運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的作用機(jī)制

吳月霞，蒙毅，龔純，朱永蘋(píng)，林壽寧，許裕偉，康雪瑩

作者單位：1廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530001；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530011

胃癌前病變（gastric precancerous lesions，GPL）是在慢性胃炎的基礎(chǔ)上伴發(fā)上皮內(nèi)瘤變的胃黏膜病理組織學(xué)變化。上皮內(nèi)瘤變作為重要的癌前病變，主要表現(xiàn)為上皮結(jié)構(gòu)改變和細(xì)胞學(xué)異常，屬于浸潤(rùn)前的腫瘤性改變［1-2］。幽門(mén)螺桿菌（Helico?bacter pylori，Hp）感染是導(dǎo)致胃癌前病變的重要因素，可通過(guò)炎性刺激、誘導(dǎo)基因突變等機(jī)制致胃上皮細(xì)胞出現(xiàn)增殖損傷，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)水平發(fā)生改變［3］。流行病學(xué)研究［4］顯示我國(guó)胃癌的發(fā)病率及病死率在全國(guó)惡性腫瘤中高居第二位，因此對(duì)胃癌前病變進(jìn)行及時(shí)有效地干預(yù)治療，阻止甚至逆轉(zhuǎn)慢性胃炎向胃癌前病變發(fā)展，是防治胃癌的關(guān)鍵。

安胃二號(hào)方是全國(guó)名老中醫(yī)林壽寧教授根據(jù)胃癌前病變濕邪郁阻，氣血澀滯，胃氣不和的基本病機(jī)［5］創(chuàng)制的臨床有效經(jīng)驗(yàn)方，由蒼術(shù)、半夏、陳皮、茯苓、薏苡仁、草果、三七7 種中藥組成。前期研究發(fā)現(xiàn)安胃二號(hào)方可明顯改善胃癌前病變病人臨床癥狀及病灶組織病變情況，提高Hp 根除率［6］；另有研究發(fā)現(xiàn)安胃二號(hào)方能增加慢性萎縮性胃炎病人胃黏膜TFF1 蛋白表達(dá)，在促進(jìn)胃黏膜修復(fù)和細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用［7］；實(shí)驗(yàn)研究運(yùn)用安胃二號(hào)方干預(yù)胃潰瘍大鼠模型，發(fā)現(xiàn)安胃二號(hào)方能明顯抑制胃黏膜組織中核因子（NF）-κB 蛋白活化，通過(guò)調(diào)控炎性介質(zhì)、趨化因子和炎性相關(guān)酶的過(guò)度表達(dá)，達(dá)到抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、減輕炎癥反應(yīng)的作用［8］。本研究將運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析安胃二號(hào)方對(duì)慢性胃炎向胃癌前病變進(jìn)展過(guò)程中相關(guān)基因水平的調(diào)控，為開(kāi)展安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的研究提供可參考的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 安胃二號(hào)方的有效化合物及靶點(diǎn)的篩選本研究起止時(shí)間為2020 年2—3 月。運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），篩選安胃二號(hào)方中符合口服生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥0.18 的有效化合物，并通過(guò)DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca/）進(jìn)行靶點(diǎn)注釋。

1.2 胃癌前病變相關(guān)基因的篩選經(jīng)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），以“gastric precan?cerous lesions”為關(guān)鍵詞搜索胃癌前病變及慢性胃炎的相關(guān)表達(dá)基因，選擇GSE55696 數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘分析。篩選該數(shù)據(jù)中的19 例慢性胃炎樣本作為慢性胃炎基因組（樣本號(hào)GSM1341860～1341878），并整合該數(shù)據(jù)中的19 例低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及20 例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變作為胃癌前病變基因組（樣本號(hào)GSM1341879～1341917），以P<0.05 且|logFC|>1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選胃癌前病變與慢性胃炎的差異表達(dá)基因，并構(gòu)建基因差異熱圖。

1.3 安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的作用靶點(diǎn)及化合物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在Venny中導(dǎo)入安胃二號(hào)方的有效靶點(diǎn)及胃癌前病變的差異基因，篩選出的交集基因即為作用靶點(diǎn)，并篩選出安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的作用化合物。在Cytoscape 導(dǎo)入作用靶點(diǎn)和化合物，設(shè)置節(jié)點(diǎn)表示作用化合物及靶點(diǎn)，以邊表示連接關(guān)系，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.4 作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在String 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org）導(dǎo)入安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的作用靶點(diǎn)，設(shè)定物種“homo sapi?ens”，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，獲取蛋白互作信息，篩選關(guān)鍵基因。

