yī)RNA連接酶參與甲硫氨酸到甲硫氨酸t(yī)RNA的耦合過程，使mRNA的遺傳信息準(zhǔn)確無(wú)誤地反映到甲硫氨酸序列上。由表1和圖4可知，番紅花花蕊分化過程中，甲硫氨酸t(yī)RNA連接酶活性的持續(xù)減弱，說明甲硫氨酸水平在降低。在精氨酸酶等酶的催化作用下，精氨酸可水解成鳥氨酸和其他含氮化合物，這些代謝物質(zhì)均是蛋白質(zhì)合成的重要底物，隨著精氨酸酶活性的持續(xù)增強(qiáng)，鳥氨酸和含氮化合物水平也將隨之升高。半胱氨酸是植物體內(nèi)保護(hù)細(xì)胞環(huán)境不受氧化應(yīng)激影響的一種氨基酸，其殘基之間S-S的形成也是分子伴侶活化的關(guān)鍵性步驟，是一些蛋白正確折疊和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的必需物，半胱氨酸合成酶活性的增強(qiáng)，可維持花芽細(xì)胞不受氧化應(yīng)激影響，并增加分子伴侶活性，促進(jìn)花蕊細(xì)胞的分化。黃堿酮3-羥化酶可調(diào)控黃酮與花青素產(chǎn)物的合成，黃堿酮3-羥化酶在番紅花雄蕊分化期迅速升高利于黃酮合成，進(jìn)而促進(jìn)雄性配子體和花粉管發(fā)育信號(hào)的傳遞[17]。

2.3.3 活性氧代謝相關(guān)蛋白 植物胞質(zhì)中主要的活性氧代謝系統(tǒng)為抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)，其中抗壞血酸過氧化氫酶(APX)是關(guān)鍵酶之一。鳥苷二磷酸甘露糖在甘露糖-3′,5′-異構(gòu)酶(GME)的催化作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-甘露糖-半乳糖，其是抗壞血酸合成酶的重要底物。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)乳酰谷胱甘肽裂解酶通過一個(gè)1,2-氫轉(zhuǎn)移，催化丙酮醛轉(zhuǎn)化為乳酸谷胱甘肽，進(jìn)而水化產(chǎn)生谷胱甘肽和D-乳酸鹽，實(shí)現(xiàn)解毒作用[18]。如表1和圖4所示，APX、CAT、TpxⅡ和GME活性增強(qiáng)，說明番紅花花蕊分化過程中，花蕊細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)活性氧(ROS)積累，通過活性氧代謝，將H2O2等ROS維持在一個(gè)較低水平。

2.3.4 蛋白修飾和加工相關(guān)蛋白 熱激蛋白是生物受到高溫或其他環(huán)境脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種熱激反應(yīng)，根據(jù)分子質(zhì)量大小，可分為小分子熱激蛋白(分子質(zhì)量小于50 ku)和大分子熱激蛋白(分子質(zhì)量大于50 ku)，泛素蛋白就是一種通過ATP促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)水解的小分子量熱激蛋白，而葉綠體HSP60和葉綠體HSP70屬于誘導(dǎo)型大分子熱激蛋白，葉綠體HSP60具有參與核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶全酶的裝配和監(jiān)護(hù)葉綠體內(nèi)蛋白的折疊、組裝的雙重功能[19]。HSP70通常在植物體內(nèi)表達(dá)量較少，但在應(yīng)激原的作用下表達(dá)迅速增加，其兼具ATP酶活性和分子伴侶功能[20]。如表1和圖4所示，在番紅花花蕊分花期內(nèi)，熱激蛋白、泛素蛋白表達(dá)量先下降后上升，說明在番紅花分化過程中，伴隨著大量熱激反應(yīng)，保障蛋白修飾和加工順利進(jìn)行。

