熒光檢測(cè)技術(shù)在水質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用

魏 鋼

（河北省唐山生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，河北 唐山 063000）

改革開放以來，工業(yè)的快速發(fā)展促使城市中積累了越來越多的凈化設(shè)備。工業(yè)用水不僅流入河流并威脅環(huán)境，而且還威脅人類的飲用水安全。快速、真實(shí)地監(jiān)測(cè)水質(zhì)的變化對(duì)于有效控制水污染事件和制定相應(yīng)措施尤為重要。熒光檢測(cè)技術(shù)早在幾十年前便得以應(yīng)用，并在長期發(fā)展中不斷改進(jìn)，形成了一種新型檢測(cè)技術(shù)并逐漸成熟。熒光檢測(cè)技術(shù)剛開始僅僅被用于生物領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，之后逐漸應(yīng)用于食品安全和水質(zhì)檢測(cè)等領(lǐng)域，為人們的生活提供安全保障。目前，我國環(huán)境監(jiān)測(cè)部門大多采用傳統(tǒng)的化學(xué)方法（如COD、BOD測(cè)量）來分析水質(zhì)，但對(duì)水質(zhì)以及水質(zhì)監(jiān)控的要求不斷發(fā)生變化，在實(shí)際運(yùn)用中仍存在許多缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不僅在檢測(cè)工藝上浪費(fèi)更多的時(shí)間和資源，而且不能夠有效地對(duì)水質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，從而需要更加先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)來克服傳統(tǒng)檢測(cè)方式的不足，更加快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出水中各類成分的含量，進(jìn)而確保人們的用水安全。

1 水質(zhì)檢測(cè)的重要性

由于我國人口眾多，水資源一直處于絕對(duì)短缺狀態(tài)，南北水資源分布不均，行業(yè)水資源存在差距。對(duì)水的保護(hù)已成為政府的首要任務(wù)，尤其是我國西部地區(qū)，雖然水資充裕但水質(zhì)較差，對(duì)我國經(jīng)濟(jì)建設(shè)和發(fā)展影響很大。可以通過水質(zhì)檢測(cè)，對(duì)水中的有害成分進(jìn)行定期檢查，更好地了解我國各地區(qū)的河流、地下水、自來水等水資源的詳細(xì)狀況，并結(jié)合不同地區(qū)的實(shí)際情況，對(duì)純凈水水質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)控、凈化和預(yù)防。此外，水質(zhì)監(jiān)測(cè)過程結(jié)束后，會(huì)收集到區(qū)域內(nèi)水質(zhì)的重要數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)及時(shí)地傳遞給環(huán)保局，可以為水資源和環(huán)境的科學(xué)管理提供權(quán)威的數(shù)據(jù)支持，以幫助相關(guān)單位進(jìn)一步解決水質(zhì)問題。同時(shí)，通過水質(zhì)檢測(cè)可以對(duì)污染物的來源進(jìn)行分析，以更好地找到污染源并遏制其發(fā)展，還可以及時(shí)地對(duì)水資源數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)和評(píng)估，研究凈化水資源的策略，保證人們的用水安全和對(duì)地方環(huán)境的有效保護(hù)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自來水和純凈水的熒光光譜沒有明顯差異，但城市污水和純凈水的熒光光譜差異很大，在不同波長的紫外線的激勵(lì)下，城市污水和純水樣品的熒光光譜在直波長和峰值波長上基本穩(wěn)定，符合熒光光譜的一般特性，只是絕對(duì)強(qiáng)度發(fā)生了變化。而城市污水利用波長約為270 nm的紫外線發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，熒光峰是280～530 nm范圍內(nèi)的寬光譜峰，熒光峰的波長約為380 nm，熒光光譜的特點(diǎn)反映了水質(zhì)的凈化水平，城市污水中所含的有機(jī)污染物具有較高的絕對(duì)強(qiáng)度和較寬的光譜峰寬熒光光譜[1]。

