低溫脅迫下外源NO對黃秋葵幼苗生長及生理特性的影響

陳瑤瑤，嚴良文，劉智成，余 杰

(1.龍巖市農業(yè)科學研究所，福建龍巖 364000；2.龍巖市新羅區(qū)農業(yè)局，福建龍巖 364000)

黃秋葵(AbelmoschusesculentusL.)俗稱洋辣椒、補腎草和羊角豆等[1]，隨著人們對其營養(yǎng)保健與醫(yī)療價值的認可，黃秋葵的栽培區(qū)域及面積也在逐年增加，是近年來南方地區(qū)早春蔬菜栽培的優(yōu)勢品種之一。黃秋葵起源于熱帶和亞熱帶，耐熱怕寒，對低溫的反應很敏感[2]，早春容易遭受低溫冷害，植株生長受到抑制，嚴重影響后期果莢的品質和產量。因此，如何提高黃秋葵的抗寒性是生產上急需解決的一個問題。

植物低溫耐受能力首先決定于植物本身的遺傳特性，不同蔬菜品種抵御低溫能力不同[3-4]。但已有研究表明，在生產栽培上可以通過人為干預[5-6]，如低溫鍛煉、施加植物生長調節(jié)劑加外源脫落酸(ABA)[7]、外源亞精胺[8]、水楊酸[9]、外源褪黑素[10]、甜菜堿[11]及采用生物技術等手段來增強蔬菜抵御低溫的能力[12-14]，而利用外源物質增強植物抗逆性是一種經濟有效的措施，目前已成為蔬菜作物逆境生理研究的熱點。

NO能夠調節(jié)植物的生長發(fā)育，所以有人把它作為一種新的植物信號分子[15]，已有大量的研究表明NO與環(huán)境脅迫下植物抗逆性方面具有獨特的生理功能，但是，目前在蔬菜作物中這些研究主要集中在黃瓜[16-17]、南瓜[18]、番茄[19]等一些蔬菜上，且在處理濃度上還存在比較多的爭議。外源NO在黃秋葵上的相關研究資料較少，尤其是外源NO對黃秋葵不同品種(系)幼苗的抗低溫逆境作用機理的相關研究尚鮮報道。低溫對植株的影響主要是通過生理生化及形態(tài)的變化來體現(xiàn)，因此，本研究以3個不同品種的黃秋葵幼苗為試材，通過葉片噴施外源NO，初步探討不同濃度外源NO處理對低溫脅迫下黃秋葵幼苗生理指標的影響，以探究外源NO對黃秋葵幼苗耐寒性的調控機理，并確定最佳的處理濃度，以期為早春黃秋葵抗低溫栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在龍巖市農科所內進行。供試黃秋葵品種(系)為‘巖黃秋葵’，其種子由龍巖市農科所果蔬室黃秋葵課題組提供，標為Y，‘紅秋葵’種子購于北京綠東方農業(yè)技術研究所，標為H，‘綠霸’種子購于日本瀧井種苗株式會社，標為L。3個品種(系)田間綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)異，抗耐性強，產量高，深受當?shù)剞r戶的喜愛，具有一定代表性。試驗所用外源NO供體硝普鈉[Na2Fe(CN)5NO·2H2O](sodium nitroprusside，SNP)購自福晨(天津)化學試劑有限公司，純度大于99.0%。

1.2 試驗設計

試驗以外源一氧化氮(NO)供體硝普鈉(SNP)作為處理試劑。挑選籽粒大小均勻一致的種子，經浸種催芽后播種于穴盤中。待幼苗第3片真葉完全展開時，挑選生長一致、健壯的植株進行處理，常溫清水標為對照CK1，低溫(10 ℃/5 ℃)清水標為對照CK2，在葉面噴施濃度為 0.50、1.0、1.5和2.0 mmol/L SNP的基礎上低溫(10 ℃/5 ℃)處理，標為T1、T2、T3和T4，共6個處理。

用噴壺將配好的液體均勻噴施于黃秋葵的葉片上，噴到葉片滴水為止，連續(xù)噴施3 d后置于晝/夜溫度為10 ℃/5 ℃，光期12 h，暗期12 h，光照度2 000 lx，低溫處理，處理72 h后取幼苗生長點下第2片葉測定相關指標(處理72 h為龍巖農科所果蔬課題組前期試驗篩選所得[20])。每處理30株，3次重復。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 株高、莖粗、干質量和鮮質量的測定 每個處理隨機選取5株，用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，測定株高、莖粗和鮮質量，然后再放入105 ℃下殺青20 min，后75 ℃烘干至恒量，稱取干質量。

1.3.2 抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的測定 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定參考NBT光還原法[21]；過氧化物酶(POD)活性的測定參考愈創(chuàng)木酚比色法[22]；過氧化氫酶(CAT)活性的測定參照紫外吸收法[21]；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定參考陳建勛等[23]的測定方法；丙二醛(MDA)含量的測定參考硫代巴比妥酸(TBA)[21]法。以上指標均采用蘇州科銘生物技術有限公司生產的檢測試劑盒進行測定，均以鮮質量計。