1.5 安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的GO 富集分析使用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），對(duì)安胃二號(hào)方治療胃癌前病變參與調(diào)節(jié)的具有顯著變化的生物過(guò)程和細(xì)胞成分進(jìn)行分析。

1.6 安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的KEGG 富集分析運(yùn)用京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.kegg.jp/），對(duì)安胃二號(hào)方治療胃癌前病變參與調(diào)控的通路及基因進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 安胃二號(hào)方的有效化合物及靶點(diǎn)通過(guò)篩選共獲得安胃二號(hào)方的57種有效化合物，分別是蒼術(shù)9 種、半夏13 種、陳皮5 種、茯苓15 種、薏苡仁9 種、草果8 種、三七8 種，其中多種中藥具有相同種類(lèi)的化合物。對(duì)所得化合物進(jìn)行基因注釋?zhuān)玫?33 個(gè)有效靶點(diǎn)。

2.2 胃癌前病變的相關(guān)基因?qū)⒄淼玫降穆晕秆谆蚪M和胃癌前病變基因組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)P<0.05 且|logFC|>1 篩選得到1 699 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因785 個(gè)，下調(diào)基因914 個(gè)。選擇|logFC|數(shù)值大小在前20 個(gè)的上調(diào)基因及下調(diào)基因進(jìn)行可視化分析。

2.3 安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的作用靶點(diǎn)及化合物網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用Venny 軟件將安胃二號(hào)方的233 個(gè)靶基因與胃癌前病變的1 699 個(gè)差異基因進(jìn)行取交集，得到安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的31個(gè)作用靶基因，并篩選出安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的23個(gè)作用化合物。通過(guò)Cytoscape 構(gòu)建安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的作用網(wǎng)絡(luò)，包含54 個(gè)節(jié)點(diǎn)和81 個(gè)邊緣，表示7味中藥的23個(gè)化合物與31個(gè)基因共有81個(gè)作用關(guān)系。

2.4 作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)將31 個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到靶基因所編碼的蛋白質(zhì)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)，包含31 個(gè)節(jié)點(diǎn)和69 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為4.45，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度數(shù)選擇前數(shù)值大小在前20個(gè)的蛋白進(jìn)行條形排列，其中前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）、白細(xì)胞介素（IL）-6、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）、炎性趨化因子2（CXCL2）等14個(gè)蛋白的作用度值在平均節(jié)點(diǎn)度以上，節(jié)點(diǎn)度數(shù)越大表示蛋白互作關(guān)系越多。

2.5 安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的GO 富集分析安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的31 個(gè)作用靶基因富集于對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、多細(xì)胞組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)、外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的調(diào)控等342 個(gè)生物過(guò)程；作用于突觸膜、受體復(fù)合體、膜筏、膜區(qū)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、細(xì)胞-細(xì)胞連接等19 個(gè)細(xì)胞。選擇具有顯著差異的條目進(jìn)行可視化分析。

2.6 安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的KEGG 富集分析作用靶點(diǎn)主要富集于IL-17 信號(hào)通路（hsa04657：PTGS2、FOSL1、IL6、MMP3、CXCL2、MAPK3）、HIF-1 信號(hào)通路（hsa04066：NOS2、IL6、HMOX1、SERPINE1、MAPK3）、腫瘤壞死因子信號(hào)途徑（hsa04668：PTGS2、IL6、MMP3、CXCL2、MAPK3）、VEGF 信 號(hào) 通 路（hsa04370：PTGS2、HSPB1、MAPK3）。根據(jù)通路與靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，運(yùn)用Cyto?scape軟件構(gòu)建基因通路網(wǎng)絡(luò)。

3 討論

中醫(yī)藥通過(guò)辨證論治與臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)結(jié)合的特點(diǎn)，運(yùn)用多味中藥配制成中藥復(fù)方治療疾病，通過(guò)協(xié)同作用提高治療效果。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法得到安胃二號(hào)方的57 個(gè)有效化合物及233個(gè)有效靶點(diǎn)，其中有23 個(gè)化合物及31 個(gè)靶點(diǎn)作用于胃癌前病變的治療過(guò)程，調(diào)節(jié)342個(gè)生物過(guò)程、19個(gè)細(xì)胞成分及4條主要信號(hào)通路，具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。

