蛋白桑組織培養(yǎng)探究

崔吉浩　高世慶　宗憲春

蛋白桑組織培養(yǎng)探究

崔吉浩高世慶宗憲春

（牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院黑龍江牡丹江157011）

本研究以蛋白桑帶腋芽的莖段為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行蛋白桑再生體系的建立。結(jié)果顯示，蛋白桑莖段適宜消毒組合為75%乙醇20 s＋升汞7 min，萌發(fā)率達(dá)89.47%，但污染率24%；不定芽增殖方面，適宜培養(yǎng)基為MS＋3 mg/L 6BA，不定芽增殖系數(shù)達(dá)到4.50；在生根培養(yǎng)方面，蛋白桑適宜生根培養(yǎng)基為MS＋0.1 mg/LNAA和1/2 MS＋0.1 mg/LNAA，生根率均為96%，但從節(jié)約成本上看，更適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.1mg/LNAA；在煉苗移栽方面，煉苗最佳天數(shù)為4 d，成活率達(dá)到88%。

蛋白桑；組織培養(yǎng)；植株再生

蛋白桑，別名飼料桑，也叫雅津蛋白桑，是1998年北京桑梁技術(shù)發(fā)展中心科學(xué)家從全國(guó)28個(gè)桑樹品種中優(yōu)選培育出的雜交優(yōu)勢(shì)桑，其是一種適合我國(guó)南北方栽培，高產(chǎn)、高效、高蛋白的優(yōu)質(zhì)?？茦浞N[1-2]。蛋白桑具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、生態(tài)價(jià)值以及藥用價(jià)值。蛋白桑是優(yōu)良的畜禽飼料，在反芻動(dòng)物的飼草料的配制研究方面具有很高的潛在價(jià)值[3]。本研究以蛋白桑莖段作為實(shí)驗(yàn)材料，探究不同濃度配比的MS培養(yǎng)基及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)蛋白桑莖段不定芽增殖的影響，以及不同激素濃度的培養(yǎng)基中不定芽生根的差異，并分析煉苗時(shí)間對(duì)蛋白桑移栽馴化的影響，從中篩選出適宜蛋白桑莖段不定芽增殖和生根的培養(yǎng)基方案，為蛋白桑快速繁殖和種質(zhì)資源保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)原材料為蛋白桑種子，由牡丹江師范學(xué)院提供，播種生長(zhǎng)成植株后，取帶腋芽的莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 外植體的培養(yǎng)

選取飽滿、無損傷的蛋白桑種子，先用50 ℃左右的溫水浸泡種子，然后自然冷卻到室溫，浸種24 h后播種到花盆中，室溫下培養(yǎng)，待長(zhǎng)成植株后備用。

1.2.2 外植體的消毒

截取蛋白桑生長(zhǎng)健壯的一年生枝條的中上部，用自來水沖洗1 h后將其剪成1 cm～2 cm的莖段（每個(gè)小段至少帶有一個(gè)芽點(diǎn)），置于超凈工作臺(tái)。先用75%的乙醇消毒20 s，然后用無菌水沖洗4次～5次，再用0.2%的升汞設(shè)置不同的時(shí)間（5 min、7 min、9 min）進(jìn)行消毒，最后用無菌水沖洗4次～5次。將消毒后的莖段置于帶有濾紙已滅菌的培養(yǎng)皿中，吸收完多余水分后，接種于MS培養(yǎng)基中。每個(gè)消毒處理接種10瓶，每瓶接種5個(gè)莖段，重復(fù)3次。15 d后觀察并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率和污染率，公式如下：

污染率＝接種污染數(shù)/接種總數(shù)×100%

萌發(fā)率＝芽點(diǎn)萌發(fā)個(gè)數(shù)/（接種芽點(diǎn)的總個(gè)數(shù)－污染的芽點(diǎn)個(gè)數(shù)）×100%

1.2.3 不定芽的增殖

截取帶有腋芽的莖段，在不同植物激素濃度的MS培養(yǎng)基（見表2）中進(jìn)行接種，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種3個(gè)，重復(fù)3次。30 d后觀察不同激素濃度的培養(yǎng)基中不定芽的增殖情況，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算增殖系數(shù)，公式如下：

增殖系數(shù)＝高于0.5 cm的苗總數(shù)/接種數(shù)×100%

1.2.4 生根培養(yǎng)

選擇長(zhǎng)至2 cm～3 cm且生長(zhǎng)良好的不定芽，在無菌條件下進(jìn)行剪切，將其接種到不同濃度植物激素配比的培養(yǎng)基（見表3）中。每種培養(yǎng)基接種50瓶，每瓶接種1個(gè)，15 d以后觀察統(tǒng)計(jì)生根情況，并計(jì)算生根率，公式如下：