水質(zhì)檢測(cè)的主要目標(biāo)是通過合理的技術(shù)手段對(duì)水中的成分進(jìn)行檢測(cè)，為環(huán)境保護(hù)收集準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)信息，以更好地解決水質(zhì)問題。水質(zhì)檢測(cè)與水資源后期的管理配置和管理方法有一定的聯(lián)系，水質(zhì)檢測(cè)的結(jié)果必須要有一定的代表性，才能保證水資源保護(hù)策略更具有說服力和實(shí)際意義。人們常用的自來水中是含有很多有害細(xì)菌的，細(xì)菌的繁殖會(huì)產(chǎn)生很多浮游生物，一方面會(huì)影響水域的物理特性，水的顏色和氣味發(fā)生一些特殊的改變，另一方面，人體在感染細(xì)菌后更容易誘發(fā)其他流行病，嚴(yán)重威脅人體的生命健康。生活中比較常見的就是“牙菌斑”，牙菌斑是水質(zhì)中含有不符合標(biāo)準(zhǔn)的氟離子嚴(yán)重影響了牙齒的硬度而產(chǎn)生的。因此，國家要求通過水質(zhì)檢測(cè)對(duì)水資源進(jìn)行安全保護(hù)，以符合國家安全標(biāo)準(zhǔn)，滿足人們的生活用水和工業(yè)用水的不同要求。例如，鍋爐水不能含有大量的硫酸鈣或硫酸鎂，避免鍋內(nèi)物質(zhì)的凝結(jié)，不利于鍋中物質(zhì)的有效反應(yīng)，會(huì)浪費(fèi)更多的原材料，嚴(yán)重情況還會(huì)引發(fā)鍋中的爆炸。因此水質(zhì)檢測(cè)可以更好地對(duì)水中懸浮物進(jìn)行檢測(cè)和排查，并找出相應(yīng)的水質(zhì)優(yōu)化方法。根據(jù)研究表明，熒光檢測(cè)技術(shù)可以細(xì)胞為單位，更加細(xì)致地檢測(cè)出水中所含有的微生物，以達(dá)到水質(zhì)檢測(cè)的真正目的，為水質(zhì)成分的實(shí)驗(yàn)研究提供準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。熒光檢測(cè)技術(shù)所含有的技術(shù)種類很多，技術(shù)的檢測(cè)靈敏度要更高一些，而且不容易破壞水質(zhì)樣品的結(jié)構(gòu)，檢測(cè)過程可以保證數(shù)據(jù)提取的穩(wěn)定性[2]。

2 水質(zhì)檢測(cè)的一般標(biāo)準(zhǔn)

2.1 飲用水消毒

飲用水是與人們生活密切相關(guān)的，必須進(jìn)行一定的凈化消毒工作，殺死水中的有害微生物，以保證人們所用到水源是被充分消毒過的。在飲用水檢測(cè)過程中，常常出現(xiàn)刺激性氣味，這與其本身含有的水質(zhì)消毒物質(zhì)有關(guān)。比較常見的消毒方式有臭氧和紫外線消毒，消毒后會(huì)產(chǎn)生甲醛和氯仿，但只要消毒方法科學(xué)合理，嚴(yán)格符合消毒標(biāo)準(zhǔn)，就不會(huì)對(duì)人體造成傷害。

2.2 具有感官性

水質(zhì)的判斷有很多種方法，可以用專業(yè)的設(shè)備和儀器進(jìn)行鑒別，也可以用人的感官來判斷水資源的安全性。一般情況下，水質(zhì)出現(xiàn)問題都會(huì)引起水質(zhì)物理特征的一些變化，例如，水的味道改變、水的顏色變渾濁以及有刺激性氣味等特點(diǎn)，其外觀和味道直接決定了水質(zhì)的感官特征。因此，可通過感官來進(jìn)行基本的水質(zhì)觀測(cè)，初步確定水質(zhì)是否安全，若產(chǎn)生異樣，將直接拒絕使用。

2.3 符合流行病學(xué)控制要求

眾所周知，水資源保護(hù)首要考慮到的就是去除微生物，避免人體遭到微生物的侵害而誘發(fā)疾病。水質(zhì)檢測(cè)過程要借助流行病學(xué)相關(guān)理論，控制人類活動(dòng)和動(dòng)物糞便對(duì)水源的污染，進(jìn)而保證水中微生物的含量符合環(huán)境保護(hù)的要求，防止流行病和細(xì)菌通過飲用水傳播。

3 熒光檢測(cè)技術(shù)在水質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用技術(shù)原理

熒光所具有的基本特征就是熒光物質(zhì)，熒光物質(zhì)可以被固定波長的光激發(fā)，并在氧化后的一段時(shí)間內(nèi)恢復(fù)，發(fā)揮其檢測(cè)運(yùn)用。常見的熒光檢測(cè)方法種類很多，不同技術(shù)的使用感受也大不相同，常見的有熒光光譜檢測(cè)和高效液相色譜法檢測(cè)，這也是人們?cè)u(píng)價(jià)較高的檢測(cè)方法。分子熒光檢測(cè)具有應(yīng)用于大型湖泊和河流等傳統(tǒng)水質(zhì)檢測(cè)的潛力，國外已經(jīng)對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了普及，允許各大地區(qū)進(jìn)行應(yīng)用，借助高效率和高質(zhì)量的熒光檢測(cè)技術(shù)，使得水質(zhì)檢測(cè)過程達(dá)到最佳[3]。

