安琪清香型復(fù)合功能菌的應(yīng)用技術(shù)研究

廖 蓓，李兆飛，常 煦，羅新杰，李志軍

（安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443200）

我國白酒作為中國特有的傳統(tǒng)酒種，是世界六大蒸餾酒之一，以其香型多樣性、工藝特殊、香氣、口感、風(fēng)格獨樹一幟[1]。在我國傳統(tǒng)釀酒工藝中，酒曲、酒醅和窖泥是釀造微生物的來源，直接影響到白酒的風(fēng)格和品質(zhì)。不同的微生物催化原料進(jìn)行各種復(fù)雜的生化反應(yīng)，分解淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)等，最終形成醇、醛、酮、酸、酯等白酒最重要的香氣成分。這些復(fù)雜的微生物體系又受生長環(huán)境變化而改變代謝過程，因此釀酒的地域分布、環(huán)境和加工工藝成就不同的香型白酒。

近些年白酒釀造的基礎(chǔ)研究都是以風(fēng)味和健康因子為技術(shù)向?qū)?，研究白酒的風(fēng)格化合物、特征風(fēng)味化合物和功能微生物對風(fēng)味影響等[2]，提出健康白酒應(yīng)該通過“內(nèi)尋外加，自然強(qiáng)化”來實現(xiàn)[3]。因此，我們尋求的白酒功能微生物是指在白酒釀造過程中，能促進(jìn)白酒發(fā)酵或?qū)Π拙骑L(fēng)味物質(zhì)或白酒健康因子形成有益的微生物。在白酒的釀造過程中，不同香型的白酒其主體風(fēng)味物質(zhì)有很大的差別，因此篩選出具有優(yōu)良性能的微生物并了解其特性，通過外加強(qiáng)化大曲和小曲，促進(jìn)白酒發(fā)酵中風(fēng)味物質(zhì)的提高，從而增強(qiáng)主體香型，提高白酒的品質(zhì)。

近年來在清香型白酒中的研究主要集中在高產(chǎn)酯類的菌種篩選和應(yīng)用上。蔡學(xué)梅等[4]從酒曲中篩選出了高產(chǎn)乙酸乙酯酵母，擴(kuò)大培養(yǎng)后制成酵母麩曲，并應(yīng)用于中試車間發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)添加功能酵母并不影響出酒率。張黎杰[5]通過基因重組構(gòu)建高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母MY15，并應(yīng)用于清香型大曲白酒生產(chǎn)中，結(jié)果顯示，重組菌株和親本菌株相比，具有高產(chǎn)乙酸乙酯低產(chǎn)高級醇的特點。除清香型大曲白酒外，小曲白酒也是我國白酒的主要酒種之一，年產(chǎn)量約占白酒總產(chǎn)量的30%，小曲酒由于原料不同、工藝不同，目前品種繁多、各有特色。除黃酒外，白酒包括米香型白酒、豉香型白酒和小曲清香型白酒三大類[6]。通過研究對小曲中微生物和發(fā)酵微生物的變化的分析，發(fā)現(xiàn)小曲微生物主要是酵母菌和霉菌，還存在一些細(xì)菌和放線菌[7]。王海燕等對清香型小曲酒的微生物進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中的優(yōu)勢酵母菌有4種：扣囊復(fù)膜酵母、異常漢遜酵母、東方伊薩酵母、釀酒酵母；前3種是產(chǎn)酯酵母，而最后1種是產(chǎn)酒酵母；優(yōu)勢霉菌則是米根霉，主要起糖化作用[8]。由于它還能產(chǎn)生酯類、有機(jī)酸等一系列代謝產(chǎn)物，因此對酒體風(fēng)味也有重要影響。李銳利[9]從釀酒小曲中分離篩選出1株高產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌株，經(jīng)鑒定是異常漢遜氏酵母，該酵母菌株在產(chǎn)酯培養(yǎng)基中，30℃下靜置培養(yǎng)4 d，產(chǎn)乙酸乙酯量可達(dá)2.152 g/L。該菌株在清香型小曲酒的生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用，可提高清香型小曲酒的酒質(zhì)。眾多研究均表明，功能微生物對酒質(zhì)的影響起關(guān)鍵的作用。

