再生障礙性貧血動物模型研究進(jìn)展

黃曉桃 石博文 吳云霞△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬湖北省婦幼保健院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430070 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理系，武漢 430030

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)，是一組造血組織功能衰竭綜合征，其發(fā)病機(jī)制與造血干細(xì)胞損傷、造血微環(huán)境受損、免疫功能異常特別是T細(xì)胞功能亢進(jìn)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞直接殺傷骨髓造血干細(xì)胞以及淋巴因子介導(dǎo)的造血干細(xì)胞過度凋亡引起的骨髓造血細(xì)胞減少和功能衰竭有關(guān)。從病因方面AA可分為先天性和后天性，其中，先天性AA又稱范科尼貧血(Fanconi anemia，F(xiàn)A)?，F(xiàn)普遍認(rèn)為，F(xiàn)A與22種不同基因突變所導(dǎo)致DNA雙鏈對交聯(lián)劑高度敏感、染色體損傷以及DNA雙鏈交聯(lián)修復(fù)功能缺失有關(guān)，將這些與FA有關(guān)的基因稱為FANC基因。在實(shí)驗(yàn)室中常用的FA造模方法包括G2期電離輻射法和FANC基因敲除法。而后天性AA的動物模型則可基于其產(chǎn)生機(jī)制的不同，而采用不同的造模方法。本文將結(jié)合所得文獻(xiàn)，介紹并總結(jié)當(dāng)前最為常用的幾種實(shí)驗(yàn)室AA動物模型造模方法。

1 AA動物模型的通用評價標(biāo)準(zhǔn)[1-3]

動物體態(tài)改變：AA造模成功的動物，包括小鼠、大鼠和兔等，常會出現(xiàn)體重下降、精神萎靡、耳廓蒼白、瞇眼弓背、毛發(fā)蓬松豎立且無光澤等變化。

血象變化：AA模型動物相對于正常的對照組動物出現(xiàn)全血細(xì)胞減少，白細(xì)胞(white blood cell，WBC)中以中性粒細(xì)胞減少最為明顯，紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)及血紅蛋白(hemoglobin，Hb)水平顯著下降，網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocyte，RET)和血小板(platelet，PLT)數(shù)量減少。

骨髓象變化：AA模型動物的骨髓涂片中骨髓脂肪化明顯，骨髓有核細(xì)胞減少，非造血細(xì)胞增多，鏡下可見空泡數(shù)量明顯增多，出現(xiàn)較大和特大空泡。

2 FA動物模型造模方法

2.1 G2期電離輻射法

Zahnreich S等[4]通過對G2期的皮膚和肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行X射線照射，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的H2AX(一種H2A組蛋白的變型)、53BP1(一種DNA修復(fù)因子)或RPA(一種與DNA雙鏈斷裂修復(fù)相關(guān)的蛋白)定量異常；同時通過細(xì)胞遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在G1期及G2期照射后可見染色體過早凝聚，DNA雙鏈之間出現(xiàn)無法修復(fù)的交聯(lián)，表現(xiàn)出與臨床上FA一致的細(xì)胞改變。

2.2 基因敲除法

2.2.1 直接敲除FANC基因 Zhang H等[5]在進(jìn)行FA相關(guān)實(shí)驗(yàn)時采用了生物公司制作的Fancd2-/-基因敲除小鼠，使用基因敲除所得到的小鼠其FA發(fā)病機(jī)制與臨床上人類FA發(fā)病機(jī)制具有高度一致性，因此在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行FA相關(guān)實(shí)驗(yàn)時常使用FANC相關(guān)基因敲除小鼠。但由于使用FANC相關(guān)基因敲除小鼠所制作的FA模型并不能完全重現(xiàn)人類FA的所有臨床表現(xiàn)，故而在運(yùn)用方面亦具有一定的局限性[6]。

