表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體在膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展△

郭奕卓，劉芳

1大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 大連 116044

2南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 常州 213000

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，多呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以完全切除，放化療效果不理想且易復(fù)發(fā)，患者的中位生存期僅為15個(gè)月。與其他腫瘤一樣，膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多步驟演變的復(fù)雜過(guò)程[1]。研究顯示，40%～50%的膠質(zhì)瘤患者存在表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）異常表達(dá)，原發(fā)性膠質(zhì)瘤中除伴有不同程度的EGFR過(guò)表達(dá)外，約1/3還存在EGFR突變[2]，其中，最常見的突變形式是表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體（epidermal growth factor receptor variantⅢ，EGFRvⅢ），占25%～64%[3-4]。目前，EGFR過(guò)表達(dá)、突變與非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、食管癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等過(guò)程密切相關(guān)，但對(duì)于EGFR、EGFRvⅢ與膠質(zhì)瘤間關(guān)系的研究較少，本文對(duì)近年來(lái)EGFRvⅢ在膠質(zhì)瘤中表達(dá)及與患者治療、預(yù)后間的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 EGFR與EGFRvⅢ的關(guān)系

EGFR是受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族成員，普遍表達(dá)于人體表皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞[5]，由3個(gè)功能區(qū)組成，分別為胞外配體連接區(qū)、單鏈跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)[6]。在細(xì)胞存活、增殖、代謝、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7-8]。Downward等[8]研究發(fā)現(xiàn)，人類EGFR與v-erbB間高度同源，Schechter等[9]從乙基亞硝基脲誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤中分離出NEU基因，發(fā)現(xiàn)NEU是一個(gè)大鼠erbB-2基因，可在跨膜結(jié)構(gòu)域中單點(diǎn)突變。上述兩項(xiàng)研究為EGFR異常表達(dá)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子機(jī)制提供了有價(jià)值的參考。EGFRvⅢ屬于EGFR胞外區(qū)框內(nèi)缺失性突變，其胞外的2～7號(hào)外顯子缺失，導(dǎo)致801對(duì)堿基缺失，使外顯子1和8相連并融合產(chǎn)生一個(gè)新的氨基酸——甘氨酸，這也為膠質(zhì)瘤靶向治療提供了一個(gè)重要靶點(diǎn)，即利用EGFRvⅢ單抗來(lái)特異性識(shí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞[10]，后文也將對(duì)此進(jìn)行詳細(xì)介紹。EGFRvⅢ失去了連接配體的功能，但卻可在不依賴配體的情況下參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，同時(shí)，EGFRvⅢ還可以縮小黏著斑的大小并減少其數(shù)量，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。還有研究發(fā)現(xiàn)，EGFRvⅢ的內(nèi)在信號(hào)可以通過(guò)細(xì)胞因子串聯(lián)傳播到野生型EGFR細(xì)胞，從而進(jìn)一步導(dǎo)致黏附減少和遷移增加[11]。

2 EGFRv Ⅲ在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

Werner等[12]采用免疫組化法發(fā)現(xiàn)，健康者星形細(xì)胞中檢測(cè)不到EGFR的表達(dá)，但在膠質(zhì)瘤中表達(dá)明顯上調(diào)。Reifenberger等[13]報(bào)道顯示，EGFR在低級(jí)別膠質(zhì)瘤[世界衛(wèi)生組織（WHO）分級(jí)為Ⅰ、Ⅱ級(jí)]中的表達(dá)率為9%，而在高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHO分級(jí)為Ⅲ、Ⅳ級(jí)）中為79%；EGFR在低級(jí)別星形細(xì)胞瘤（Ⅱ級(jí)）、間變性星形細(xì)胞瘤（Ⅲ級(jí)）、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Ⅳ級(jí)）中表達(dá)率分別為67%、87%和100%，提示EGFR的表達(dá)在星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。呼鐵民和孫影[14]利用免疫印跡法研究證實(shí)，EGFR蛋白的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。

EGFR表達(dá)的同時(shí)往往伴隨其突變，但這是一個(gè)容易被低估的潛在因素。對(duì)癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，EGFR在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中突變率為23%，其中EGFRvⅢ約占24%，雖然這可能歸因于不同患者群體和更深的測(cè)序深度，但這或許能夠解釋某些快速進(jìn)展的低級(jí)別膠質(zhì)瘤（由組織病理學(xué)診斷）的潛在發(fā)病機(jī)制，即這些膠質(zhì)瘤本質(zhì)上可能是分子水平上的高級(jí)別膠質(zhì)瘤。一項(xiàng)納入117例膠質(zhì)瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，51%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、23%的星形細(xì)胞瘤和31%的間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者中EGFRvⅢ呈陽(yáng)性，該團(tuán)隊(duì)的早期試驗(yàn)也曾發(fā)現(xiàn)，在所有級(jí)別的膠質(zhì)瘤中，近34.5%的腫瘤細(xì)胞存在EGFRvⅢ，這足以使臨床重點(diǎn)關(guān)注EGFRvⅢ在膠質(zhì)瘤治療中的作用[4]。