2.3.5 細(xì)胞結(jié)構(gòu)建成相關(guān)蛋白 細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞的重要組成部分，包括微絲、微管和中間絲，其中微絲的基本組成單位就是肌動(dòng)蛋白。肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨脹等形態(tài)建成與功能方面具有關(guān)鍵的作用[21]。微管蛋白與細(xì)胞壁微原纖維呈橫向分布，限制細(xì)胞的橫向膨脹，促進(jìn)細(xì)胞縱向延長(zhǎng)。如表1和圖4所示，番紅花花蕊分化過程中，肌動(dòng)蛋白表達(dá)量先上升后下降，β-肌動(dòng)蛋白和微管蛋白表達(dá)量持續(xù)升高，說明番紅花雌蕊分化期參與的肌動(dòng)蛋白主要是β-肌動(dòng)蛋白。隨著分化的推進(jìn)，需要大量的β-肌動(dòng)蛋白和微管蛋白參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。當(dāng)植物受到外界環(huán)境壓力或接收到植物發(fā)育內(nèi)在信號(hào)時(shí)，植物延伸因子(eEF1)會(huì)迅速做出反應(yīng)，通過在核糖體上催化氨基酸鏈的延伸而推動(dòng)、控制蛋白質(zhì)的合成，其不僅可以將GTP和氨基酸t(yī)RNA運(yùn)至核糖體上。在番紅花花蕊分化過程中，eEF1A的對(duì)應(yīng)物延伸因子Tu(EF-Tu)表達(dá)量上升，說明番紅花花芽分化與eEF1A主導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成代謝密切相關(guān)。3-oxo-γ(4,5)-類固醇-5-β-還原酶可促進(jìn)葡萄糖-1-磷酸向纖維素的轉(zhuǎn)變，其表達(dá)水平的提高有利于細(xì)胞纖維結(jié)構(gòu)的建成。

3 討論與結(jié)論

3.1 代謝和信號(hào)調(diào)控過程

蔗糖和淀粉是高等植物碳水化合物貯藏的主要形式，也是協(xié)調(diào)植物庫(kù)源關(guān)系的重要信號(hào)分子。前期研究表明，番紅花花芽分化過程中，可溶性糖含量與淀粉含量顯著負(fù)相關(guān)，在雄蕊分化階段和雌蕊分化階段，莖尖中始終維持高水平可溶性糖[22]。因此，糖酵解應(yīng)是番紅花花蕊分化中糖代謝和能量代謝的主要形式，以此為花蕊分化提供足夠的能量。根據(jù)蛋白差異表達(dá)分析，其代謝路徑可能為：蔗糖經(jīng)蔗糖酶的催化分解成果糖、葡萄糖等己糖，果糖經(jīng)果糖激酶(FRK)的催化可形成果糖-1-磷酸(F1P)，F(xiàn)1P經(jīng)醛縮酶催化，形成甘油醛和磷酸二羥丙酮(DHAP)，甘油醛經(jīng)甘油醛激酶的作用，最終形成3-磷酸甘油醛(G3P)，而DHAP在磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)的催化作用下也形成G3P，最終一分子果糖形成了兩分子G3P。G3P經(jīng)過氧化和磷酸化反應(yīng)形成2-磷酸甘油酸(G2P)，G2P經(jīng)糖分解烯醇酶(NSE)和烯醇酶(LOS2，enoslase)的催化和分子重排生成丙酮酸，丙酮酸經(jīng)過氧化脫羧最終生成乙?；o酶A(Ac-CoA)，進(jìn)入TCA循環(huán)，而蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酰輔酶A連接酶正是TAC循環(huán)中的關(guān)鍵酶[23](圖4)。

植物花芽分化伴隨著大量的氨基酸代謝和植物信號(hào)調(diào)控。甲硫氨酸兼有乙烯合成前體和DNA甲基化修飾兩方面的作用，而且一些DNA甲基化修飾可抑制成花基因FLC的表達(dá)[24]。甲硫氨酸水平的降低可能會(huì)導(dǎo)致乙烯含量和DNA甲基化修飾水平的降低，因乙烯與細(xì)胞分裂素存在拮抗作用，由此促進(jìn)細(xì)胞分裂素相對(duì)水平升高和FLC的表達(dá)，這與前期研究番紅花花芽分化中，莖尖中維持高水平內(nèi)源CTK[22]的研究結(jié)果基本一致。鳥氨酸是多胺(PA)等重要信使分子的前體[25]，PA對(duì)于花基啟動(dòng)、信使RNA轉(zhuǎn)錄和特異蛋白翻譯具有重要作用[26]，前期關(guān)于番紅花花芽分化的研究中，RNA、蛋白質(zhì)含量均先升高后降低，核酸與可溶性蛋白含量顯著或極顯著相關(guān)[10]，所以鳥氨酸水平升高極有可能促使PA等代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)花蕊分化。