2.2.2 敲除可對FANC基因產(chǎn)生作用的其他基因 如Jamsai D等[7]在使用GGN-/-基因敲除小鼠時發(fā)現(xiàn)GGN的最大亞型GGN1可與FANC基因的關(guān)鍵組分FANCD2(一種由FANC基因編碼的關(guān)鍵蛋白)相互作用，在敲除掉GGN基因后，敲除小鼠表現(xiàn)出對絲裂霉素C的高度敏感性并且出現(xiàn)大量染色體異常等類似于FA的臨床癥狀。

2.2.3 骨髓細(xì)胞端?？s短法 B?r C等[8]通過敲除小鼠的Trf1基因，使得造血干細(xì)胞出現(xiàn)代償性增生而出現(xiàn)端粒迅速縮短，進(jìn)而導(dǎo)致了基因敲除小鼠的WBC、Hb、RBC和PLT水平明顯降低。但現(xiàn)在普遍認(rèn)為，臨床人類FA貧血的發(fā)病機(jī)制是通過作用于FANC基因介導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑導(dǎo)致DNA的交聯(lián)和染色體破壞，因此通過該法制造的FA小鼠僅在外周血象及骨髓象表現(xiàn)與臨床FA具有相似性。

3 后天性AA動物模型造模方法

3.1 物理方法造模

該方法是基于造血干細(xì)胞減少導(dǎo)致貧血的發(fā)病機(jī)理而設(shè)計(jì)的，過去常使用76 Gy60Co γ射線對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行全身照射(劑量率為1 Gy/min)，該法所制得AA動物模型基本符合人類臨床AA發(fā)病特點(diǎn)且制作周期短[9]，但由于使用射線單獨(dú)造模難以控制照射量，經(jīng)常導(dǎo)致動物因過量照射死亡，并且還存在設(shè)備不便、需要特殊防護(hù)、操作繁瑣、對人體存在傷害等問題，因此現(xiàn)在常使用物理射線聯(lián)合化學(xué)藥品(氯霉素、環(huán)磷酰胺)進(jìn)行復(fù)合造模，所得動物模型具有較好穩(wěn)定性，且操作比較簡便。

3.2 物理聯(lián)合化學(xué)方法造模

張樂等[10]將BALB/c小鼠于第1天予以3.0 Gy137Cs γ射線照射(劑量為91 Gy/min)，之后分別于第4天、第5天、第6天予以環(huán)磷酰胺、氯霉素腹腔注射；結(jié)果模型小鼠血液WBC和PLT水平迅速下降，Hb和RET顯著減少；經(jīng)骨髓象檢查發(fā)現(xiàn)骨髓有核細(xì)胞數(shù)量顯著減少，于鏡下觀察到大量脂肪細(xì)胞和非造血細(xì)胞增生；該動物模型符合AA的臨床表現(xiàn)。通過該方法制得的AA小鼠模型骨髓衰竭持續(xù)時間長，生存率也相對穩(wěn)定，因此在近幾年的AA造模中常使用復(fù)合方法造模，而較少使用單獨(dú)射線照射造模。

3.3 化學(xué)方法造模

3.3.1 苯 最早應(yīng)用于AA造模的化學(xué)試劑是苯劑，苯及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)超過一定限度可對造血系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重傷害致使造血微環(huán)境損傷，從而導(dǎo)致AA的發(fā)生。賀今等[11]將小鼠背側(cè)皮下注射玉米油與苯油的混合液(苯劑量2 mL/kg)，分別于造模第5天、第10天、第15天、第20天和第25天注射；最后一次注射后第2天抽查外周血象，可見其WBC、RBC、Hb、PLT和RET水平明顯下降；通過其骨髓象檢查發(fā)現(xiàn)，小鼠造血面積顯著減少，脂肪細(xì)胞增多，骨髓間質(zhì)血竇充血。通過苯間斷注射誘導(dǎo)AA動物模型不僅使得外周血象各指標(biāo)均顯著下降，而且造模成功后沒有引起小鼠死亡，因而此種造模方式明顯優(yōu)于射線照射造模。外周血免疫學(xué)分析結(jié)果顯示，模型組CD4+細(xì)胞比例低于對照組，CD8+細(xì)胞比例高于對照組，CD4+/CD8+比例低于對照組；表明在實(shí)驗(yàn)動物模型的發(fā)病過程中有細(xì)胞免疫的參與，這與臨床上AA具有一致性。

