柴胡皂苷A通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路減輕烏頭堿中毒大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的機(jī)制分析

李華，徐鵬，趙艷，雷艷青

作者單位：湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院急診科，湖北 襄陽(yáng) 441000

烏頭堿是存在于川烏、草烏、附子等植物中的主要成分，民間常用于治療風(fēng)濕麻痹等疾?。?］，但也因炮制不當(dāng)食用出現(xiàn)中毒甚至死亡。烏頭堿目前還未發(fā)現(xiàn)特效解藥［2］。柴胡皂苷A是由傘形科植物柴胡的根莖提取、提純制成的粉末，具有抗炎、抗病毒的作用，此外還有鎮(zhèn)靜和抗驚厥等諸多藥理學(xué)作用［3］。動(dòng)物研究顯示柴胡皂苷A具有抑制海馬炎癥反應(yīng)以及提高大鼠認(rèn)知功能相關(guān)蛋白水平的作用［4］，但柴胡皂苷A是否對(duì)烏頭堿引起的腦組織損傷有保護(hù)作用，尚未有研究報(bào)道。本研究旨在探索柴胡皂苷A對(duì)烏頭堿中毒大鼠腦組織的影響及其可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器Saikosaponin A（中國(guó)上海源葉生物科技有限公司），Aconitine、ECL 試劑盒（中國(guó)上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司），兔抗鼠Bcl 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體（中國(guó)上海優(yōu)予生物科技有限公司），兔抗鼠B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶3（Cas?pase-3）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（中國(guó)上海恒斐生物科技有限公司），TUNEL 試劑盒（中國(guó)江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）elisa 試劑盒（中國(guó)上海信帆生物科技有限公司），白細(xì)胞介素-6（IL-6）elisa 試劑盒（中國(guó)上海歌凡生物科技有限公司），冷凍離心機(jī)3K15（美國(guó)Sigma 公司），正置熒光顯微鏡FM-51D（中國(guó)上海繪統(tǒng)光學(xué)儀器有限公司），全自動(dòng)輪盤(pán)式切片機(jī)（LEICA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組本研究自2018 年10 月至2019 年7 月，選取購(gòu)自武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)健康雄性16～20 周齡SD 大鼠100 只［武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SYXK（鄂）2015-0025］，體質(zhì)量范圍為250～300 g。購(gòu)回飼養(yǎng)1 周，溫度20～25 ℃，空氣濕度50%～55%，人工光照，光照12 h、黑暗12 h，所有大鼠全天飲水自由。將100 只SD 大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組1、干預(yù)組2、干預(yù)組3，每組各20 只。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.3 模型制備及給藥處理參考文獻(xiàn)［5］中的染毒方法進(jìn)行烏頭堿中毒大鼠模型制備，模型組與干預(yù)組大鼠均進(jìn)行烏頭堿（20μg/kg）尾靜脈注射，觀察各組大鼠心電圖情況，待大鼠心律失常3 min后進(jìn)行藥物干預(yù)，干預(yù)組1、干預(yù)組2、干預(yù)組3 分別注射不同劑量的柴胡皂苷A（5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg），模型組與對(duì)照組注射等劑量生理鹽水。各組分別于干預(yù)后12 h、24 h時(shí)隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行麻醉處死，分離腦組織。

