ZmDREB2.7正調(diào)控玉米耐旱性的功能分析

劉升學，常淑杰，劉曉虎，馬 超，秦 峰

(中國農(nóng)業(yè)大學 生物學院，北京 100193)

玉米不僅是重要的糧食作物，同時也是重要的飼料和工業(yè)原料，而且又是對水分脅迫較為敏感的作物[1]。盡管全球玉米種植面積和產(chǎn)量取得了突飛猛進的增長，但是干旱、高鹽堿、極端溫度等非生物逆境嚴重影響玉米產(chǎn)量進一步提高。在諸多環(huán)境脅迫因素中，干旱對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的威脅是最嚴重的一個世界性問題[2]。因此，提高農(nóng)作物尤其是玉米的耐旱性已逐漸成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迫切需求。然而，植物耐逆性屬于復雜數(shù)量性狀，單純依靠傳統(tǒng)的育種手段改善植物的抗逆性，已難以滿足此類性狀遺傳改良的需要，隨著植物分子生物學和基因工程技術的發(fā)展，通過分子設計的手段培育抗旱品種逐漸成為提高作物抗旱性的可能途徑[3-4]。干旱是常見的嚴重影響農(nóng)作物生長發(fā)育及產(chǎn)量的非生物脅迫因子之一，也是目前抗逆分子生物學研究的重要領域之一。在玉米(ZeamaysL.)、水稻(OryzasativaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)、大麥(HordeumvulgareL.)、大豆(Glycinemax)和番茄(Solanumlycopersicum)中的研究表明，DREB/CBF、MYB、NAC、bZIP和WRKY等轉(zhuǎn)錄因子主要參與調(diào)控響應水分脅迫的基因表達[5-9]。諸多轉(zhuǎn)基因研究結果表明，DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子基因無論是在雙子葉和單子葉植物，還是在草本及木本植物的抗逆遺傳改良中均有很好的應用前景[10-13]。

前期通過368份玉米自交系的苗期存活率表型與玉米基因組中18個ZmDREB基因的遺傳變異進行候選基因的關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，ZmDREB2.7基因啟動子區(qū)域的遺傳變異與玉米耐旱性顯著相關[10]。本研究利用ZmDREB2.7玉米轉(zhuǎn)基因材料和近等基因系材料，在正常生長和干旱脅迫條件下，比較轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因材料以及不同近等基因系間耐旱性，分析ZmDREB2.7基因?qū)τ衩渍ＩL和耐旱性的影響，以及不同ZmDREB2.7等位基因型的遺傳效應。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米(ZeamaysL.)自交系A188、玉米ZmDREB2.7轉(zhuǎn)基因材料、玉米自交系CIMBL70、玉米自交系CIMBL92、玉米自交系SHEN5003、ZmDREB2.7近等基因系材料、根癌農(nóng)桿菌(Agrobactriumtumefaciens)菌株EHA105、中間載體質(zhì)粒 pSBⅡ，均由中國農(nóng)業(yè)大學玉米課題組保存。

1.2 載體的構建與鑒定

以耐旱玉米自交系CIMBL70基因組DNA為模板，將ZmDREB2.7基因(～700 bp 啟動子區(qū)及 5′和 3′UTR)通過 PCR 擴增并克隆到載體 pBlueScript ⅡSK的EcoRⅤ位點。經(jīng)測序確認序列正確后，經(jīng)SmaⅠ和HindⅢ酶切后克隆到載體pSBⅡ。將測序和酶切證實的質(zhì)粒與pSBⅠ載體電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，重組后獲得載體 pSBⅢ，進行轉(zhuǎn)化?？寺∫镄蛄衂mDREB2.7-1 F：5′-GTCCGTCAGTCCGTCCTTG-3′,ZmDREB2.7-1 R:5′-CCACGAATAACTAGGAGAAATA-3′，擴增片段長度為2 013 bp；標記基因序列：BAR-F:5′-CAATCCTCGAGTCTACCATGAGCCC-AGAAC-3′和BAR-R:5′-GAATCCTCGAGTC-AAATCTCGGTGACGGGCA-3′，擴增片段長度為500 bp。