3.1 ATP生物熒光檢測(cè)技術(shù)

三磷酸腺苷也就是檢測(cè)中的ATP，在熒光的基礎(chǔ)技術(shù)上可以更好地與熒光素和熒光素酶發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，也是被檢測(cè)單位公認(rèn)的最容易估算水質(zhì)成分的方法之一。ATP生物熒光檢測(cè)技術(shù)相比于菌落計(jì)數(shù)法可以更快地確認(rèn)活菌的存在，但是該反應(yīng)需要與ATP直接接觸，其發(fā)射強(qiáng)度與ATP濃度呈正相關(guān)。此外，ATP為動(dòng)物、微生物、細(xì)菌和真菌的生命活動(dòng)提供能量，維持細(xì)胞生命周期的穩(wěn)定，而水質(zhì)檢測(cè)中生物的負(fù)荷將反應(yīng)水質(zhì)成分。ATP生物熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)周期較短，對(duì)設(shè)備的消毒程度要求高，可以滿足在移動(dòng)模式下完成實(shí)時(shí)檢測(cè)，這限制了僅適用于實(shí)驗(yàn)室模式的大型臺(tái)式ATP熒光檢測(cè)器。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是后期逐漸興起的一種先進(jìn)的分析技術(shù)，主要是借助流式細(xì)胞來檢測(cè)水中的懸浮物質(zhì)和顆粒。流式細(xì)胞術(shù)融合了流體動(dòng)力學(xué)技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)以及現(xiàn)代計(jì)算機(jī)信息技術(shù)等多類別的現(xiàn)代化技術(shù)，可以借助熒光探針在分子水平上獲得一些數(shù)據(jù)以進(jìn)一步純化細(xì)胞。流式細(xì)胞技術(shù)在時(shí)代的發(fā)展中逐漸走向成熟，是一項(xiàng)跨學(xué)科、多類別的提高結(jié)晶的技術(shù)，在檢測(cè)中取得了顯著的成就。其技術(shù)檢測(cè)的原理是通過流動(dòng)池懸浮液在流動(dòng)池內(nèi)的聚集，容易形成單獨(dú)的粒子流，在穿過激光束后發(fā)生許多的碰撞，進(jìn)而恢復(fù)細(xì)胞水平上不一樣的熒光信號(hào)和細(xì)胞參數(shù)。另外，該技術(shù)中粒子散射和熒光發(fā)射由一組特定波長的濾光片和設(shè)備決定的，信號(hào)在收集完成后會(huì)發(fā)送到計(jì)算機(jī)，進(jìn)而獲取更加全面的數(shù)據(jù)分布，完成水質(zhì)中的物質(zhì)檢測(cè)[4]。

3.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

熒光共振能量轉(zhuǎn)移主要是指熒光的發(fā)色團(tuán)在接觸到一定程度后，會(huì)接收到彼此特定頻率的光子，從而激發(fā)出更高的電子能態(tài)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在粒子恢復(fù)基本狀態(tài)的過程中，能量可以和偶極子相互作用從而傳遞給其他的受體。當(dāng)兩個(gè)熒光團(tuán)產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移時(shí)，一個(gè)作為供能個(gè)體，一個(gè)作為受能個(gè)體，并且不同的光譜重疊在一起，控制間距在1.0～10.0 nm。若采用供體激光發(fā)射，就會(huì)發(fā)現(xiàn)供體的能量轉(zhuǎn)移給受體，并且轉(zhuǎn)移的效率和發(fā)射光譜之間的堆疊水平有關(guān)。供體和受體之間的差異躍遷與偶極子的絕對(duì)方向、供體和受體之間的距離有關(guān)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移的水平與兩個(gè)熒光分子之間的距離有關(guān)，如果非常粒子之間接近，能量轉(zhuǎn)移的條件就會(huì)滿足，若輸出比傳導(dǎo)傳遞弱，就難以實(shí)現(xiàn)能量傳遞。

4 熒光檢測(cè)技術(shù)在水質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用

4.1 水中細(xì)菌數(shù)量的檢測(cè)