1.4 HE 組織染色與TUNEL 法檢測(cè)組織凋亡分別于藥物干預(yù)后12 h、24 h，采用1%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，分離腦組織，一部分固定于4%多聚甲醛，常規(guī)石蠟包埋、切片、染色詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)［6］。一部分腦組織用于TUNEL 細(xì)胞凋亡情況，組織固定、包埋、切片方法與HE 組織染色相同。各組所有片子在400 倍視野下選取海馬區(qū)不重疊視野4 個(gè)進(jìn)行觀察。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核呈現(xiàn)出棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，記為凋亡的海馬神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)高倍鏡下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率=（陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)/有核細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥反應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)將各組織大鼠完整腦組織取出，加入組織細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑，研磨成組織勻漿，3 000 r/min，離心20 min，取上清液，采用聯(lián)免疫法檢測(cè)各組大鼠腦組織中MDA、TNF-α、IL-6水平，SOD 活性，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)參照蛋白質(zhì)提取試劑盒說(shuō)明對(duì)各組大鼠腦組織蛋白進(jìn)行提取，Bradford 調(diào)整蛋白濃度，依次經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)膜，密封2 h，加入兔抗鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2、CHOP、GRP78、GAPDH 一抗（1∶500）4 ℃孵育過(guò)夜再用TBST 漂洗40 min，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶500）孵育1 h，參照ECL 試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行觀察膜上蛋白條帶，收集影像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件，文中數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，反之采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；文中劑量效應(yīng)分析時(shí)，除去對(duì)照組，把模型組（藥物干預(yù)劑量為0）與3個(gè)不同干預(yù)劑量處理的干預(yù)組進(jìn)行單因素方差分析，然后再進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)，當(dāng)方差分析和兩兩比較LSD-t均P<0.05后，說(shuō)明有劑量反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 柴胡皂苷A 對(duì)烏頭堿中毒大鼠腦組織的影響將各組大鼠麻醉后，取完整的腦組織進(jìn)行HE染色觀察腦組織情況，結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的正常，呈現(xiàn)出圓形或者橢圓形，核膜完整，無(wú)病變細(xì)胞。模型組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞呈現(xiàn)出胞核固縮、細(xì)胞腫脹、神經(jīng)元變性及壞死癥狀，且排列稀疏。干預(yù)組1、干預(yù)組2、干預(yù)組3大鼠神經(jīng)細(xì)胞的病變情況逐漸減輕，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腦組織情況（HE染色×400） 圖2 烏頭堿中毒大鼠腦組織凋亡情況（TUNEL檢測(cè)×400）

2.2 柴胡皂苷A對(duì)烏頭堿中毒大鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響將各組大鼠的腦組織取出并勻漿離心，留取上清液用于檢測(cè)腦組織SOD 活性及MDA 含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、干預(yù)組大鼠12 h、24 h SOD活性降低，MDA含量升高（P<0.05）；與模型組相比，干預(yù)組大鼠12 h、24 h SOD 活性升高，MDA含量降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦組織SOD、MDA含量比較/±s

表1 各組大鼠腦組織SOD、MDA含量比較/±s

注：MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶。①與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。②與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。③與干預(yù)組1同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。④與干預(yù)組2同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。

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2.3 柴胡皂苷A 對(duì)促烏頭堿中毒大鼠腦組織炎癥反應(yīng)的影響將各組大鼠的腦組織取出并勻漿離心，留取上清液用于檢測(cè)腦組織TNF-α、IL-6 含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、干預(yù)組大鼠12 h、24 h 的TNF-α、IL-6 含量均升高（P<0.05）；與模型組相比，干預(yù)組大鼠12 h、24 h的TNF-α、IL-6含量均降低（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量比較/（ng/L，/±s）

表2 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量比較/（ng/L，/±s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白細(xì)胞介素-6。①與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。②與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。③與干預(yù)組1同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。④與干預(yù)組2同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。

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2.4 柴胡皂苷A 對(duì)促烏頭堿中毒大鼠腦組織凋亡的影響TUNEL 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、干預(yù)組大鼠12 h、24 h的腦組織細(xì)胞凋亡率均升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組相比，干預(yù)組大鼠12 h、24 h的腦組織細(xì)胞凋亡率均降低（P<0.05）。Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、干預(yù)組大鼠12 h、24 h 的腦組織Bcl-2 蛋白水平均降低，Bax 蛋白水平均升高（P<0.05）；與模型組相比，干預(yù)組大鼠12 h、24 h 的腦組織Bcl-2 蛋白水平均升高，Bax 蛋白水平均降低（P<0.05）。見(jiàn)圖2，3；表3。

表3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平比較/±s

表3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平比較/±s

注：Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl相關(guān)X蛋白。①與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。②與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。③與干預(yù)組1同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。④與干預(yù)組2同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。

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2.5 柴胡皂苷A 對(duì)烏頭堿中毒大鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的影響Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組、干預(yù)組大鼠12 h、24 h的腦組織CHOP、GRP78蛋白水平均升高（P<0.05）；與模型組相比，干預(yù)組大鼠12 h、24 h 的腦組織CHOP、GRP78蛋白水平均降低（P<0.05）。見(jiàn)圖4，表4。

表4 各組大鼠腦組織CHOP、GRP78蛋白水平比較/±s

表4 各組大鼠腦組織CHOP、GRP78蛋白水平比較/±s

注：CHOP為CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白，GRP78為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78。①與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。②與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。

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圖4 各組大鼠腦組織CHOP、GRP78蛋白凝膠成像結(jié)果