目前對清香型大曲和釀酒小曲中的微生物的研究主要集中在功能菌株的分離、篩選、鑒定、培養(yǎng)發(fā)酵條件優(yōu)化方面，以及制曲過程中的變化規(guī)律。部分研究將單一菌種制成麩曲或菌液加入發(fā)酵過程中進(jìn)行強(qiáng)化，但對復(fù)合型功能菌的應(yīng)用較少。安琪酵母公司通過對不同單一功能微生物的研究，針對清香型酒對酒質(zhì)提升的需求，開發(fā)一款清香型功能菌，主要應(yīng)用于清香型大曲的強(qiáng)化和配合安琪釀酒曲在小曲酒的應(yīng)用，能明顯提升酒中的乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量，從而提高酒質(zhì)。本研究針對安琪酵母公司開發(fā)的新清香型復(fù)合功能菌金香霸進(jìn)行應(yīng)用研究，包括應(yīng)用方法和應(yīng)用效果進(jìn)行評價，通過優(yōu)化應(yīng)用方法而提高清香型小曲酒的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

原料及耗材：普通南方大米，市場購買；釀酒曲、清香型功能菌香霸和金香霸（香霸和金香霸為兩個不同配方的清香型功能菌產(chǎn)品）、耐高溫型釀酒高活性干酵母為湖北安琪酵母公司產(chǎn)品；傳統(tǒng)小曲，某酒廠提供；糖化酶，市場購買。

儀器設(shè)備：生化培養(yǎng)箱，上海一平儀器公司；氣相色譜儀GC-7890A，安捷倫公司；色譜柱，白酒專用分析柱。

1.2 工藝過程

1.2.1 實驗室釀造小曲酒工藝路線

工藝1：大米—浸泡—初蒸—復(fù)蒸—攤晾—拌曲（釀酒曲和金香霸）—加水后入桶密閉發(fā)酵—蒸餾—小曲酒。

工藝2：大米—浸泡—初蒸—復(fù)蒸—攤晾—拌曲（釀酒曲和金香霸）—培菌糖化—加水后入桶密閉發(fā)酵—蒸餾—小曲酒。

工藝3：大米—浸泡—初蒸—復(fù)蒸—攤晾—加入金香霸—培菌糖化24 h—加曲攪拌—加水后入桶密閉發(fā)酵—蒸餾—小曲酒。

工藝4：大米—浸泡—初蒸—復(fù)蒸—攤晾—加入高酒酵母和糖化酶—加曲攪拌—加水后入桶密閉發(fā)酵—蒸餾—小曲酒。

其中：釀酒曲用量為原料的0.5%，金香霸為0.2%，耐高溫型釀酒高活性干酵母用量為0.2%，糖化酶用量為300 U/g，本地土曲用量為1.5%。

1.2.2 實驗室釀造小曲酒操作過程

采用40～60℃水浸泡大米8～10 h，待蒸鍋中水開后開始蒸米，大米鋪3～5 cm厚，初蒸30 min，復(fù)蒸20 min，要求飯粒飽滿，熟而不黏。攤晾后分裝于不同小發(fā)酵桶，按照實驗組下曲拌勻，培菌時間12～24 h，然后加入水進(jìn)行密封發(fā)酵。如不培菌則直接加水進(jìn)行密封發(fā)酵。發(fā)酵溫度控制在30℃，發(fā)酵9 d左右，發(fā)酵結(jié)束蒸餾取酒，酒精度在40%vol左右。