1.4 數(shù)據分析

采用WPS軟件進行數(shù)據整理和圖表繪制；運用SPSS 17.0軟件進行方差分析和差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 外源NO對低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗生長的影響

由表1可知，與CK1相比，低溫逆境下3個黃秋葵品種幼苗的株高、莖粗、干質量和鮮質量均顯著降低。Y、L和H株高分別比CK1組降低 5.25%、4.55%和2.25%，莖粗分別降低 11.11%、23.22%和15.22%，鮮質量分別降低 9.40%、10.90%和32.35%，干質量分別降低 3.07%、21.95%和20.59%差異顯著。說明低溫脅迫顯著抑制黃秋葵幼苗的生長發(fā)育。施加一定濃度外源NO處理能有效緩解低溫逆境對黃秋葵幼苗生長的抑制作用，增加生長量，然而不同濃度SNP處理對黃秋葵生長量積累的影響也有所不同。其中品種Y和H以1.0 mmol/L SNP處理效果最佳，株高、莖粗、鮮質量和干質量較CK2處理顯著提高4.31%和1.29%、9.93%和 10.56%、11.07%和9.70%、40.63%和25.93%；品種L則在0.5 mmol/L SNP處理時的株高、莖粗、鮮質量及干質量達到最大值，較CK2處理提高 2.78%、8.29%、10.45%和21.74%，差異顯著。

表1 低溫脅迫下不同濃度SNP處理黃秋葵幼苗生長狀況

由此可知，低溫脅迫影響黃秋葵幼苗的生長，不同濃度SNP處理對低溫脅迫下幼苗的生長效果不同，低濃度促進幼苗生長，高濃度反而抑制幼苗的生長，本試驗以0.5～1.0mmol/L處理效果較佳，但仍未能恢復到CK1水平。品種間比較，3個品種的抗寒性由高到低依次為‘巖黃秋葵’>‘紅秋葵’>‘綠霸’。

2.2 外源NO對低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗SOD活性的影響

由圖1可知，單獨低溫脅迫后黃秋葵葉片SOD活性明顯升高，3個品種CK2的活性顯著高于CK1，分別比各自對應的CK1提高20.33%、8.61%和10.91%，不同濃度外源NO(SNP)處理后葉片SOD活性變化呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，規(guī)律性強。其中T2處理的含量最高，Y、L和H分別比各自CK2增加57.92%、22.47%和 32.85%，差異顯著。可見，低溫脅迫會使幼苗葉片的SOD活性增強，適宜濃度外源SNP處理能進一步提高低溫脅迫下SOD的活性，其中品種Y活性增加幅度最大。

2.3 外源NO對低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗POD活性的影響

由圖2可知，低溫脅迫下3個品種CK2處理的POD活性顯著高于CK1，Y、L和H分別比各自對應的CK1提高6.96倍、5.79倍和 6.40倍。3個品種的POD活性隨著SNP處理濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，T2與各自CK2處理對比增幅最大，Y、L和H分別較CK2增加 53.05%、23.99%和31.89%，均達到顯著水平。說明低溫脅迫增強幼苗葉片的POD活性，外源NO進一步提高黃秋葵葉片POD的活性，其中對品種Y活性增加更明顯。

2.4 外源NO對低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗CAT活性的影響

由圖3可知，單獨低溫脅迫環(huán)境下，3個品種葉片CAT活性較CK1出現(xiàn)明顯的抑制現(xiàn)象，且不同品種CAT活性下降程度不同，其中L品種下降最多，達96.75%，H品種次之，下降 67.59%，Y品種下降最少為64.14%。施加低濃度SNP處理，品種Y和H的CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中以T2處理最優(yōu)，分別比CK2提高97.14%、62.08%和76.80%。當外源NO濃度達到2.0 mmol/L時葉片CAT活性顯著低于CK1。結果表明低溫下外施NO提高品種Y和H的CAT活性，但品種L無顯著差異。

2.5 外源NO對低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗APX活性的影響

由圖4可知，與CK1相比，低溫脅迫下3個品種的APX活性均升高，但不同品種增加的幅度不同，Y和H分別增加14.88倍和2.06倍，差異顯著，L增加16.13%，無顯著差異，外源NO均不同程度上增強葉片APX活性，其中以T2處理的APX活性最高，Y、L和H分別比CK2增加1.64倍、1.09倍和1.20倍，均達到顯著水平。由此可知，低溫逆境會使黃秋葵幼苗葉片的APX活性增強，適當濃度SNP處理能進一步提高APX 的活性，其中增強效果為品種Y>H>L。

2.6 外源NO對低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗MDA含量的影響

從圖5可以看出，低溫脅迫下MDA含量劇增。與CK1相比，CK2處理MDA含量明顯提高，不同品種升高的幅度不同，其中L提高的幅度最多達106.35倍，H次之為27.73倍，Y提高幅度最低為21.86倍。由于MDA作為膜脂過氧化的最重要產物之一，其含量的高低可以判斷逆境下植物細胞膜的損害程度，本研究表明脅迫下3個品種葉片細胞膜遭受傷害程度為L>H>Y。試驗發(fā)現(xiàn)高濃度SNP處理(1.5～2.0 mmol/L)導致MDA含量劇增，且都顯著高于CK2。低濃度外源NO處理效果好，其中T2處理效果最佳，Y、L和H的MDA含量分別較對應的CK2降低65.30%、33.01%和42.96%，差異顯著。說明低溫逆境引起黃秋葵葉片細胞內MDA含量的增加，適當濃度的SNP處理可抑制MDA的積累，在一定程度上緩解低溫逆境對細胞膜的損害，3個品種中Y品種降低最明顯。