3 討論

烏頭堿對(duì)機(jī)體各個(gè)器官均有一定的毒性作用，其中以神經(jīng)系統(tǒng)與心血管系統(tǒng)受損最嚴(yán)重。2%烏頭堿溶液處理大鼠腦片皮質(zhì)20 min，可使神經(jīng)細(xì)胞全部死亡［7］。柴胡皂苷A 具有較好的抗炎、調(diào)節(jié)免疫［8］、抵抗肝纖維化［9］以及鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用，同時(shí)還能夠改善腦損傷大鼠認(rèn)知功能與神經(jīng)功能［10］。本研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷A可以改善烏頭堿中毒大鼠腦組織病理情況，延緩中毒大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，表明柴胡皂苷A對(duì)烏頭堿中毒大鼠也有腦組織保護(hù)作用。

圖3 各組大鼠腦組織Bax、Bcl-2蛋白凝膠成像結(jié)果

細(xì)胞凋亡也叫作細(xì)胞程序性死亡，引起細(xì)胞凋亡的因素眾多，包括創(chuàng)傷、缺血缺氧、毒物刺激、感染等。凋亡也是多種基因共同作用結(jié)果，主要涉及兩條途徑，一條是細(xì)胞膜上的死亡受體激活半胱氨酸蛋白激酶，引起細(xì)胞凋亡途徑活化；另一條是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)線(xiàn)粒體途徑釋放各種細(xì)胞凋亡因子，激活半胱氨酸蛋白激酶活性，經(jīng)過(guò)系列的信號(hào)傳導(dǎo)，使胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解，促使細(xì)胞凋亡［11］。本研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷A 可以升高Bcl 蛋白水平，降低Bax 蛋白水平。Bcl-2 是線(xiàn)粒體途徑凋亡通路中的重要成員，其含量增加可以抑制細(xì)胞凋亡，Bax 有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，兩者比值變化可直接反映組織凋亡情況［12-13］。由此表明，柴胡皂苷A 可以通過(guò)調(diào)節(jié)烏頭堿中毒大鼠腦組織中Bax、Bcl 蛋白水平，來(lái)降低腦組織細(xì)胞凋亡率。

烏頭堿中毒大鼠腦組織出現(xiàn)凋亡，暗示腦組織出現(xiàn)損傷，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)也參與腦組織損傷進(jìn)程［14］。本研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷A 可以降低烏頭堿中毒大鼠腦組織中MDA、TNF-α、IL-6 水平，增加SOD活性。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的終端產(chǎn)物，其水平變化可以直接顯示組織損傷嚴(yán)重程度，SOD 是機(jī)體清除自由基的主要物質(zhì)［15-16］。TNF-α、IL-6 屬于促炎因子之一，機(jī)體內(nèi)部的TNF-α、IL-6 主要是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞也可以分泌。朱雙龍等［17］研究顯示柴胡皂苷A可以通過(guò)調(diào)節(jié)急性脊髓損傷早期炎性因子水平來(lái)減輕繼發(fā)性免疫炎癥反應(yīng)，Chen 等［18］研究也表明柴胡皂苷A 可以抑制香煙誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。而本研究表明，柴胡皂苷A可以通過(guò)降低烏頭堿中毒大鼠腦組織氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指由多種因素導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白、未折疊蛋白于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔累積，最終引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能行使受阻。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期，細(xì)胞通過(guò)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)特異性信號(hào)系統(tǒng)，促進(jìn)GRP78 上調(diào)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊蛋白、未折疊蛋白結(jié)合，糾正蛋白正確構(gòu)象［19］。但在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)久時(shí)，CHOP 會(huì)大量表達(dá)，啟動(dòng)CHOP 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。減輕或抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可能預(yù)防細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷A 可以降低烏頭堿中毒大鼠CHOP、GRP78 蛋白水平，有研究顯示右美托咪定可以通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激來(lái)減輕大鼠腦損傷［20］，本研究結(jié)果與其有相似之處，表明柴胡皂苷A 可以通過(guò)降低烏頭堿中毒大鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而降低細(xì)胞凋亡。

綜上所述，柴胡皂苷A 可以降低烏頭堿中毒大鼠腦組織氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，降低腦組織細(xì)胞凋亡率，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦組織的保護(hù)作用。本研究通過(guò)大鼠模型進(jìn)行探討，而在臨床上是否存在相似變化以及柴胡皂苷A 的臨床使用劑量，還需要進(jìn)一步研究。