生根率＝形成根的芽數(shù)/接種的芽總數(shù)×100%

1.2.5 煉苗和移栽

生根15 d后，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好且根系發(fā)育較好的植株，打開培養(yǎng)瓶封口膜，分別煉苗0 d、2 d、4 d和6 d。煉苗后從無菌瓶中取出植株，沖洗干凈培養(yǎng)基，移栽到盛有滅菌土的花盆中，室溫下培養(yǎng)，觀察20 d，記錄生長(zhǎng)情況。

1.2.6 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基中均添加30 g蔗糖、6 g瓊脂，pH值調(diào)至5.8，分裝后在121 ℃的濕熱環(huán)境中滅菌20 min，室溫冷卻備用。接種后，培養(yǎng)瓶置于溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度2 000 lx～2 500 lx，光照時(shí)間14 h/d的條件下培養(yǎng)。

1.2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)用Excel軟件處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)蛋白桑莖段的影響

經(jīng)過不同的消毒時(shí)間處理，培養(yǎng)15 d后蛋白桑莖段的萌發(fā)和污染情況如表1所示。從表中數(shù)據(jù)可以看出，用75%乙醇和升汞對(duì)蛋白桑莖段進(jìn)行消毒處理，不同的消毒時(shí)間影響蛋白桑不定芽的萌發(fā)。其中，75%乙醇消毒20 s＋升汞消毒7 min的萌發(fā)率最高，為89.47%，但污染率達(dá)24%。75%的乙醇消毒時(shí)間一定，隨著升汞消毒時(shí)間延長(zhǎng)至9 min，污染率降低，僅為16%，但芽點(diǎn)萌發(fā)個(gè)數(shù)以及萌發(fā)率下降，萌發(fā)個(gè)數(shù)為72個(gè)，萌發(fā)率僅為57.14%，可能是升汞的處理時(shí)間過長(zhǎng)，對(duì)幼嫩的外植體產(chǎn)生的傷害較大，對(duì)外植體的表面保護(hù)層及芽點(diǎn)生長(zhǎng)處造成了破壞。

表1不同消毒時(shí)間下蛋白桑莖段的萌發(fā)和污染情況

編號(hào)溶液及處理時(shí)間接種個(gè)數(shù)污染個(gè)數(shù)污染率/%萌發(fā)個(gè)數(shù)萌發(fā)率/% 75%乙醇/s氯化汞/min M120515039269686.49 M2207150362410289.47 M320915024167257.14

2.2 蛋白桑的不定芽增殖

不同激素濃度配比的培養(yǎng)基中，不定芽增殖情況如表2所示。由表2可以看出，僅添加3 mg/L 6-BA（細(xì)胞分裂素）的培養(yǎng)基（CB6）中，不定芽增殖效果最好，增值系數(shù)達(dá)4.50。

表2不同植物激素組合中不定芽的增殖情況

編號(hào)激素種類及用量接種個(gè)數(shù)增殖個(gè)數(shù)增殖系數(shù) 6-BA/mg/LKT/mg/L CBK111901171.30 CBK21.51.5901261.40 CK302901301.45 CK403901261.40 CB520902923.25 CB630904054.50

2.3 蛋白桑的生根培養(yǎng)

不同濃度NAA和MS配比的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 d后不定芽生根情況如表3所示。

表3生根培養(yǎng)基的配方及生根率

編號(hào)培養(yǎng)基組成生根率/% CS1MS＋0.1 mg/LNAA96 CS2MS＋0.2 mg/LNAA95 CS3MS＋0.3 mg/LNAA88 CS41/2 MS＋0.1 mg/LNAA96 CS51/2 MS＋0.2 mg/LNAA94 CS61/2 MS＋0.3 mg/LNAA92

一般無菌芽接種15 d后即可生根，而培養(yǎng)基中添加植物激素，對(duì)生根影響顯著。由表3可知，MS培養(yǎng)基中添加NAA濃度為0.1 mg/L、0.2 mg/L時(shí)，生根率分別為96%和95%，且根系粗壯、數(shù)量較多。1/2 MS培養(yǎng)基中添加NAA濃度為0.1 mg/L和0.2 mg/L時(shí)，生根率分別為96%和94%，根系粗壯、數(shù)量多。從節(jié)約成本的角度考慮，1/2 MS＋0.1 mg/LNAA組合的培養(yǎng)基（CS4）更適宜作為蛋白桑生根培養(yǎng)基方案。