3.3.2 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)聯(lián)合白消安 5-FU為抗代謝藥，主要?dú)幱谠鲋持芷趦?nèi)的細(xì)胞，而非增殖周期內(nèi)的細(xì)胞則不會受到殺傷作用，且5-FU主要富集在骨髓中，其骨髓中濃度為血漿濃度2倍，因而可以導(dǎo)致造血功能損傷。白消安屬于烷化劑，為細(xì)胞周期非特異性藥物，由于其血液毒性將會對造血細(xì)胞進(jìn)行殺傷，可與5-FU同用產(chǎn)生協(xié)同作用。蘇攀柯等[2]將SD大鼠第1天予以5-FU腹腔注射150 mg/kg，第5天予以白消安蒸餾水懸液灌胃15 mg/kg；一周后進(jìn)行外周血象檢查，顯示W(wǎng)BC、Hb和RBC水平均明顯減少；骨髓涂片可見骨髓非造血細(xì)胞增生明顯，脂肪化嚴(yán)重，骨髓有核細(xì)胞數(shù)量大幅減少，出現(xiàn)大空泡；該動物模型的血象及骨髓象較為接近臨床人類AA。

3.3.3 環(huán)磷酰胺聯(lián)合白消安 由于環(huán)磷酰胺與白消安均可導(dǎo)致造血干細(xì)胞損傷，Chen YF等[12]將ICR小鼠使用環(huán)磷酰胺40 mg/kg和白消安20 mg/kg聯(lián)合皮下注射12 d后進(jìn)行外周血象檢查，結(jié)果與對照組相比，模型組小鼠WBC、RBC、Hb、PLT和骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)分別顯著下降64.32%、42.33%、20.04%、61.53%和68.25%；骨髓檢查發(fā)現(xiàn)骨髓有核細(xì)胞數(shù)量大幅減少，脂肪化嚴(yán)重，出現(xiàn)大空泡；這些指標(biāo)表明該法所造的動物模型與臨床AA的表現(xiàn)基本一致。

3.3.4 重組人γ-干擾素聯(lián)合白消安 劉香等[13]選用重組人γ-干擾素聯(lián)合白消安進(jìn)行造模，他們通過使用干擾素以達(dá)到類似于免疫介導(dǎo)所致T細(xì)胞功能亢進(jìn)的效果，從而使用較為簡單的方法以制造與免疫介導(dǎo)方法相近的AA模型，因此此種方法也可歸屬于免疫介導(dǎo)方法。使用該法制造的AA模型在第7天時出現(xiàn)WBC、PLT、Hb水平下降，與對照組第7天相比具有顯著差異，在第14天時AA模型鼠的血象與對照組比較仍顯著下降，第7天與第14天血象比較則無顯著差異。這表明使用該法所得到的模型鼠表現(xiàn)出與AA相似的血象變化，且該造模方法具有較好的穩(wěn)定性。

除了上述方法以外，還有采用乙酰苯肼聯(lián)合環(huán)磷酰胺腹腔注射以建立AA大鼠模型[14]以及使用氯霉素[15]進(jìn)行AA造模，這些動物模型其病理表現(xiàn)也接近于人類AA。越來越多的研究表明，聯(lián)合使用化學(xué)試劑制造AA動物模型，其機(jī)制都有免疫細(xì)胞的參與，病理表現(xiàn)較接近于人類AA的臨床病理表現(xiàn)。