水中細(xì)菌檢測(cè)是水質(zhì)檢測(cè)中最基本的項(xiàng)目，主要是對(duì)一定單位內(nèi)的水質(zhì)進(jìn)行細(xì)菌的定量檢測(cè)，但檢測(cè)過程對(duì)技術(shù)人員的專業(yè)度要求很高，不允許出現(xiàn)較大的誤差，并且等待結(jié)果時(shí)間較長。通過流式細(xì)胞檢測(cè)的原理可以了解到，被標(biāo)記的細(xì)菌被單個(gè)激光柱激發(fā)并檢測(cè)到發(fā)射的熒光信息。因此，水質(zhì)檢測(cè)最常見的用途是快速識(shí)別水中的細(xì)菌總數(shù)，借助流式細(xì)胞儀可以在15分鐘內(nèi)輕松快速地從樣本中獲得結(jié)果。在檢測(cè)水中細(xì)菌含量時(shí)適當(dāng)增加水樣，方便對(duì)水中有毒物質(zhì)進(jìn)行直接檢測(cè)，常用檢測(cè)方法是ATP生物熒光檢測(cè)技術(shù)。飲用水中的細(xì)菌濃度是非常小的，采用生物熒光檢測(cè)技術(shù)會(huì)受到細(xì)菌濃度和數(shù)量的局限，準(zhǔn)確度和靈敏度下降，不能實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)。在檢測(cè)之前，應(yīng)增加水中微生物濃度再進(jìn)行免疫磁分離執(zhí)行目標(biāo)細(xì)胞的捕獲，一定程度上可以提高靶細(xì)胞水平，減少其他實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)外粒子的干擾，最終確保檢測(cè)的特異性。ATP生物熒光檢測(cè)技術(shù)可用于檢測(cè)飲用水中的微生物含量，而稀釋水中的微生物可以通過膜過濾和適當(dāng)添加緩沖劑或熒光劑來檢測(cè)[5]。

4.2 水中離子濃度的檢測(cè)

水中離子的濃度直接影響到水的硬度，水的硬度過高會(huì)使水中金屬元素在人體內(nèi)累積，在人體內(nèi)留下安全隱患。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，如原子吸收光譜法、方差分析法、復(fù)雜滴定法等都存在檢測(cè)時(shí)間長、過程復(fù)雜的缺點(diǎn)。而熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，主要是通過測(cè)量水中鈣和鎂的濃度來檢測(cè)水質(zhì)硬度，在水溶液中加入納米級(jí)黏土片狀鋰皂，可以進(jìn)一步提高檢測(cè)傳感器的感受度，方便測(cè)量到水資源中的各類成分和離子，為實(shí)驗(yàn)提供更多的數(shù)據(jù)參考。

4.3 水中生物細(xì)胞分析

水中的微生物種類比較多，有時(shí)需要單獨(dú)研究某種微生物，而水質(zhì)檢測(cè)的目標(biāo)就是針對(duì)一類或者一種微生物進(jìn)行檢測(cè)。采用流式細(xì)胞儀可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞的成分進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，從而結(jié)合細(xì)胞的特性和反應(yīng)特征來分離出微生物進(jìn)一步進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀與rRNA焦磷酸測(cè)序數(shù)據(jù)相結(jié)合，通過設(shè)備容易觀察到水系中的微生物群落變化。焦磷酸測(cè)序是一種下一代測(cè)序技術(shù)，其主要特點(diǎn)就是觀察水中生物群落的基本形態(tài)和物質(zhì)構(gòu)成的分子比例，還能測(cè)得水中粒子的濃度。在水質(zhì)檢測(cè)中，將細(xì)胞流式技術(shù)所測(cè)得的細(xì)胞數(shù)據(jù)和焦磷酸測(cè)序數(shù)據(jù)相結(jié)合，能夠更好地檢測(cè)水系中的細(xì)菌濃度和微生物的群落實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化。在生活環(huán)境中存在細(xì)菌團(tuán)體，容易誘發(fā)人體疾病，常見的軍團(tuán)菌大多生長在潮濕的地方，通過實(shí)驗(yàn)可以觀測(cè)該種細(xì)菌的數(shù)量變化，更快速地測(cè)出其他菌種。

