干細(xì)胞外泌體心肌保護作用的研究進展

李慧麗，周成斌

我國正在逐步進入老齡化社會，心血管疾病的發(fā)病逐年上升，其被認(rèn)為是世界各地發(fā)病和死亡的主要原因之一。 近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用干細(xì)胞治療相關(guān)心臟疾病成為研究的熱點，但是干細(xì)胞移植到心肌梗死區(qū)修復(fù)心肌組織存在爭議。 外泌體是一種由多種細(xì)胞分泌的納米級膜性囊泡，直徑通常介于50 ～150 nm，于電鏡下觀察可見具有特征性的“蝶形”小體［1－2］，可以通過配體介導(dǎo)作用于特定的組織和細(xì)胞并根據(jù)其結(jié)合分子定位于特定的組織或微環(huán)境，將信息傳遞至靶細(xì)胞并調(diào)節(jié)其功能，有研究顯示其具有心肌保護作用［3］。 本文意在闡述干細(xì)胞外泌體在心肌保護方面的應(yīng)用進展。

1 來源

外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種，最初細(xì)胞外囊泡被認(rèn)為是無用的物質(zhì)，后發(fā)現(xiàn)由網(wǎng)織紅細(xì)胞通過胞外途徑釋放而被認(rèn)識［4］。 這種胞外途徑后來逐漸被證實可以發(fā)生在許多細(xì)胞中，如B 淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞可以通過分泌外泌體進行免疫應(yīng)答。 陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以存在于樹突狀細(xì)胞的表面或某些生理液體［5］，如羊水或惡性胸腔積液中［6］。 鑒于造血細(xì)胞可以在體外分泌外泌體，有研究者對外泌體是否可以在血液中存在進行了研究，研究后證實血液可以作為外泌體獲得靶標(biāo)的自然環(huán)境［7］。 骨髓源性的外泌體并不少見，目前的研究主要是間充質(zhì)干細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等［8－10］。 外泌體膜上富含豐富的物質(zhì)，包括熱休克蛋白家族（HSP60、HSP70 和 HSP90 等）主要參與外泌體運輸、四跨膜蛋白家族（CD63、CD9 和CD81）以及一些細(xì)胞特異性的蛋白包括CD86（抗原提呈細(xì)胞來源）、MHC－Ⅱ（抗原提呈細(xì)胞來源）、乳凝集素（不成熟的樹突狀細(xì)胞）以及A33（結(jié)腸上皮細(xì)胞來源）。 其中最常見的細(xì)胞外囊泡包括CD63、CD81、CD9 以及 HSP70、TSG101、ALIX 等。

2 作用機制

2.1 外泌體與旁分泌 旁分泌機制是最早提出用于解釋干細(xì)胞相關(guān)作用的機制，之前的研究認(rèn)為干細(xì)胞發(fā)揮保護作用的方式是通過直接分化為心肌細(xì)胞，然而后期的研究發(fā)現(xiàn)小鼠心臟干細(xì)胞直接分化為心肌細(xì)胞的比例非常低，因此學(xué)者提出干細(xì)胞對心肌保護的作用機制可能是并非直接分化［11］。 Lai等［12］通過超速離心法對干細(xì)胞培養(yǎng)基進行研究，在電鏡下對其觀察并通過質(zhì)譜分析等實驗方法研究后提取出外泌體，并證實外泌體對于減少心肌梗死小鼠的受損心肌面積至關(guān)重要。 也有研究發(fā)現(xiàn)，將干細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體去除后，培養(yǎng)基的上述作用明顯減弱，對心肌的保護作用也不明顯［13］，這些研究都可以表明在干細(xì)胞對心肌損傷的保護方面，旁分泌產(chǎn)生外泌體在其中發(fā)揮著重要的作用。 外泌體已經(jīng)成為干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的典型代表，對于干細(xì)胞發(fā)揮作用、維持細(xì)胞間的信息傳遞以及生物學(xué)行為方面意義重大。