3 討論與結論

低溫冷害是自然界中最常見的非生物脅迫之一，植物遭受低溫冷害，會使各項生理活動減緩或停止[24]。逆境下，植物形態(tài)學特征變化反映了植物生物量的變化。本研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下黃秋葵幼苗生長受到抑制，生物量積累下降，施加一定濃度(0.5～1.0 mmol/L)的外源NO顯著緩解了脅迫傷害，并且3個品種的最大株高、莖粗、鮮質量、干質量均超過各自對應的CK2，表明適量的SNP處理能夠有效增強植株的抗低溫能力，促進幼苗的生長發(fā)育，更有利于黃秋葵壯苗培育。這與張永吉等[25]和樊懷福等[26]研宄表明，SNP處理顯著提高冷害脅迫下茄子幼苗的干質量和緩解低溫對黃瓜幼苗的抑制作用的結果相似。

抗氧化酶系統(tǒng)中APX、POD、CAT與SOD一起協(xié)同作用組成抗氧化防線共同保護植物使其免受過氧化作用造成的損傷。葉片是植物進行光合和蒸騰作用的主要器官，能靈敏地反映外界的變化。本研究表明低溫冷害顯著抑制黃秋葵葉片CAT活性，SOD、POD和APX活性在植物遭受低溫冷害后升高，這可能是在植物到脅迫傷害后迅速激活，減輕脅迫所造成的活性氧損傷。外源NO供體硝普鈉(SNP)在提高植物葉片抗氧化酶活性，進而提高葉片對逆境脅迫的耐受力的過程中發(fā)揮了重要作用，這與Liang等[27]研究表明外源NO可有效誘導抗氧化酶系統(tǒng)從而提高耐寒性研究結果相似。

本研究表明施加外源NO對黃秋葵葉片保護酶活性表達產生顯著影響，其中SOD、POD、CAT和APX活性在低濃度0.5～1.0 mmol/L明顯提高，高濃度又呈下降趨勢，可能是因為低濃度的SNP可通過增強葉片抗氧化系統(tǒng)中酶的活性以清除過量的活性氧(ROS)，從而緩解氧化傷害，增強黃秋葵對低溫脅迫的抗性。在較高濃度(1.5～2.0 mmol/L)處理下，SOD、POD、CAT和APX活性顯著降低，這可能是因為植物在低溫脅迫環(huán)境下產生的大量活性氧離子，在未被及時清除之前，當有大量的NO存在時，活性氧離子就會和高濃度SNP釋放的NO生成某種物質，其破壞性遠遠大于活性氧本身的破壞程度，因此，低溫脅迫下如果加入過量外源NO不但不會緩解脅迫對黃秋葵造成的氧化傷害，還會增強促進活性氧對黃秋葵的傷害。這與李美蘭等[28]在南方紅豆杉幼苗上研究認為低濃度促進抗氧化酶活性，高濃度反而抑制的結論相似，但是與李美蘭等[28]認為噴施濃度為0.5和1.0 mmol/L SNP降低了抗氧化酶活性的結果不一致。這可能是由于植物品種、處理方法和脅迫時間等因素的不同而造成的差異。

低溫脅迫條件下，膜脂過氧化物的終產物MDA是衡量蔬菜作物耐低溫的一個重要指標[29]。本研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下3個品種MDA含量顯著增加，其中品種L >H >Y，一定濃度SNP處理能有效抑制低溫脅迫下黃秋葵幼苗MDA的產生，緩解低溫脅迫對幼苗的膜脂過氧化損傷程度。這與已有的研究結果相一致[30-32]。

本試驗結果表明，低溫脅迫處理引起 3個黃秋葵品種SOD、POD和 APX活性均不同程度增加，但不同品種增加幅度不同。這說明抗冷性不同的作物中存在一定的差別。通過分析外源NO對3個品種的抗低溫效果，發(fā)現(xiàn)‘巖黃秋葵’耐寒效果更明顯。因此，建議早春閩西地區(qū)黃秋葵栽培，選用‘巖黃秋葵’等耐低溫能力較強的品種；在低溫寒潮來臨前，可以對葉片進行噴施一定濃度的外源NO來減緩低溫對苗期的傷害，保障黃秋葵的生長。

綜上所述，在低溫脅迫下，噴施適宜濃度外源NO供體SNP可以通過調整自身生長、MDA含量及抗氧化酶活性等來提高黃秋葵幼苗對低溫的適應能力。但是NO作為一種信號分子參與了植物體內起許多重要的生理過程[33-35]，其緩解黃秋葵幼苗低溫脅迫的作用機理尚需要進一步的 研究。