1.3 ZmDREB2.7轉(zhuǎn)基因材料的創(chuàng)制

取授粉后10～15 d的A188幼穗剝?nèi)グ~，剝離花絲，先用75%酒精浸泡幼穗15 s，再用 0.1%升汞溶液浸泡10 min；用滅菌的吸水紙吸干幼穗表面的溶液，固定幼穗(例如，從穗子底部將鑷子插入穗芯)，用滅菌刀片削去籽粒頂部60%，挑出幼胚，選擇1～2 mm的幼胚盾片向上排列在培養(yǎng)基上，用于誘導愈傷組織。后續(xù)農(nóng)桿菌菌液的準備、農(nóng)桿菌侵染愈傷組織、抗性愈傷篩選均按照實驗室的操作流程[14]。轉(zhuǎn)基因材料特異鑒定引物ZmDREB2.7-2 F：5′-ACCACCAGACGATGTTCCA-3′和ZmDREB2.7-2 R：5′-GGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGA-CACC-3′，擴增片段長度為850 bp。

1.4 近等基因系的構建與鑒定

選擇攜帶優(yōu)異等位基因型的玉米自交系CIMBL70、CIMBL92與敏感基因型自交系SHEN5003進行雜交，通過連續(xù)回交將其優(yōu)異等位基因型導入輪回母本SHEN5003中，建立兩套耐旱基因的近等基因系(世代BC5F3)。玉米自交系CIMBL70和CIMBL92，攜帶ZmDREB2.7基因的啟動子區(qū)5個顯著位點具有相同的等位基因型，正與SHEN5003相反。利用InDel-21設計引物進行PCR分型，區(qū)分回交單株的ZmDREB2.7基因的等位基因型，ZmDREB2.7-3 F：5′-CGAGGACTGCATTGCTAGCA-3′，ZmDREB2.7-3R:5′-GCGGCGGCACCCGATCCAT-3′，擴增片段長度為70/91 bp。

1.5 ZmDREB2.7轉(zhuǎn)基因和近等基因系植株轉(zhuǎn)錄水平的檢測

從不少于3棵苗中取樣、用液氮速凍，用TRIZOL(北京百泰克生物技術有限公司，Bioteke)法分離出總RNA，緊接著用DNAseⅠ(寶生物(大連)工程有限公司，Takara)法消除基因組的污染，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientific product, USA)測定濃度，統(tǒng)一取5 μg進行 0.8%瓊脂糖膠。取1 μg總RNA，用重組M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(普洛麥格生物技術有限公司，Promega)，以Oligo(dT)23(Promega)為引物，進行cDNAs的合成。采用熒光定量PCR，以ZmUbi-2(UniProtKB/TrEMBL; ACC:Q42415)為內(nèi)參，分析ZmDREB2.7的相對表達量。采用ABI公司的實時熒光定量PCR儀器(Stepone Real-Time PCR System)和寶生物染料法熒光定量試劑盒(TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM)完成。最后，以2-ΔΔCt法計算ZmDREB2.7的相對表達量[10]。ZmDREB2.7-4 F：5′-TATGATGATGATGCACTCC-3′，ZmDREB2.7-4 R:5′-GAG-TTGGAAATGGAATCG-3′;ZmUBI-2-1 F:5′-TGGTTGTGGCTTCGTTGGTT-3′，ZmUBI-2-1 R：5′-GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA-3′。

1.6 近等基因系基因型鑒定

利用CTAB(CTAB提取緩沖液使用前加入1%～2% β-巰基乙醇，并于65 ℃溫浴備用)提取親本和近等基因系基因組，然后通過中玉金標記公司采用Maize56K SNP Array進行掃描。利用Beckman自動工作站進行樣品準備；再通過GeneTitan芯片系統(tǒng)完成后續(xù)的芯片雜交、洗滌、掃描等一系列步驟。

1.7 玉米苗期抗旱表型分析

將玉米播種于基質(zhì)(營養(yǎng)土∶蛭石∶草炭 土=1∶1∶1)，每個小紅缽播種25粒種子，澆足水分在培養(yǎng)間(16 h-光/8 h-暗，28 ℃/22 ℃，空氣濕度60%)進行催芽，7 d后芽出土約2 cm時，選取長勢一致的植株移入方盒中種植。每個方盒裝入2 kg混合均勻的滅菌基質(zhì)(營養(yǎng)土∶蛭石∶草炭土=1∶1∶1)，每個方盒種植6行，每行5株，其中左側(cè)3行為對照，右側(cè)3行為轉(zhuǎn)基因或近等基因系植株。正常條件下生長10 d后開始停止供應水分進行干旱處理。停水約25 d后，當對照的干枯程度與轉(zhuǎn)基因或近等基因系植株出現(xiàn)明顯差異時開始復水，復水3 d后統(tǒng)計各株系的存活率。一般將葉片返綠植株定義為存活植株，將表現(xiàn)為嚴重受旱且無法正常生長的植株定義為死亡植株，存活率為各株系存活植株數(shù)占總植株數(shù)的百分比。試驗至少重復3次，取多次試驗的均值進行苗期存活率的統(tǒng)計分析。