4.4 消毒效果深度分析

在飲用水消毒研究中，消毒劑的使用量對(duì)水中細(xì)菌的影響是不可忽視的。水質(zhì)檢測(cè)研究報(bào)告表明，消毒劑濃度與完整細(xì)胞的比例相關(guān)聯(lián)，采用流式細(xì)胞儀可以得到消毒前后所有細(xì)胞濃度。細(xì)菌活力檢測(cè)試劑盒中的兩種染料和碘化丙啶可穿透所有細(xì)菌膜，進(jìn)而將細(xì)胞染成綠色，最終達(dá)到水質(zhì)檢測(cè)和消毒的目的。檢測(cè)中的染料和試劑材料熔化、混合和稀釋，在室溫下孵育20分鐘，獲得的結(jié)果可以通過激光掃描共聚焦顯微鏡來證實(shí)。另外，碘化丙啶不能穿透未受損細(xì)胞的細(xì)胞膜，但可以穿透受損細(xì)胞的細(xì)胞膜，兩種染料的組合產(chǎn)生白色熒光細(xì)胞。

5 熒光檢測(cè)技術(shù)在水質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用前景

熒光檢測(cè)技術(shù)作為一種新型檢測(cè)技術(shù)，可以克服傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的諸多不足。一方面可以節(jié)省技術(shù)操作的時(shí)間，為單位減少水質(zhì)檢測(cè)的資金投入，另一方面可以檢測(cè)出活細(xì)胞濃度，這是眾多檢測(cè)技術(shù)所難以實(shí)現(xiàn)的。其中，ATP生物熒光檢測(cè)技術(shù)因其檢測(cè)速度更快、操作更加簡便等特點(diǎn)，可以更容易檢測(cè)出一定水樣溶液中微生物的數(shù)量，但也容易受到檢測(cè)條件中能量的限制和外界微生物含量的影響，在檢測(cè)低濃度水質(zhì)應(yīng)注意避免使用該方法。其次，流式細(xì)胞技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移具有操作方便、靈敏度高、效果好等特點(diǎn)，檢測(cè)價(jià)值更高一些，廣泛用于檢測(cè)微生物、毒素、離子等，但使用這項(xiàng)技術(shù)需要滿足相關(guān)條件[6]。

流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的設(shè)備價(jià)格比較昂貴，其檢測(cè)試劑也比較昂貴，不利于邊遠(yuǎn)地區(qū)的普及和推廣。最后，激光掃描共聚焦顯微鏡可以更加直觀地檢測(cè)水質(zhì)中的成分，檢測(cè)過程非常簡單，不需要專業(yè)的細(xì)胞培育技術(shù)，但制樣過程非常繁瑣，對(duì)于研究類的實(shí)驗(yàn)員來說是一個(gè)非常方便的檢測(cè)方法，在未來水質(zhì)檢測(cè)和環(huán)境保護(hù)研究中的潛力是很大的。熒光檢測(cè)技術(shù)可以為水質(zhì)檢測(cè)單位提供更加符合時(shí)代發(fā)展的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，并且通過結(jié)合熒光檢測(cè)技術(shù)可以檢測(cè)水中細(xì)菌、病毒等特定微生物的濃度以及微生物群落的替代狀態(tài)，為后期水資源的保護(hù)和環(huán)境保護(hù)研究提供參考價(jià)值。熒光檢測(cè)技術(shù)在飲用水檢測(cè)、消毒劑評(píng)價(jià)等水質(zhì)分析研究中得到了越來越廣泛的應(yīng)用，分析結(jié)果更加高效準(zhǔn)確。

6 結(jié)語

從人們生活中排出的污水會(huì)引起許多流行病，如果不經(jīng)過嚴(yán)格檢測(cè)，就會(huì)影響人們的正常用水，并威脅到人體的健康。水質(zhì)檢測(cè)對(duì)人類的生活和環(huán)境的維持與發(fā)展起著非常重要的作用。鑒于我國水質(zhì)實(shí)驗(yàn)室分布不均、采樣設(shè)置不合理、檢測(cè)技術(shù)設(shè)備陳舊等問題，應(yīng)結(jié)合自身的工作經(jīng)驗(yàn)提出針對(duì)性的合理化建議。采用熒光檢測(cè)技術(shù)可以有效提高水質(zhì)檢測(cè)的效率，保障居民飲水安全，及時(shí)發(fā)現(xiàn)水質(zhì)問題，促進(jìn)社會(huì)和諧發(fā)展，進(jìn)一步為環(huán)境管理和環(huán)境科學(xué)研究提供確切的數(shù)據(jù)和信息，從源頭控制水質(zhì)，合理規(guī)劃和保護(hù)環(huán)境。