3.4 免疫介導(dǎo)法造模

免疫介導(dǎo)是通過誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)并產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞而導(dǎo)致AA的動物模型制造方法，由于T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)是臨床AA最重要的發(fā)病機(jī)制，因此該方法制造的動物模型是最能反映臨床狀況的動物模型。該造模方法包括病毒感染和淋巴細(xì)胞輸注。前者主要用于FA的基因治療，Czechowicz A等[16]報(bào)道了由攜帶FANC相關(guān)基因的慢病毒進(jìn)行兒童FA的臨床基因治療，而在實(shí)驗(yàn)室中普遍使用的是淋巴細(xì)胞輸注法制造AA模型。Wu D等[17]將DBA/2小鼠通過頸椎脫臼法處死后收獲胸腺并制備成細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液通過尾靜脈注射進(jìn)入經(jīng)過Co照射4 h后的小鼠體內(nèi)，第10天時檢查其外周血象發(fā)現(xiàn)AA組小鼠WBC、Hb、RBC和PLT水平明顯降低，而且其骨髓檢查也出現(xiàn)了經(jīng)典的AA病理表現(xiàn)。該法所制得的模型，同樣有細(xì)胞免疫的參與，因此其發(fā)病機(jī)制與人類AA相近。雖然該模型制造周期短，但其操作繁瑣，胸腺懸液制備需要嚴(yán)格無菌。

4 評價與展望

實(shí)驗(yàn)室中對于FA動物模型主要通過敲除小鼠相關(guān)基因制備，當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用的FANC基因敲除小鼠發(fā)病后的血象特點(diǎn)與人類相似，但基因敲除所導(dǎo)致的FA模型動物表現(xiàn)出的發(fā)育異常、貧血和癌癥傾向并不能完全模擬臨床FA癥狀[18-20]，同時靶向于FANC基因的治療結(jié)果也均不理想[21-22]。

后天性AA動物模型在篩選AA治療藥物方面較為常用，其制備方法通常包括物理、物理聯(lián)合化學(xué)、化學(xué)試劑聯(lián)用以及免疫介導(dǎo)法。其中，化學(xué)試劑聯(lián)用制造AA動物模型因?yàn)榫哂胁僮骱啽?、試劑易得、評價方法成熟等優(yōu)點(diǎn)而被大量采用，但是該法也存在與臨床AA病理表現(xiàn)一致性不夠高的缺點(diǎn)。物理、物理聯(lián)合化學(xué)方法由于射線照射操作不便，因此較為少用，現(xiàn)在已經(jīng)被化學(xué)試劑聯(lián)合造模方法所替代。在4種后天性AA動物模型造模方法中，免疫介導(dǎo)法中的淋巴細(xì)胞輸注法制造AA動物模型，與人類AA最為相似，但是其操作更加繁瑣。后天性AA動物模型的另3種制造方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但均有小鼠模型穩(wěn)定性不夠高以及外周血象(WBC、PLT、RBC、Hb)下降程度不一致的問題，因此在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)造模過程中尚應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇和改進(jìn)[23-24]。

中醫(yī)藥在緩解造血功能障礙、治療AA方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，療效穩(wěn)定，毒副作用少，臨床選方用藥可以從解毒、化瘀、化痰、補(bǔ)腎、健脾、益氣、養(yǎng)血等多方面進(jìn)行合理配伍以治療。在研發(fā)新的防治AA中藥新藥過程中，我們需要合理選擇契合度高的AA模型以便能全面、準(zhǔn)確評估中藥的療效并推薦用于臨床適合類型。以上模型可用于初步篩選，但如果要更加合理評估中醫(yī)藥療效，則需要以辨證為依據(jù)建立中醫(yī)相應(yīng)AA動物模型則更好，目前這方面工作尚有很多不足，希翼對AA有興趣的臨床和科研工作者進(jìn)一步探索新的中醫(yī)證型AA模型和中西醫(yī)結(jié)合模型，從而能充分評估和顯示中醫(yī)藥在治療AA方面的優(yōu)勢。