環(huán)狀RNA的研究現(xiàn)狀及其與結(jié)直腸癌的相關(guān)性

宋偉 袁文正 任俊 付濤

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是由特定的反向剪接機(jī)制形成[1]。近年來，高通量RNA測序和生物信息學(xué)算法已經(jīng)在真核生物中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種環(huán)狀RNA，其中一些具有明確的生物功能[2]。與線性RNA不同，環(huán)狀RNA不是由經(jīng)典的剪接模式產(chǎn)生，而是通過反向剪接產(chǎn)生。雖然反向剪接的效率通常比線性剪接低，但是環(huán)狀RNA具有很高的穩(wěn)定性，可以以時(shí)間調(diào)節(jié)的方式在特定的細(xì)胞類型中累積[3]。此外，盡管環(huán)狀RNA通常表達(dá)的水平低于其線性mRNA，但對于許多基因而言，環(huán)狀RNA是主要的轉(zhuǎn)錄物[4]，這表明一些蛋白質(zhì)編碼基因的主要功能可能是產(chǎn)生環(huán)狀RNA，而不是線性mRNA或蛋白質(zhì)。環(huán)狀RNA的生成有多種途徑，常見形成機(jī)制包括剪接體介導(dǎo)的環(huán)化、內(nèi)含子配對介導(dǎo)的環(huán)化及RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的環(huán)化等[5-7]。研究表明，環(huán)狀RNA具有多種功能，主要包括作為miRNA的海綿、與蛋白質(zhì)相互作用、翻譯功能以及調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄[8-10]。

一、環(huán)狀RNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)譜

RNA測序和環(huán)狀RNA微陣列是環(huán)狀RNA全基因組分析的最常用方法。環(huán)狀RNA表達(dá)譜的鑒定是判定其作為促癌基因或抑癌基因的前提。結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)病人的組織、細(xì)胞、外泌體中已鑒定出數(shù)千種環(huán)狀RNA。Zheng等[11]通過基因芯片分析10例結(jié)腸癌及癌旁組織中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜，共發(fā)現(xiàn)126個(gè)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，其中有110個(gè)上調(diào)的環(huán)狀RNA和16個(gè)下調(diào)的環(huán)狀RNA。這些環(huán)狀RNA大多位于外顯子區(qū)域。Li等[12]通過對4對CRC及癌旁組織進(jìn)行環(huán)狀RNA測序，共測到21 458個(gè)環(huán)狀RNA。經(jīng)過P值和FC篩選后，鑒定出448個(gè)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA(394個(gè)上調(diào)環(huán)狀RNA和54個(gè)下調(diào)環(huán)狀RNA)，其中有15個(gè)環(huán)狀RNA為首次發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA。他們對其中10個(gè)在20對CRC組織中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，circASPHD1、circHOMER1、circAPLP2、circVAPA和circTRAPPC9表達(dá)上調(diào)，circPRKAG2、circITFG2、circDDX17、circTRPM4和circLMF1表達(dá)下調(diào)，與測序結(jié)果一致。最后，通過對差異倍數(shù)最大的環(huán)狀RNA并結(jié)合KEGG通路分析，將circDDX17作為候選基因，進(jìn)行后續(xù)的功能研究。同樣，Chen等[13]通過對CRC芯片分析發(fā)現(xiàn)38個(gè)環(huán)狀RNA，挑選其中9個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的環(huán)狀RNA作為候選對象。在97例CRC病人的腫瘤及癌旁組織中進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，circNSUN2在CRC組織中表達(dá)明顯上調(diào)。此外，與沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和正常對照的CRC病人相比，存在肝轉(zhuǎn)移(liver metastasis,LM)的CRC病人血清中circNSUN2水平也明顯升高。