1.8 玉米轉(zhuǎn)基因植株田間試驗

選擇WT(A188)及ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10 T4代純合種子進行田間表型試驗。2018年春，在新疆農(nóng)科院安寧渠試驗場進行玉米轉(zhuǎn)基因材料大田干旱試驗。所有試驗材料于2018-05-15播種，2018-09-10收獲，其種植密度為58 000 株/hm2。試驗田分3個小區(qū)，分別為水區(qū)、干旱-1、干旱-2，為排除小區(qū)之間灌溉的影響，每個小區(qū)之間間隔4 m，并在小區(qū)四周鋪設0.5 m深的隔水層。小區(qū)面積15 m2，每個小區(qū)內(nèi)設3次重復，1行區(qū)，3 m行長，行距50 cm，株距25 cm，雙粒播保證齊苗(13株/行)。水區(qū)在玉米的整個生育期內(nèi)正常灌溉；干旱-1則在玉米正常生長29 d后停止供水，并在玉米吐絲期(R1期)增加1次灌水；干旱-2則在玉米正常生長15 d后停水供水，并在玉米V7、R1期增加兩次灌水。干旱-1和干旱-2供水水量分別為水區(qū)的60%、40%[14]。

1.9 統(tǒng)計分析方法

通過Excel 2016記錄和整理試驗數(shù)據(jù)。使用SPSS軟件(版本17.0)進行數(shù)據(jù)的單因素方差分析和Duncan’s多重比較。

2 結果與分析

2.1 ZmDREB2.7近等基因系的構建和遺傳背景恢復率分析

為比較不同的ZmDREB2.7等位基因的效應，選擇2個耐旱型玉米自交系(CIMBL70和CIMBL92)與敏感自交系(SHEN5003)雜交，再連續(xù)回交導入輪回母本SHEN5003中，通過特異PCR輔助選擇，建立兩套耐旱基因的近等基因系。通過Maize56K SNP Array進行掃描，結果如圖1所示，NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的ZmDREB2.7均恢復到優(yōu)異等位基因型。NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92遺傳背景恢復率分別是94.96% 和95.11%，其中7號染色體遺傳背景恢復率低于平均值，分別是73.64%和73.48%。

2.2 ZmDREB2.7近等基因系的苗期耐旱性鑒定

為了比較ZmDREB2.7不同等位基因型的耐旱性，采用盆栽法進行室內(nèi)苗期存活率試驗(圖2-A)，同時檢測了用于表型試驗的穗子的基因型(圖2-B)和表達量(圖2-C)。NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的表達量均顯著高于輪回親本SHEN5003。NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的存活率分別是81.34%和83.33%，顯著高于SHEN5003(37.3%，圖2-D)。

2.3 玉米轉(zhuǎn)基因的苗期耐旱性表型評價

本研究利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化玉米自交系A188幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化體系將ZmDREB2.7基因?qū)階188基因型玉米中，通過特異PCR檢測和連續(xù)自交后，獲得T4代純合株系。采用盆栽法進行室內(nèi)苗期存活率試驗(圖3-A)，同時檢測了用于表型試驗的穗子的葉片表達量(圖3-B)。ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10的相對表達量顯著高于野生型(A188，圖3-B)。干旱處理后，兩個純合株系ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10存活率分別是68.05%和70.83%，顯著高于A188(58.33%，圖3-C)。

2.4 玉米轉(zhuǎn)基因田間耐旱性表型評價

在大田試驗條件下，檢測A188和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10在干旱處理條件下的耐受性(圖4)。在正常澆水條件下(WW)，ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10的單株產(chǎn)量顯著高于野生型(A188)，小區(qū)產(chǎn)量無顯著差異。在干旱-1處理條件下(輕度干旱)，ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 比野生型的小區(qū)產(chǎn)量少減產(chǎn) 37.36%。在干旱-2處理條件下(極端干旱)，ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10比野生型的小區(qū)產(chǎn)量少減產(chǎn)22.54%。