1.2.3 小型工廠半固態(tài)法大米釀造小曲白酒工藝操作過程

選擇大米含水量在13%以下，無霉?fàn)€。泡糧水溫70℃左右，糧水比為1∶1.7，泡糧時間在3～8 h之間，大米增水量在40%左右，瀝干進(jìn)行初蒸。鍋底水沸騰后大汽初蒸20 min，中間灑水淋飯復(fù)蒸約50 min至大米熟透心，含水量在55%～60%。提前將攤晾場地清潔、消毒、晾干，待糧蒸熟出甑攤平，用鍬鏟翻動均勻平整，待品溫降至50℃左右時，再次翻動，等品溫降至35～40℃時拌曲（對照組直接拌純種根霉酒曲，實驗組拌入金香霸）后開始做箱，做箱厚度在10～12 cm。根據(jù)室溫，適當(dāng)加蓋保溫物。保證溫度不低于25℃。培菌時間24 h后出箱，將糧曲加入缸內(nèi)同時加水130%，保持品溫在30～35℃（此時實驗組加入釀酒曲），攪拌均勻后封缸發(fā)酵，發(fā)酵時間12 d。發(fā)酵結(jié)束時取發(fā)酵醪液進(jìn)行蒸餾取酒，去酒頭1 kg，接酒酒精度在50%vol左右。

1.3 分析與檢測

1.3.1 酒醅理化分析[10]

水分-恒溫失重法；酸度-中和滴定法；還原糖、淀粉-斐林試劑法。

發(fā)酵醪液酒精度（%vol）為100 mL醪液加100 mL水蒸餾出100 mL后酒精度計測定的酒度值。

1.3.2 酒質(zhì)分析[10]

總酸：滴定法；總酯：皂化滴定法。

1.3.3 風(fēng)味成分

采用氣相色譜法：取酒樣降度至55%vol，進(jìn)樣氣相色譜分析。載氣及流速：氮氣1.3 mL/min;氣化室溫度：250 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比40∶1；尾吹：40 mL/min。檢測器：FID，氫氣流速：30 mL/min；空氣流速400 mL/min。升溫程序：起始柱溫40℃保持5 min，以6℃/min升至52℃；再以12℃/min升至130℃，以25℃/min升至240℃，保持10 min，內(nèi)標(biāo)為4-甲基-2-戊酮。

2 結(jié)果與分析

2.1 金香霸配合釀酒曲采用不同發(fā)酵工藝對發(fā)酵的結(jié)果影響

2.1.1 金香霸配合釀酒曲采用不同發(fā)酵工藝?yán)砘笜?biāo)結(jié)果比較（表1）

表1 金香霸配合釀酒曲不同的發(fā)酵工藝的理化指標(biāo)

從表1可以看出，釀酒曲配合金香霸采用不同的工藝進(jìn)行發(fā)酵，實驗組2和實驗組3采用培菌工藝總酸略有提升，總酯增加比較明顯，酒精度略有降低。說明金香霸更適合培菌工藝，對酒的香氣提升有很大幫助。從實驗組2和實驗組3的理化指標(biāo)比較看，培菌的方法不同對酒的香氣的影響也非常大，在實驗組3中先采用金香霸培菌再添加釀酒曲發(fā)酵的總酯含量提高一倍多，發(fā)酵酒精度略有下降，說明發(fā)酵過程中酯化反應(yīng)更多，乙醇與各類酸反應(yīng)生成酯類，提高總酯含量。

2.1.2 金香霸配合釀酒曲采用不同發(fā)酵工藝風(fēng)味分析結(jié)果比較（表2）

表2 金香霸配合釀酒曲采用不同發(fā)酵工藝風(fēng)味分析結(jié)果 (mg/L)