2.2 外泌體介導(dǎo)信息傳遞 細(xì)胞間相互作用方式有很多，包括釋放核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其它分子，這些成分可以介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞外受體，還包括通過囊泡發(fā)揮作用，將mRNA、蛋白質(zhì)和miRNA 轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞中。 而外泌體成為潛在候選物，其與靶細(xì)胞相互作用包括：①外泌體的跨膜蛋白可直接與靶細(xì)胞的信號受體相互作用；②外泌體內(nèi)化到受體細(xì)胞內(nèi)；③外泌體與受體細(xì)胞的質(zhì)膜融合，并將其內(nèi)容物輸送到胞漿中；④外泌體中含有 miRNA 和RNA，可以進行遺傳物質(zhì)的傳遞。 多種物質(zhì)會存在外泌體表面，這些物質(zhì)大多數(shù)含有活性脂質(zhì)成分，包括鞘氨醇－1－磷酸和神經(jīng)酰胺－1－磷酸，若外泌體進入靶細(xì)胞，這些物質(zhì)可發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡和刺激血管生成的作用［14］，同時，外泌體所含的miRNA 也隨著被轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞。 在這個過程中，不僅發(fā)揮了傳遞信息的作用還發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用。 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體是一個典型代表，其中包含多種細(xì)胞因子（如白介素－6 和白介素－10）、生長因子（如轉(zhuǎn)化生長因子－β 和干細(xì)胞生長因子）、信號脂質(zhì)、mRNA（如胰島素樣生長因子）和調(diào)節(jié) miRNA（如miR－21 和 miR－133b）［15－19］。 這些物質(zhì)在廣泛的生理過程中發(fā)揮主要和次要的調(diào)節(jié)作用，包括生物體發(fā)育、表觀遺傳調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生及進展。

3 干細(xì)胞外泌體對心肌細(xì)胞的作用

自1968 年首次成功進行骨髓細(xì)胞移植以來，細(xì)胞治療的再生醫(yī)學(xué)已逐漸成為許多疾病的替代治療策略，尤其是干細(xì)胞在心血管疾病治療方面意義重大。 一些試驗證明，基于干細(xì)胞的療法可以替代丟失的心肌細(xì)胞，隨后改善收縮力，治療心臟疾?。?0］。但是對于干細(xì)胞療法陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)具有致瘤風(fēng)險，而外泌體療法未觀察到致瘤性存在［21］。 所以外泌體是克服干細(xì)胞療法相關(guān)缺陷的有效選擇，可以將信息傳遞至靶細(xì)胞并調(diào)節(jié)其功能，進而對心臟發(fā)揮保護功能。

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）外泌體 MSC 是一種能夠分化為多種細(xì)胞類型的多能干細(xì)胞（multipotential stem cells，iPSCs），是一種非常有前途的、主要的細(xì)胞治療劑，用于組織再生和修復(fù)。 作為MSCs 旁分泌的代表，外泌體在心肌再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。 有趣的是，miRNA 在 MSC和MSC 衍生的外泌體之間的表達模式相似。 在急性心肌梗死大鼠模型中，兩種治療下都觀察到了心臟修復(fù)作用，其證據(jù)是促進新生血管形成、減少細(xì)胞凋亡、抑制纖維化［22］，促進心肌細(xì)胞增殖。

3.1.1 促進新生血管形成 在大鼠心肌梗死模型中，靜脈注射外泌體顯著增加了心臟功能和血管生成。 有證據(jù)表明，miR－126 和血管內(nèi)皮生長因子富集的MSC 來源的外泌體促進缺血組織中促血管生成mRNA 的表達，而治療組miR－126 基因敲除的MSCs 外泌體的促血管生成作用減弱［23］。 Wang等［24］研究顯示MSC 衍生的外泌體通過傳遞miR－210 促進小鼠心肌梗死模型的血管生成。 miR－210沉默的MSCs 外泌體促血管生成作用顯著降低。 Ju等［25］建立小鼠心梗模型，通過設(shè)置對照實驗，分別在心肌梗死邊緣區(qū)注射MSC 分泌的外泌體和磷酸緩沖鹽溶液，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，接受MSC 外泌體治療可以促進心臟血管生成和心肌細(xì)胞增殖。 以上研究可以證實MSC 外泌體可以對心肌梗死的治療起到很好的作用，通過促進血管生成來改善梗死的癥狀，有利于梗死病變的恢復(fù)。 Huang 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可通過增加基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1 的表達來發(fā)揮降低炎癥反應(yīng)的作用，并且可以提高MSC 的存活率。 這項研究對治療方式進行了改進，具體實施是先將外泌體遞送到心肌，然后再將MSC 移植到梗死部位，當(dāng)和單獨使用外泌體或MSC 治療進行對比后發(fā)現(xiàn)，這種方式可顯著改善心臟功能，對新血管形成以及減少梗死面積意義重大。