安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的作用靶點(diǎn)中，PTGS2、IL6、MAPK3、MMP3、CXCL2 等與其他靶點(diǎn)的聯(lián)系數(shù)量均在平均節(jié)點(diǎn)度以上，并且還參與調(diào)控IL-17 信號(hào)通路、HIF-1 信 號(hào)通路、TNF 信號(hào)途徑、VEGF 信號(hào)通路中的多條信號(hào)通路，這些通路均與細(xì)胞炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)，這與GO 富集結(jié)果一致，因此推測(cè)以上靶點(diǎn)可能是安胃二號(hào)方治療胃癌前病變所調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中PTGS2 與安胃二號(hào)方中的6 種中藥的21 個(gè)化合物相關(guān)，與9個(gè)作用靶點(diǎn)相互作用，且與以上關(guān)鍵靶點(diǎn)均有聯(lián)系，還參與調(diào)控IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路，在胃癌前病變的治療過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

PTGS2又稱(chēng)環(huán)氧化酶2（COX-2），是前列腺素合成的重要限速酶，正常生理狀態(tài)下呈低表達(dá)狀態(tài)，在炎癥因子、促癌劑等病理因素誘導(dǎo)下可迅速合成呈表達(dá)升高趨勢(shì)，在腫瘤組織炎癥微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用［9］。目前研究已證實(shí)COX-2的過(guò)度表達(dá)可通過(guò)多種方式促進(jìn)炎癥進(jìn)展和腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。單輝國(guó)等［10］通過(guò)對(duì)慢性胃炎、胃癌前病變、胃癌病人胃黏膜免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)COX-2 的表達(dá)水平與病變程度呈正相關(guān)，且胃癌前病變及胃癌病人COX-2 表達(dá)陽(yáng)性率與Hp 感染后的炎性刺激明顯相關(guān)；張英輝等［11］發(fā)現(xiàn)COX-2 和VEGF 蛋白表達(dá)在慢性胃炎、胃癌前病變、胃癌病人胃黏膜中呈逐漸上升趨勢(shì)，且COX-2的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤血管生成；劉金狄等［12］運(yùn)用中藥干預(yù)胃癌前病變大鼠模型發(fā)現(xiàn)下調(diào)大鼠胃黏膜NF-κB 及COX-2 表達(dá)水平可促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。

IL6 參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，可通過(guò)IL6 的過(guò)表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞增殖［13］。唐菁等［14］運(yùn)用COX-2 抑制劑干預(yù)人胃癌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞中COX-2 及IL-6 表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞增殖明顯受限。MAPK3 在磷酸化激活后參與從細(xì)胞骨架變化到基因轉(zhuǎn)錄的各種細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有調(diào)控作用，在抑制細(xì)胞增殖分化、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答及穩(wěn)定細(xì)胞形態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用［15］。Oyeniran、Tanfin［16］研究發(fā)現(xiàn)抑制COX-2 及MAPK3/1通路可改變MAPK 的聯(lián)級(jí)反應(yīng)，控制細(xì)胞炎性反應(yīng)及增殖轉(zhuǎn)移。MMP3能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用［17］。封慧等［18］發(fā)現(xiàn)胃癌前病變大鼠胃黏膜中COX-2 及前列腺素E2 的高表達(dá)可誘導(dǎo)MMP3 的生成和活化，通過(guò)破壞細(xì)胞基底膜，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。CXCL2 是一種原癌基因編碼的蛋白，可趨化中性粒細(xì)胞遷移加重炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)腫瘤新生血管生成［19］。有研究發(fā)現(xiàn)CXCL2 表達(dá)在胃炎和胃癌中均有上調(diào)，且可能與COX-2 高表達(dá)誘導(dǎo)PGE2合成增多途徑有關(guān)［10］。