從表2可以看出，實驗組2采用加金香霸直接培菌與實驗組1加金香霸不培菌相比，乙酸乙酯的含量從133.63 mg/L提高到245.21 mg/L，β-苯乙醇含量從59.51 mg/L提高到160.33 mg/L，另外丁酸乙酯、乳酸乙酯和乙縮醛的含量均有提高，說明加釀酒曲配合金香霸培菌對酒的香氣提升明顯。對比試驗組2和試驗組3，采用不同的培菌方式條件下試驗組3中金香霸單獨培菌對香氣提升的效果更加明顯，乙酸乙酯含量提升3倍多，從245 mg/L提高到912 mg/L。乳酸乙酯含量從20 mg/L提升到46 mg/L，另外丁酸乙酯和乙縮醛含量均有所提升。由此推斷，金香霸中的產(chǎn)香酵母在與釀酒酵母一起進(jìn)行培菌時，產(chǎn)香能力受到明顯的抑制，分析可能是由于釀酒酵母生長速度快于產(chǎn)香酵母，導(dǎo)致產(chǎn)香酵母繁殖細(xì)胞數(shù)降低，而影響產(chǎn)香能力。

2.1.3 金香霸配合釀酒曲采用不同發(fā)酵工藝綜合性分析

從理化指標(biāo)和風(fēng)味指標(biāo)綜合來分析可以看出，釀酒曲配合金香霸采用不同的發(fā)酵工藝對最終酒的總酯和風(fēng)味物質(zhì)的含量影響明顯。采用金香霸培菌工藝和不培菌工藝比較，培菌工藝會略微影響發(fā)酵酒精度，從而影響最終酒的產(chǎn)量，但是從風(fēng)味指標(biāo)上看，培菌工藝能夠明顯提高酒的風(fēng)味物質(zhì)而提高酒的品質(zhì)。通過對比不同的培菌方法，發(fā)現(xiàn)采用金香霸單獨培菌能明顯提高酒的風(fēng)味物質(zhì)含量，特別是乙酸乙酯的含量。因此金香霸屬于清香型功能菌，能明顯提升清香型酒或清香型小曲酒中酯類物質(zhì)的含量。

2.2 金香霸配合釀酒曲與其他酒曲相比對發(fā)酵結(jié)果的影響

通過實驗明確了金香霸的最佳應(yīng)用方法，我們收集了本地土曲對比釀酒曲和一些酒作坊常使用高酒酵母加糖化酶等添加不同的酒曲做對比進(jìn)行了以下研究。發(fā)酵過程中香霸均采用先培菌后添加酒曲的工藝。

2.2.1 不同酒曲發(fā)酵的理化指標(biāo)比較（表3）

從表3可以看出，4種酒曲中，釀酒曲的殘淀粉、殘還原糖最低，同時發(fā)酵酒精度最高。相對于高酒酵母加糖化酶進(jìn)行發(fā)酵，釀酒曲的發(fā)酵酒精度、總酯含量更高，殘淀粉含量和殘?zhí)呛扛?，發(fā)酵特性具有明顯優(yōu)勢。本地土曲相比釀酒曲和高酒酵母加糖化酶的總酯含量明顯較高，為1.2 g/L，略低于金香霸加釀酒曲組的1.8 g/L。本地曲發(fā)酵酒精度在4組酒曲中最低，為9%vol，殘淀粉和殘還原糖最高，分別為2.12 g/L和1.5 g/L，說明土曲的發(fā)酵力較低，應(yīng)用于生產(chǎn)的酒產(chǎn)量相對其他組會最少。金香霸加釀酒曲組總酯含量最高，為1.8 g/L，發(fā)酵酒精度高于土曲組，能達(dá)到10%vol。綜合以上分析表明，釀酒曲出酒率最高，土曲最低；金香霸加釀酒曲組香味物質(zhì)濃度最高，高酒酵母加糖化酶組最低。土曲的糖化力和發(fā)酵力均低于其他組。