3.1.2 減少心肌細(xì)胞凋亡 在Yu 等的一項研究中構(gòu)建小鼠心肌梗死模型，在這個模型中確定了GATA－4 過表達的MSC 來源的外泌體對心梗的影響。結(jié)果顯示，對于體外低氧環(huán)境下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，這些外泌體顯著提高了細(xì)胞存活率，保留了線粒體膜電位，在小鼠心肌梗死模型中恢復(fù)了心臟收縮功能，減少了梗死面積。 然后他們鑒定出在GATA－4 過表達的MSC 來源的外泌體中miR－19a 含量較高，通過抑制磷酸酶和磷酸酶同源物參與心臟保護作用［27］。 如上所述，這些研究揭示了骨髓 MSC 來源的外泌體對心肌細(xì)胞存活方面的關(guān)鍵作用，這可能是治療心血管疾病的潛在干預(yù)措施。 然而，不同的MSC 類型分泌攜帶特定內(nèi)容物的外泌體可發(fā)揮多樣的功能效應(yīng)。 研究發(fā)現(xiàn)，通過從股骨和脛骨的骨髓中分離MSC，對其外泌體進行提取后可以發(fā)現(xiàn)，外泌體 miR－143－3p 通過 CHK2－Beclin2 通路調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注損傷的自噬作用有效減少細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)實驗中也得到了相同的結(jié)論［28］。 Wang等［29］通過將缺血性心肌靶向肽基序 CSTSMLKAC裝載到外泌體表面進行實驗，這種靶向作用可以將外泌體精確遞送到缺血性心肌細(xì)胞。 結(jié)果證實，載有缺血性心肌靶向肽的外泌體作用于缺血性心肌細(xì)胞的數(shù)量相比較空白外泌體明顯增多； 并且這種方式可使心肌細(xì)胞凋亡減少、血管生成增加、心肌梗死面積縮小并改善心臟功能。

3.1.3 抑制心肌纖維化 有研究發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)外泌體miR－133a 可以促進病毒性心肌炎大鼠的心肌細(xì)胞活力，抑制炎癥、凋亡和纖維化，沉默miR－133a可有效逆轉(zhuǎn)外泌體對病毒性心肌炎大鼠的作用。 而且進一步研究后發(fā)現(xiàn)，通過靶向MAML1（主導(dǎo)控制樣蛋白1）提高病毒性心肌炎的心肌細(xì)胞的活力，抑制心肌細(xì)胞凋亡。 外泌體miR－133a 可以通過下調(diào)MAML1，抑制病毒性心肌炎大鼠的心肌纖維化，從而抑制心肌炎的進展［30］。 Xiao 等［31］的研究也表明過度表達的miR－133a 抑制血管生成、凋亡、纖維化和炎癥，同時加速缺血性心肌疾病的治療性心臟重塑。

3.2 胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）外泌體ESCs 來源于一個胚胎未分化的內(nèi)團細(xì)胞，可以自我更新并分化為多種類型的細(xì)胞，如心肌細(xì)胞等。同時，ESCs 分泌的外泌體將成為心血管疾病的替代治療策略，其通過促進新生血管形成、發(fā)揮抗凋亡和抗纖維化以及誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的方式，在心肌損傷時具有治療潛力。

3.2.1 促進血管新生 有研究發(fā)現(xiàn)ESC 來源的外泌體可以減少橫向主動脈收縮引起的心力衰竭，其作用是通過FGF2（堿性成纖維生長因子）信號發(fā)揮改善心臟功能和促進心血管形成的作用［32］。 在梗死后小鼠心力衰竭模型中，Kervadec 等［33］發(fā)現(xiàn)梗死后給予人ESC 來源的心血管祖細(xì)胞（hESC－Pg）釋放的外泌體與給予hESC－Pg 作用相似。 由超聲心動圖引導(dǎo)，經(jīng)皮注射外泌體至梗死周圍心肌。 結(jié)果表明，外泌體可改善心臟功能，在促進血管中再生方面具有重要作用，這是由促進細(xì)胞存活和增殖的旁分泌因子介導(dǎo)的。

3.2.2 減少細(xì)胞凋亡 阿霉素在治療疾病時可以導(dǎo)致心臟毒性，具體表現(xiàn)為不可逆的擴張型心肌病，進而可以進展為充血性心力衰竭。 現(xiàn)有研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是阿霉素誘導(dǎo)心肌毒性的主要原因［34］，但其分子機制尚不清楚。 Tavakoli 等［35］首次報告了阿霉素引起的心臟毒性反應(yīng)介導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞死亡可以由ESCs 外泌體抑制，這可用作治療阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的未來治療選擇。 研究者還發(fā)現(xiàn)ESCs 外泌體 miRNA－21 通過下調(diào) PDCD4（細(xì)胞程序性死亡4），對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞凋亡可以起到很好的保護作用。