研究表明，外泌體是傳遞miRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)以及環(huán)狀RNA進(jìn)行細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體[14]。Dou等[15]在三種結(jié)腸癌細(xì)胞系分泌的外泌體中檢測到環(huán)狀RNA，并且環(huán)狀RNA在細(xì)胞外囊泡中比在細(xì)胞中更豐富。Xie等[16]通過對50份CRC和50份正常對照血清外泌體樣品進(jìn)行RNA序列分析，鑒定出1 924個(gè)CRC相關(guān)的環(huán)狀RNA。根據(jù)FC和P值，共篩選出122個(gè)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，包括100個(gè)上調(diào)的環(huán)狀RNAs和22個(gè)下調(diào)的環(huán)狀RNAs。

二、環(huán)狀RNA與CRC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

有研究表明，環(huán)狀RNA可以作為促癌或抑癌基因調(diào)控CRC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。相關(guān)機(jī)制包括環(huán)狀RNA作為miRNA海綿、與蛋白質(zhì)結(jié)合以及編碼多肽等。

1.環(huán)狀RNA作為CRC致瘤基因：CiRS-7，也稱為CDT1as，是由CDR1基因的反義轉(zhuǎn)錄物通過反向剪接而來。研究最多的是它作為miR-7的海綿功能。在CRC，ciRS-7通過拮抗miR-7介導(dǎo)的EGFR/RAF1/MAPK通路而發(fā)揮致癌作用。過表達(dá)ciRS-7可以抵消miR-7對CRC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用，減少miR-7誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在體外，ciRS-7減弱了miR-7對EGFR和RAF1的抑制作用。同樣，ciRS7也減弱了miR-7對Erk磷酸化的抑制作用。因此，證實(shí)ciRS-7-miR-7-EGFR/RAF1/MAPK調(diào)控軸在CRC進(jìn)展中的作用[17]。同樣，hsa_circ_101555通過hsa_circ_101555-miR-597-5p-CDK6/RPA3軸影響CRC的進(jìn)展。hsa_circ_101555在CRC組織和細(xì)胞系表達(dá)升高，且與臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)。沉默hsa_circ_101555可以抑制CRC細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)受損。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，hsa_circ_101555作為miR-597-5p內(nèi)源競爭性RNA上調(diào)CDK6和RPA3的表達(dá)水平，從而促進(jìn)CRC的進(jìn)展[18]。CircHIPK3來源于HIPK3基因2號外顯子，其剪切成熟序列長度為1099核苷酸。circHIPK3在CRC組織和細(xì)胞系中明顯上調(diào)。敲低circHIPK3可以顯著抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)凋亡，且可以抑制體內(nèi)CRC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和RNA pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)circHIPK3作為miR-7的海綿。circHIPK3有效地逆轉(zhuǎn)了miR-7對CRC細(xì)胞惡性表型的抑制。circHIPK3敲低聯(lián)合miR-7過表達(dá)比單獨(dú)敲低circHIPK3或過表達(dá)miR-7對腫瘤抑制的效果更好[19]。

環(huán)狀RNA除了作為miRNA的海綿，還可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，甚至編碼多肽。在CRC中，尤其是在有LM的CRC中，circNSUN2的表達(dá)水平升高。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，敲低circNSUN2可以明顯抑制CRC細(xì)胞侵襲和遷移。RNA pull-down及RNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明，circNSUN2的CAUCAU基序通過KH3-4雙結(jié)構(gòu)域與IGF2BP2蛋白結(jié)合。circNSUN2可以促進(jìn)IGF2BP2與HMGA2 mRNA之間的相互作用，并通過circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA-蛋白三元復(fù)合物的形成來增強(qiáng)HMGA2穩(wěn)定性，促進(jìn)CRC的轉(zhuǎn)移[13]。CircPPP1R12A是由PPP1R12A基因24和25外顯子反向剪接形成。過表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)表明，circPPP1R12A在結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮了重要作用。通過生信分析預(yù)測，circPPP1R12A可以編碼一個(gè)含有73氨基酸的蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)證明，circPPP1R12A確實(shí)可以編碼蛋白質(zhì)。進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，circPPP1R12A-73aa可以促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖、遷移和侵襲。circPPP1R12A-73aa通過激活Hippo-YAP信號通路促進(jìn)了結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[11]。Zhi等[20]發(fā)現(xiàn)circLgr4在CRC組織中表達(dá)升高，且與非轉(zhuǎn)移性腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性腫瘤circLgr4表達(dá)更高。敲低circLgr4可以抑制CRC干細(xì)胞的自我更新、CRC的發(fā)生和侵襲，而circLgr4過表達(dá)則起相反的作用。通過蛋白質(zhì)免疫印跡和共聚焦檢測等證實(shí)了circLgr4具有編碼多肽的能力，且circLgr4編碼多肽在腫瘤干細(xì)胞維持、自我更新和侵襲中起著至關(guān)重要的作用。circLgr4編碼的多肽可以作用并激活Lgr4，從而進(jìn)一步促進(jìn)Wnt/β-catenin信號的激活。