3 EGFRvⅢ與膠質(zhì)瘤免疫治療

3.1 單克隆抗體

目前，腫瘤的分子靶向治療不斷發(fā)展，其使用價(jià)值已被廣泛認(rèn)可，其主要通過(guò)藥物阻斷腫瘤發(fā)生發(fā)展的下游信號(hào)通路，進(jìn)而抑制機(jī)體對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用，控制腫瘤進(jìn)展，延長(zhǎng)患者的生存期[11]。目前，EGFRvⅢ單抗類靶向藥物主要包括西妥昔單抗、貝伐珠單抗等。Jutten等[15]的研究表明，西妥昔單抗可與EGFRvⅢ結(jié)合，導(dǎo)致EGFRvⅢ初始激活、內(nèi)化和繼發(fā)性下調(diào)。一項(xiàng)研究探討Rindopepimut聯(lián)合貝伐珠單抗治療的復(fù)發(fā)性EGFRvⅢ陽(yáng)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的隨機(jī)、雙盲、Ⅱ期臨床試驗(yàn)，入組條件包括組織學(xué)確診的原發(fā)或復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、聚合酶鏈反應(yīng)證實(shí)EGFRvⅢ陽(yáng)性且未接受過(guò)貝伐珠單抗或其他血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）抑制劑治療，結(jié)果共入組73例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，其中36例治療組患者接受Rindopepimut+貝伐珠單抗治療，37例對(duì)照組患者接受鑰孔血藍(lán)蛋白+貝伐珠單抗治療，通過(guò)定期MRI檢查評(píng)估腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)及進(jìn)展情況，以6個(gè)月無(wú)進(jìn)展生存率為主要研究終點(diǎn)，結(jié)果顯示，治療組與對(duì)照組患者的6個(gè)月無(wú)進(jìn)展生存率分別為28%和16%，而作為次要終點(diǎn)的總生存率也是治療組顯著較高（HR=0.53，95%CI：0.32～0.88，P=0.01），客觀緩解率（objective response rate，ORR）分別為30%和18%，治療組患者的抗EGFRvⅢ抗體滴度較基線明顯升高[16]，表明貝伐珠單抗聯(lián)合Rindopepimut對(duì)EGFRvⅢ陽(yáng)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者有一定的治療價(jià)值。

3.2 腫瘤疫苗

抗腫瘤治療的抗體既可以是單克隆抗體，也可以是抗原刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性抗體，即主動(dòng)免疫治療。大多數(shù)表征良好的腫瘤抗原是過(guò)表達(dá)的正常蛋白，在一定程度上觸發(fā)了機(jī)體的免疫耐受，若有效地靶向此類過(guò)表達(dá)的蛋白，可損害其抗腫瘤排斥抗原的有效性，并帶來(lái)自身免疫風(fēng)險(xiǎn)[17]，但EGFRvⅢ這一框內(nèi)缺失突變可使密碼子分裂，在融合連接處產(chǎn)生新的甘氨酸，從而產(chǎn)生在任何健康成年患者組織中均未發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性表位[18]。Heimberger和Sampson[19]研究證實(shí)，在同基因鼠模型中接種針對(duì)EGFRvⅢ的PEP-3-KLH（CDX-110）疫苗是一種有效的免疫治療方法，隨即開展的臨床試驗(yàn)將PEP-3-KLH加載到自體樹突狀細(xì)胞中進(jìn)行接種，未進(jìn)行EGFRvⅢ檢測(cè)患者的總生存期（overall survival，OS）為22.8個(gè)月，通過(guò)EGFRvⅢ陽(yáng)性篩選患者的OS為26個(gè)月。一項(xiàng)PEP-3-KLH疫苗聯(lián)合替莫唑胺化療治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的臨床試驗(yàn)中，患者的中位OS達(dá)到33個(gè)月[19]。這項(xiàng)研究雖然結(jié)果令人驚喜，但EGFRvⅢ的腫瘤疫苗研究之路仍然漫長(zhǎng)，如針對(duì)EGFRvⅢ的組織相容性復(fù)合體的輔助表位尚未得到驗(yàn)證，進(jìn)而導(dǎo)致不能精準(zhǔn)制備四聚體。