3 討 論

在植物響應干旱脅迫方面，DREB類轉(zhuǎn)錄因子起著重要作用，但是關于這些基因的自然變異是否直接影響植物的耐旱性的報道很少?；卮疬@個問題，不僅需要剖析DREB基因的生物學機理，更需要抗逆基因工程中的應用。分子標記輔助選擇一般利用分子標記選擇育種材料的目標區(qū)域，同時篩選全基因組，減少連鎖累贅，從而加速獲得符合預期的新材料。例如，利用AC7643作為耐旱性的優(yōu)良供體親本，改良輪回親本CML247，通過2輪回交和2輪自交，最后評價改良的CML247分別與CML254和CML274測交系組配的雜交種的耐旱性，比對照和測交種更好，這也是耐旱分子標記輔助選擇育種典型應用案例[15]。利用攜帶的ZmVPP1耐旱基因型自交系CIMBL70和CIMBL91為供體親本，以攜帶敏感基因型的自交系SHEN5003為輪回親本，經(jīng)過4輪回交和2輪自交的后，NIL-ZmVPP1CIMBL70和 NIL-ZmVPP1CIMBL91的存活率較NIL-ZmVPP1SHEN5003顯著提升了30%[14]。本研究構建了ZmDREB2.7的近等基因系材料，在實際生產(chǎn)中評價其優(yōu)異等位基因型的應用價值。試驗結果表明，NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的ZmDREB2.7基因型均回復到優(yōu)異等位基因型，遺傳背景恢復率分別是 94.96%和95.11%，表達量均顯著高于輪回親本SHEN5003，存活率分別是81.34%和83.33%，顯著高于SHEN5003(圖2)。分子標記輔助選擇和轉(zhuǎn)基因方法一定程度上加快了育種進程，但如何高效利用少數(shù)主效抗性基因到育種實踐中，實現(xiàn)分子設計育種還是科學家共同需要面臨的難題。利用CRISPR/Cas9技術已經(jīng)可以實現(xiàn)負效應基因的定點敲除，或者染色體的大片段缺失，或者不良性狀相關基因簇的快速敲除，從而大大提高農(nóng)作物目標性狀定向改良效率。

在抗逆基因工程中，啟動子的選擇一直是轉(zhuǎn)基因工程的瓶頸，因此科學家一直努力鑒定和利用受脅迫誘導的啟動子。例如，Shinozaki試驗室將DREB1A置入35S(constitutive cauliflower mosaic virus(CaMV35S)和rd29A啟動子下轉(zhuǎn)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株可以提高植物的抗性；正常條件下，組成型表達DREB1A的轉(zhuǎn)基因煙草株系生長發(fā)育延遲、植株矮小，然而rd29A的啟動子調(diào)控的DREB1A的轉(zhuǎn)基因煙草株系生長旺盛且耐逆性增強[16]。本研究中，ZmDREB2.7轉(zhuǎn)基因材料用的自身啟動子，顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的ZmDREB2.7的表達量。轉(zhuǎn)基因玉米材料ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10存活率分別是68.05%和70.83%，均顯著高于野生型(A188，58.33%)。更重要的是，在2018年新疆大田試驗中，2.7-1和2.7-10兩個株系均表現(xiàn)較強的耐旱性，在干旱條件下，小區(qū)少減產(chǎn)20%以上。本試驗中獲得的轉(zhuǎn)基因材料目前沒開展基因上游和下游方面的相關研究。如果能進一步分析相關的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡系統(tǒng)，深入探索具體調(diào)控細節(jié)，解析出抑制環(huán)節(jié)和促進環(huán)節(jié)，再利用遺傳操作技術進行精準改良，相信會獲得較好的效果。

4 結 論

本試驗構建了不同等位基因型的近等基因系材料和自身啟動子驅(qū)動表達ZmDREB2.7的玉米轉(zhuǎn)基因材料。在苗期存活率試驗和大田表型調(diào)查中，ZmDREB2.7基因可以顯著提高玉米苗期的耐旱性、未降低產(chǎn)量，因此該基因是較重要的苗期耐旱基因資源。本試驗不足之處在于僅在玉米苗期而未在其他生育時期進行研究，希望以后對玉米的各個生育時期進行試驗研究并綜合分析進而篩選出更重要的抗旱基因。