2.環(huán)狀RNA作為CRC抑癌基因：CircITGA7是由ITGA7第4外顯子反向拼接形成。circITGA7在CRC組織及細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。circITGA7過表達(dá)可以抑制CRC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，相反，敲低circITGA7可促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖和遷移。通過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)，circITGA7通過吸附miR-370-3p，上調(diào)神經(jīng)纖維蛋白1(NF1)抑制Ras信號通路。此外，他們還研究了circITGA7的上游機(jī)制，發(fā)現(xiàn)circITGA7可以通過Ras途徑抑制RREB1，從而上調(diào)其宿主基因ITGA7的轉(zhuǎn)錄[21]。Shen等[22]發(fā)現(xiàn)沉默circ_0026344增加了CRC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并增加了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，而過表達(dá)circ_0026344導(dǎo)致相反的結(jié)果。機(jī)制上，circ_0026344過表達(dá)可以明顯下調(diào)Wnt/β-catenin途徑中核心蛋白的表達(dá)水平，而miR-183 mmic可以逆轉(zhuǎn)circ_0026344過表達(dá)對Wnt/β-catenin通路的抑制作用。circDDX17是由DDX17基因第2-8外顯子構(gòu)成，其長度約927堿基。circDDX17表達(dá)水平在CRC組織及細(xì)胞系中明顯下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)表明，沉默circDDX17可以促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及抑制細(xì)胞凋亡[12]。Jin等[23]表明hsa_circ_0000523在不同的CRC細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)。敲低hsa_circ_0000523可以促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡。hsa_circ_0000523通過海綿吸附miR-31 增加DDK1表達(dá)，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，抑制CRC的進(jìn)展。

3.環(huán)狀RNA可以作為CRC潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物：盡管環(huán)狀RNA的研究尚處于起步階段，但是環(huán)狀RNA的一些特性表明它們可能是癌癥和其他疾病的潛在有價(jià)值的生物標(biāo)志物。首先，缺乏5＇或3＇末端使得環(huán)狀RNA對RNase具有高度抗性。其次，它們通常以組織和發(fā)育階段的特定方式表達(dá)，最后，它們在各種組織和體液中含量豐富，包括血液、尿液、外泌體，使其成為理想的液體活檢生物標(biāo)志物。