3.3 T細(xì)胞療法

膠質(zhì)瘤的免疫治療除主動(dòng)和被動(dòng)免疫外，基于T細(xì)胞的過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移（adoptive cell transfer，ACT）療法，是從腫瘤患者體內(nèi)分離免疫活性細(xì)胞，于體外進(jìn)行功能鑒定并擴(kuò)增，然后回輸患者體內(nèi)，從而直接殺傷腫瘤細(xì)胞或激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細(xì)胞，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[19-20]。目前，嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細(xì)胞療法已被證實(shí)對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤有效，但在實(shí)體瘤特別是膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用仍處于早期階段[3]。對(duì)于成功的CAR-T定向治療，理想的靶標(biāo)應(yīng)均勻地出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞表面，而不表達(dá)于正常組織中，靶向EGFRvⅢ的CAR-T細(xì)胞能夠抑制體外和表達(dá)該變異體小鼠顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。基于眾多臨床前研究，Goff等[3]進(jìn)行了一項(xiàng)先導(dǎo)性臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示，靶向EGFRvⅢ的自體CAR-T細(xì)胞ACT療法并不能緩解膠質(zhì)瘤進(jìn)展，且在延長(zhǎng)患者生存期方面暫時(shí)沒有明顯成果。由于CAR靶標(biāo)僅局限于細(xì)胞表面表達(dá)的抗原，因此，大量來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)蛋白的腫瘤特異性新抗原推動(dòng)了基于T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）療法的發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)限制性表位，并從中克隆了可轉(zhuǎn)導(dǎo)至TCR的α-鏈和β-鏈的互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），這種特異的TCR-T細(xì)胞可以在體外以抗原和人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）特異性的方式有效殺死對(duì)應(yīng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞[21]。此外，當(dāng)用于ACT研究時(shí)，這些TCR-T細(xì)胞還抑制了小鼠顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植的進(jìn)展[22]。但目前尚無(wú)針對(duì)EGFRvⅢ突變的TCR-T細(xì)胞的體外或動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，且由于TCR-T在患者中的有效性可能還需要保證HLA的表達(dá)，但基于EGFRvⅢ表達(dá)產(chǎn)生的特殊結(jié)構(gòu)，這種方法未來(lái)仍有可能會(huì)是研究熱點(diǎn)。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）可能是膠質(zhì)瘤患者T細(xì)胞的可行來(lái)源[21，23-24]，Brennan等[25]描述了穩(wěn)定擴(kuò)增TIL的方法，該TIL可與自體膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)：首先進(jìn)行腫瘤DNA外顯子組測(cè)序，并隨后對(duì)TIL定義的腫瘤相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行分析，該研究使用自體建立的腫瘤細(xì)胞系測(cè)試腫瘤細(xì)胞，仍需將病灶中腫瘤細(xì)胞的多樣性考慮其中。相關(guān)研究表明，EGFRvⅢ陽(yáng)性膠質(zhì)瘤患者膠質(zhì)瘤組織中CD8+TIL浸潤(rùn)程度明顯上升[26]，因此，分離EGFRvⅢ陽(yáng)性膠質(zhì)瘤患者中的CD8+TIL、行體外擴(kuò)增和體外殺傷實(shí)驗(yàn)可能成為今后的研究方向。

4 EGFRv Ⅲ與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，EGFRvⅢ表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)。但Heimberger和Sampson[19]認(rèn)為，EGFR/EGFRvⅢ不能獨(dú)立預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的OS，但對(duì)于OS超過(guò)1年的患者，EGFRvⅢ的表達(dá)是一個(gè)獨(dú)立且顯著的負(fù)性預(yù)后指標(biāo)。也有研究提示，EGFRvⅢ擴(kuò)增與患者的預(yù)后無(wú)關(guān)[27]。Pelloski等[28]指出，標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后因素不能預(yù)測(cè)EGFRvⅢ陽(yáng)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后，這也可能與部分學(xué)者對(duì)EGFRvⅢ表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響持不同意見有關(guān)。

已有研究表明，在新診斷和復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了CD4+TIL、CD8+TIL等，且TIL的數(shù)量被證實(shí)與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后呈正相關(guān)[23]。某些基因突變會(huì)影響膠質(zhì)瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，Hao和Guo[1]研究顯示，EGFRvⅢ低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中CD8+TIL、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)程度更高，患者的預(yù)后更差，并因此提出了新的潛在預(yù)測(cè)預(yù)后和免疫微環(huán)境的標(biāo)志物，為評(píng)估EGFRvⅢ低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后提供了新思路。

5 小結(jié)與展望

自1984年Libermann等首次報(bào)道EGFR在腦膠質(zhì)瘤中過(guò)表達(dá)以來(lái)，多數(shù)學(xué)者對(duì)膠質(zhì)瘤中EGFR的表達(dá)情況及與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展、治療的關(guān)系進(jìn)行了研究。EGFR的表達(dá)促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，EGFR過(guò)表達(dá)和突變情況決定著膠質(zhì)瘤的惡性程度，并直接影響患者對(duì)放療的敏感性。目前，針對(duì)EGFRvⅢ的多種膠質(zhì)瘤免疫治療在臨床前研究有所進(jìn)展，其在臨床應(yīng)用研究中仍任重道遠(yuǎn)，但關(guān)于貝伐珠單抗聯(lián)合Rindopepimut、PEP-3-KLH疫苗等研究所取得的成果為膠質(zhì)瘤的治療帶來(lái)了希望，同時(shí)，EGFRvⅢ陽(yáng)性患者的ACT療法可能成為未來(lái)膠質(zhì)瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)。EGFRvⅢ的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，對(duì)于那些不一致的研究結(jié)果，可能與檢測(cè)方法、操作手法、臨床資料完整性等有關(guān)，也間接說(shuō)明了膠質(zhì)瘤異質(zhì)性、治療困難等特點(diǎn)。因此，需要進(jìn)行多中心、大樣本的研究去闡明EGFRvⅢ對(duì)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，這也可能成為未來(lái)主要的努力方向。