安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的作用靶點(diǎn)在IL-17 信號(hào)通路中富集最多，分別是PTGS2、FOSL1、IL6、MMP3、CXCL2、MAPK3，除FOSL1 外這些基因同時(shí)也參與對(duì)TNF 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。IL-17 信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)相關(guān)，當(dāng)IL-17 結(jié)合于靶細(xì)胞后可促進(jìn)炎性因子表達(dá)，引起慢性炎癥、組織增生及腫瘤新生血管生成［20］。TNF 信號(hào)通路參與胃癌發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，對(duì)炎癥反應(yīng)發(fā)生及腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移均有調(diào)控作用［21］。因此推測(cè)安胃二號(hào)方治療胃癌前病變參與調(diào)節(jié)IL-17 信號(hào)通路和TNF 信號(hào)通路可能通過(guò)上調(diào)MAPK3 表達(dá)、下調(diào)FOS 樣抗原-1（FOSL1）及MMP3 表達(dá)，以保持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，減少炎性因子對(duì)胃上皮細(xì)胞的損傷，抑制腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期的正向調(diào)控；并且通過(guò)下調(diào)炎性因子IL6、PTGS2 及趨化因子CXCL2 水平，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答能力，減少炎癥反應(yīng)對(duì)胃黏膜的損傷，阻止腫瘤細(xì)胞的增殖。

此外，安胃二號(hào)方對(duì)胃癌前病變的治療還可通過(guò)調(diào)節(jié)NOS2、IL6、HMOX1、SERPINE1、MAPK3的表達(dá)水平調(diào)控HIF-1（缺氧誘導(dǎo)因子）信號(hào)通路。腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖可致血液供應(yīng)不足形成低氧環(huán)境，同時(shí)腫瘤因子的刺激可使局部血管通透性增強(qiáng)致大量免疫細(xì)胞聚集引起細(xì)胞缺氧，加重對(duì)胃黏膜的損傷。黃柳向等［22］發(fā)現(xiàn)胃癌前病變大鼠胃黏膜中HIF-1ɑ、VEGF 呈高表達(dá)狀態(tài)且隨病變程度增強(qiáng)，而通過(guò)中藥進(jìn)行干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)下調(diào)HIF-1ɑ、VEGF表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)胃癌前病變。因此推測(cè)其作用機(jī)制可能是通過(guò)MAPK3 及下調(diào)纖溶酶原激活物抑制劑1（SERPINE1）的表達(dá)，改變細(xì)胞基質(zhì)的重塑功能，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，阻止腫瘤細(xì)胞增殖侵襲；通過(guò)下調(diào)IL6 等炎性因子水平、下調(diào)一氧化氮合酶2（NOS2）及血紅素加氧酶1（HMOX1）等血管相關(guān)基因表達(dá)，減輕對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞及血管的損傷，使病變細(xì)胞處于缺血缺氧狀態(tài)。

VEGF 信號(hào)通路參與對(duì)血管形態(tài)和功能的調(diào)控，可誘導(dǎo)腫瘤血管生成，對(duì)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移起重要作用。Lee 等［23］發(fā)現(xiàn)VEGF 介導(dǎo)的HSPB1 磷酸化可抑制HSPB1 分泌及結(jié)合活性，并通過(guò)對(duì)小鼠胃癌模型的觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可降低HSPB1 的分泌，促進(jìn)腫瘤新生血管生成。安胃二號(hào)方治療胃癌前病變可通過(guò)影響PTGS2、HSPB1、MAPK3 水平參與調(diào)節(jié)VEGF 信號(hào)通路，因此推測(cè)其可能通過(guò)上調(diào)MAPK3 水平、下調(diào)PTGS2 表達(dá)以減輕炎性刺激，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；通過(guò)抑制HSPB1（熱休克蛋白B1）磷酸化，使HSPB1 水平上調(diào)，發(fā)揮抑制腫瘤血管生成作用。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的作用機(jī)制，推測(cè)安胃二號(hào)方可能通過(guò)影響PTGS2、IL6、MAPK3、MMP3、CXCL2 等基因的表達(dá)水平，參與對(duì)IL-17 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)途徑、VEGF 信號(hào)通路的調(diào)控，通過(guò)改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)及相關(guān)生物過(guò)程，減輕胃黏膜炎癥損傷，促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞形態(tài)及功能恢復(fù)，抑制細(xì)胞增殖侵襲，阻止甚至逆轉(zhuǎn)胃黏膜慢性炎癥向胃癌前病變發(fā)展，達(dá)到治療胃癌前病變的目的。本研究結(jié)果將為開(kāi)展安胃二號(hào)方治療胃癌前病變的研究提供可參考的理論依據(jù)。