近年來，越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA可以作為CRC的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。Wang等[24]表明，hsa_circ_0000567在CRC組織中表達(dá)下調(diào)。hsa_circ_0000567 ROC曲線的AUC為0.865 3，其敏感性和特異性分別為0.833 3和0.764 7。此外，他們還發(fā)現(xiàn)CRC病人血液外泌體中的hsa_circ_0000567表達(dá)也下調(diào)了，表明hsa_circ_0000567可以作為CRC的診斷標(biāo)志物。Pan等[25]發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，CRC病人血清外泌體中hsa-circ-0004771表達(dá)明顯升高,其AUC為0.88，其敏感性和特異性分別為80.91%和82.86%。在CRC術(shù)后病人的血清中觀察到hsa-circ-0004771的表達(dá)下調(diào)了，表明hsa-circ-0004771可以作為CRC病人診斷標(biāo)志物。Xu等[26]表明circRNA_0001178和circRNA_0000826在CRC肝轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)顯著上調(diào)。ROC曲線表明，circRNA_0001178和circRNA_0000826的AUC分別為0.945和0.816，表明它們具有診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的潛力。同樣，Lin等[27]研究表明，三個(gè)環(huán)狀RNA(circ-CCDC66、circ-ABCC1和circ-STIL)表達(dá)水平在CRC病人的血漿中均顯著降低。ROC曲線顯示，這一組環(huán)狀RNA的AUC值為0.780，高于傳統(tǒng)的癌胚抗原和糖類抗原19-9等蛋白質(zhì)標(biāo)志物。此外，將環(huán)狀RNA與CEA和CA19-9結(jié)合使用可能會(huì)提高診斷CRC的能力(AUC=0.855)。Xie等[16]揭示，與對照組相比，CRC病人的血清外泌體中hsa_circ_0101802(circPNN)表達(dá)水平顯著升高。ROC曲線表明，在實(shí)驗(yàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中的AUC分別為0.855和0.826，表明circPNN在診斷CRC中具有重要價(jià)值。此外，早期CRC血清外體circPNN的AUC為0.854，提示血清外體circPNN可能是CRC早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。

ciRS-7已被認(rèn)為是多種腫瘤的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，包括結(jié)直腸癌。Weng等[17]表明ciRS-7在CRC中表達(dá)升高，且與腫瘤的分期、浸潤的深度、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。單變量和多變量分析表明，ciRS-7是CRC獨(dú)立預(yù)后因子。另一項(xiàng)研究表明，circHIPK3在CRC組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和進(jìn)展分期相關(guān)。此外，多變量生存分析表明，circHIPK3高表達(dá)與CRC病人低總生存期密切相關(guān)，表明circHIPK3為CRC的獨(dú)立預(yù)后因素[19]。Jin等[28]觀察到CRC組織中hsa_circ_0005075的表達(dá)顯著上調(diào)，多變量分析表明，hsa_circ_0005075高表達(dá)的CRC病人有著更短的總生存期和無病生存期。同樣，Chen等[29]的研究表明，circ001971為CRC病人總生存期的獨(dú)立因素，具有良好的預(yù)后能力(AUC=0.792)。

三、結(jié)論和展望

環(huán)狀RNA參與CRC的各種生理和病理過程，包括增殖、凋亡、侵襲和遷移等。研究最多的功能是環(huán)狀RNA可以作為miRNA的海綿，其他功能還包括與蛋白質(zhì)作用、調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯。此外，由于環(huán)狀RNA本身的特性，環(huán)狀RNA作為CRC診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，甚至新的治療靶點(diǎn)具有巨大的潛力。越來越多的環(huán)狀RNA研究已經(jīng)揭示了環(huán)狀RNA生物發(fā)生和調(diào)節(jié)的核心內(nèi)容，但要了解這些分子在健康組織和疾病中的調(diào)控和功能，仍需要進(jìn)行更加深入的功能研究。例如，在特定細(xì)胞類型中，尤其在單細(xì)胞水平上，確定空間和時(shí)間環(huán)狀RNA的表達(dá)模式。此外，通過將過表達(dá)與CRISPR-Cas9敲除環(huán)狀RNA結(jié)合起來，未來可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多環(huán)狀RNA的功能。

綜上所述，近幾年環(huán)狀RNA的研究為我們帶來很多重大的發(fā)現(xiàn)，意味著環(huán)狀RNA具有重要的生物學(xué)意義。隨著RNA技術(shù)的穩(wěn)步發(fā)展，進(jìn)一步了解環(huán)狀RNA定位、運(yùn)輸、降解、單細(xì)胞分析及環(huán)狀RNA的表觀修飾等可能是未來發(fā)展的方向。