3.2.3 抑制心肌纖維化 Khan 等［36］研究后發(fā)現(xiàn)來源于小鼠ESC 的外泌體可恢復(fù)心臟功能，通過減少心肌纖維化，改善心功能而發(fā)揮作用。 研究表明，與未處理的心血管祖細(xì)胞（iPSC－progenitor cell， iPSC－Pg）相比，miRNA－294－3p 處理導(dǎo)致 iPSC－Pg 在 S期積累，G1 期顯著減少。 miRNA－294－3p 模擬處理的 iPSC－Pg 中細(xì)胞周期蛋白（E1、A2 和 D1）的 mRNA 表達增加，提示 miRNA－294－3p 增強 S 期轉(zhuǎn)變。進一步研究證實這些生物學(xué)作用的產(chǎn)生可能與ESCs 外泌體將miR－294 遞送到心肌細(xì)胞有關(guān)。

3.3 其他干細(xì)胞外泌體 之前的研究已經(jīng)證明了誘導(dǎo)iPSC 外泌體具有影響心血管疾病實驗動物模型的新生血管形成和心肌細(xì)胞存活的治療效果。 由人類誘導(dǎo)iPSCs 衍生的iPSC－Pg 分泌的外泌體在治療充血性心力衰竭方面是有效的，可能通過其特定的miRNA 發(fā)揮作用，這些miRNA 在進化上是保守的，與組織修復(fù)途徑相關(guān)。 并且也有研究發(fā)現(xiàn)與iPSCs 移植相比，iPSCs 衍生的外泌體在左室功能、血管化、凋亡和肥大的改善方面表現(xiàn)出更好的心臟修復(fù)［37］。 外泌體介導(dǎo)的信息傳遞對靶細(xì)胞具有調(diào)控作用的潛力，特別是miRNA 的外泌體轉(zhuǎn)移是組織再生過程中調(diào)控微環(huán)境的重要過程。 Wang 等［24］發(fā)現(xiàn)從小鼠心臟成纖維細(xì)胞來源的iPSCs 中鑒定出的外泌體含有心臟保護miRNA，其中包括Nanog 調(diào)節(jié)的miR－21 和缺氧誘導(dǎo)因子 1α 調(diào)節(jié)的 miR－210。 這些分泌的外泌體可以在體外保護心肌細(xì)胞免受過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，在體內(nèi)保護心肌細(xì)胞免受心肌缺血再灌注損傷。 而且患者特異性iPSC／iPSC 來源的細(xì)胞可以消除受體的免疫抑制。 因此，這些外泌體可能得到進一步應(yīng)用。

目前造血干細(xì)胞外泌體對心肌細(xì)胞發(fā)揮作用的研究相對較少，主要集中于血液系統(tǒng)疾病，由于其避免倫理和免疫排斥問題，在白血病的診斷和治療方面具有作用。

4 問題和展望

目前多種干細(xì)胞外泌體對心肌的保護作用已經(jīng)被證實，但是造血干細(xì)胞外泌體是否具有心肌保護作用未得到研究。 雖然外泌體具有特異性、靶向性和穩(wěn)定性等特點，但是外泌體在體內(nèi)輸注并非十分理想，多種因素會干擾其發(fā)揮作用，導(dǎo)致干細(xì)胞外泌體輸注體內(nèi)時并沒有完全靶向至病損處，部分干細(xì)胞外泌體存在“浪費”的情況。 而且在干細(xì)胞外泌體對心血管疾病治療如此“火熱”的今天，造血干細(xì)胞外泌體對心臟疾病的研究卻很少。 Wan 等［29］采用兩步外泌體遞送策略，先向阿霉素誘導(dǎo)的心肌毒性模型輸注網(wǎng)格蛋白重鏈抑制劑（如氯丙嗪），顯著阻斷脾臟和肝臟中單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的內(nèi)吞作用，再注入裝載 miR－21 的外泌體，與未輸注網(wǎng)格蛋白重鏈抑制劑組相比，裝載miR－21 的外泌體對心肌的保護作用顯著增強。 最近有研究發(fā)現(xiàn)［38］，在體外循環(huán)期間紅細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體會引起腎臟的損傷，他們通過抽取體外循環(huán)不同時間段內(nèi)患者的血液進行檢測，并提取外泌體進行動物實驗驗證得出了這個有趣的結(jié)論，所以這為外泌體作為醫(yī)學(xué)治療的研究熱點提出了警示，對于干細(xì)胞外泌體是否在治療疾病的過程中具有有害作用不得而知。 所以，探究造血干細(xì)胞外泌體對心肌的保護作用以及干細(xì)胞外泌體在發(fā)揮心肌保護時是否引起其他臟器的損傷仍值得繼續(xù)研究。