2.2.2 不同曲發(fā)酵的風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果比較（表4）

由表4可看出，高酒酵母加糖化酶組風(fēng)味物質(zhì)含量最低，酒的風(fēng)味較差。釀酒曲的風(fēng)味，土曲的各種酯含量均高于釀酒曲組和高酒酵母加糖化酶組；除己酸丙酯含量（29.96 mg/L）較高以外，所測的其他風(fēng)味物質(zhì)含量均低于金香霸加釀酒曲組。從數(shù)據(jù)上看金香霸加釀酒曲組的乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇含量分別為912.56 mg/L、9.48 mg/L、46.72 mg/L和70.94 mg/L，說明金香霸配合釀酒曲采用金香霸先培菌后加釀酒曲的發(fā)酵工藝生產(chǎn)的酒的風(fēng)味物質(zhì)較土曲好，出酒率較土曲更高，更適合應(yīng)用在小曲白酒中。

表3 不同的酒曲發(fā)酵理化指標(biāo)

表4 不同酒曲發(fā)酵的風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果 (mg/L)

2.3 金香霸配合釀酒曲在小型酒廠中的應(yīng)用

進(jìn)行本實驗的工廠小曲酒工藝過程中有糖化培菌24 h，在不改變工藝條件下，能加入金香霸培菌24 h，再加入釀酒曲和水進(jìn)行發(fā)酵，實驗結(jié)果見表5。

表5 金香霸配合釀酒曲在小曲酒生產(chǎn)中的應(yīng)用結(jié)果

由表5可知，采用金香霸配合釀酒曲進(jìn)行發(fā)酵，總酯含量為1.2 g/L、乙酸乙酯的含量為961.3 mg/L，乳酸乙酯含量為313.4 mg/L和β-苯乙醇含量為146 mg/L，都明顯高于采用純種根霉酒曲發(fā)酵組；總酸和雜醇油的含量兩組基本相當(dāng)，出酒率釀酒曲加金香霸組略高。說明金香霸的產(chǎn)香能力明顯，再配合釀酒曲出酒率高的特點，在生產(chǎn)中在保證出酒率的條件下明顯提升酒的香氣物質(zhì)，提高酒的優(yōu)級品率。

3 結(jié)論和展望

清香型復(fù)合功能菌金香霸在發(fā)酵過程中能增加酒體的香氣物質(zhì)，但隨著生產(chǎn)應(yīng)用方法不同，產(chǎn)香能力也會有很大的差異。本試驗通過研究其應(yīng)用條件發(fā)現(xiàn)，金香霸在發(fā)酵過程單獨進(jìn)行培菌后再配合釀酒曲進(jìn)行發(fā)酵能使其產(chǎn)香能力最大化。通過比較幾種在目前清香型小曲酒的生產(chǎn)工藝中應(yīng)用的酒曲，采用金香霸配合釀酒曲能集合產(chǎn)香和出酒率高兩個優(yōu)點，在保證出酒率的前提下明顯提高乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇的含量，其中乙酸乙酯含量提升最為明顯。

白酒生產(chǎn)過程是多菌種作用發(fā)酵的復(fù)雜體系，目前白酒功能菌的研究大部分為白酒酒曲和發(fā)酵過程中重要的模式菌株的分離、篩選和鑒定，但對復(fù)合型功能微生物的應(yīng)用研究較少。復(fù)合功能菌的特點是能夠從多個維度去強(qiáng)化大曲，優(yōu)化關(guān)鍵風(fēng)味指標(biāo)從而提高優(yōu)級品率。目前我們的主要研究集中在多菌種復(fù)合對強(qiáng)化大曲的影響和提高小曲酒品質(zhì)等等，包括復(fù)合功能菌的應(yīng)用方法和代謝的特點。

隨著白酒行業(yè)的發(fā)展，很多酒廠正在進(jìn)行機(jī)械化改造，未來采用復(fù)合功能菌來彌補(bǔ)機(jī)械化過程中發(fā)酵微生物體系也顯得尤為重要，因此未來需要在單一功能微生物的篩選和研究上進(jìn)一步研究多微生物共體系發(fā)酵的特點，包括酶系變化、代謝產(chǎn)物、對酒香氣變化，以及各微生物之間共生長的影響和在不同生產(chǎn)階段過程的協(xié)調(diào)性等。