植物受到脅迫、缺乏營(yíng)養(yǎng)、發(fā)育成熟過程中均會(huì)導(dǎo)致活性氧(ROS)的積累，低水平的ROS具有乙烯等植物激素信號(hào)傳遞作用，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育[27]，高水平ROS則會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，形成抗氧化防御機(jī)制。番紅花花蕊分化過程中，可能因?yàn)榉只^程中需要大量營(yíng)養(yǎng)供給，從而誘發(fā)活性氧積累，APX和CAT等抗氧化酶清除過多的ROS，將ROS維持在較低水平，進(jìn)而降低乙烯等植物激素水平，促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)發(fā)育，通過調(diào)控植物激素信號(hào)來推進(jìn)番紅花花蕊的分化進(jìn)程。另外，番紅花花蕊分化期處于夏季，細(xì)胞可能通過抗氧化防御機(jī)制清除高溫誘發(fā)的ROS積累，獲得合適的發(fā)育環(huán)境。

3.2 熱激反應(yīng)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)建成過程

泰州地處北亞熱帶濕潤(rùn)氣候區(qū)，夏季高溫多雨，氣溫最高在7月。番紅花花蕊分化期一般從7月下旬至8月上旬，而其適合溫度區(qū)間為 23 ℃～27 ℃。較高的溫度會(huì)誘導(dǎo)熱激蛋白積累，而雄蕊原基分化期熱激蛋白下降可能與花粉管分化有關(guān)，與雌性組織不同，花粉管萌發(fā)過程中缺乏熱激蛋白mRNA的積累，導(dǎo)致合成熱激蛋白的能力逐漸喪失[28]，進(jìn)入雌蕊原基分花期后由于熱激反應(yīng)，熱激蛋白水平又迅速上升。

在番紅花雄蕊原基分化期，莖尖分生組織繼續(xù)分化花被片細(xì)胞，需要大量的微管細(xì)胞的參與。在雄蕊原基分化期，許多莖尖已經(jīng)開始分化出第二小花，這可能是β-肌動(dòng)蛋白持續(xù)增加的原因之一。另外，延伸因子Tu(EF-Tu)表達(dá)量與微管蛋白及磷脂酰肌醇激酶活性同步上升，可能是因?yàn)镋F-Tu通過結(jié)合微管蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和活化磷脂酰肌醇激酶[29]，具體作用機(jī)理需要進(jìn)一步深入研究。

3.3 其他植物花芽分化的比較

Zhang等[2]運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究百子蓮(Agapanthuspraecoxssp.orientalis)開花發(fā)現(xiàn)：在百子蓮花芽分化和開花過程中，得以可靠鑒定的蛋白主要涉及能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白命運(yùn)和細(xì)胞構(gòu)成；You等[3]在研究龍眼(DimocarpuslonganLour.)開花逆轉(zhuǎn)過程中發(fā)現(xiàn)：能量代謝和活性氧代謝相關(guān)蛋白可能在花芽分化過程中發(fā)揮主要作用，這些蛋白主要包括葡糖糖-6-磷酸異構(gòu)酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶連接酶、蘋果酸脫氫酶、ATP酶，過氧化氫酶和微管蛋白等；陳一帆等[4]在研究黃連木花芽分化期差異蛋白發(fā)現(xiàn)：雄蕊與雌蕊分化與活性氧代謝、核糖體活動(dòng)、光合作用等相關(guān)蛋白密切相關(guān)。以上研究均表明，其他植物成花過程中，絕大部分差異蛋白種類與番紅花花蕊分化差異蛋白種類基本相似，只是部分蛋白在相同或相近分化期表現(xiàn)出不同變化趨勢(shì)，這可能與植物品種以及培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)篩選和研究番紅花花蕊分花期差異蛋白變化，獲得了大量與番紅花花蕊分化相關(guān)的新信息。本研究鑒定了75個(gè)可能在番紅花花蕊分化中發(fā)揮重要作用的蛋白，這些蛋白可能參與了糖酵解、信號(hào)傳導(dǎo)、氨基酸代謝、活性氧代謝、蛋白修飾和加工、細(xì)胞結(jié)構(gòu)建成等生理作用，并據(jù)此初步構(gòu)建了番紅花花蕊分化的分子調(diào)控模型，為進(jìn)一步揭示番紅花花蕊分化調(diào)控機(jī)制提供了新依據(jù)，為番紅花定向培養(yǎng)提供新線索。