同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，生根期間根部均出現(xiàn)不同程度的褐化，可能是桑樹自身分泌物導(dǎo)致，但其對(duì)根的生長(zhǎng)幾乎沒有影響。

2.4 蛋白桑的煉苗移栽

蛋白桑生根培養(yǎng)15 d后，打開培養(yǎng)瓶封口膜，煉苗4 d，然后進(jìn)行移栽，蛋白桑幼苗生長(zhǎng)茁壯，成活率最高，達(dá)88%。煉苗2 d后進(jìn)行移栽，蛋白桑幼苗葉片少許發(fā)黃，生長(zhǎng)較慢。煉苗6 d后進(jìn)行移栽，幼苗葉片蜷縮，枯萎現(xiàn)象較為嚴(yán)重，死亡過半。而未進(jìn)行煉苗的蛋白桑移栽至花盆后，枯萎現(xiàn)象嚴(yán)重，最終全部死亡。因此，蛋白桑適宜煉苗時(shí)間為4 d，幼苗長(zhǎng)勢(shì)較好。

3 討論

3.1 植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的污染問題

進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，材料帶菌、操作不規(guī)范以及其他不利的環(huán)境因素，均會(huì)導(dǎo)致污染情況的發(fā)生[4]。細(xì)菌污染的主要特征是實(shí)驗(yàn)材料表面產(chǎn)生黏液狀物質(zhì)，或是渾濁的水跡狀物質(zhì)，應(yīng)注意徹底消毒實(shí)驗(yàn)用具。常見的真菌污染有曲霉屬、鐮刀霉屬以及青霉屬等的真菌，防治真菌污染時(shí)，常用的殺菌劑種類較多，如酒精、氯化汞、次氯酸、漂白粉等[4]。殺菌劑可以有效地殺死植物組織表面帶有的真菌，但其要易漂洗或自行分解，如果出現(xiàn)殘留，將會(huì)對(duì)植物組織產(chǎn)生毒害作用[5]。此外，定期對(duì)超凈工作臺(tái)等相關(guān)儀器進(jìn)行消毒及規(guī)范無菌操作很有必要。

秦新慧等[6]（2016）在沙地蛋白桑高效組培快繁體系的建立中，對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行消毒時(shí)，使用75%的乙醇消毒20 s，然后用濃度0.1%的氯化汞溶液消毒8 min，污染率為28%。本實(shí)驗(yàn)使用濃度為75%的乙醇和0.2%的升汞作為消毒劑，采用不同的消毒時(shí)間，篩選出蛋白桑莖段適宜的消毒時(shí)間組合為75%乙醇20 s＋升汞7 min，污染率為24%。

3.2 植物激素對(duì)芽增殖的影響

植物激素是通過微小劑量便能夠圍繞植物的生長(zhǎng)發(fā)育開展相應(yīng)調(diào)控的生物活性物質(zhì)[7]，其作為植物體內(nèi)的特殊信息傳輸載體，即便含量不高，也能顯著影響植物體的生長(zhǎng)和繁殖[8]。不同種類的激素組合，不同的濃度配比，對(duì)植物體的不定芽再生產(chǎn)生不同影響?，F(xiàn)在普遍使用的植物激素有6-BA、NAA、KT、ZT、2,4-D等。陳權(quán)等（2021）在不定芽增殖中使用濃度為3.0 mg/L的6-BA，增殖速度快，增殖系數(shù)為2.65[9]。劉明輝等（2003）通過研究得出，細(xì)胞分裂素6-BA可能是桑樹不定芽增殖的必需物質(zhì)[10]。本實(shí)驗(yàn)中，與陳權(quán)等[9]（2021）的分析結(jié)果一致，使用3.0 mg/L的6-BA不定芽增殖效果最好；采用不同的激素組合來分析其對(duì)誘導(dǎo)芽增殖的影響，可以發(fā)現(xiàn)6-BA濃度是誘導(dǎo)芽增殖的關(guān)鍵，與劉明輝等[10]（2003）的結(jié)論一致。

4 結(jié)論

本研究通過蛋白桑再生體系的建立，得到蛋白桑莖段適宜消毒組合為75%乙醇20 s＋升汞7 min，萌發(fā)率89.47%，污染率24%；不定芽增殖方面，適宜培養(yǎng)基為MS＋3 mg/L 6BA，不定芽增殖系數(shù)達(dá)到4.50；此外，蛋白桑適宜生根培養(yǎng)基為MS＋0.1 mg/LNAA和1/2 MS＋0.1 mg/LNAA，生根率均為96%，但從節(jié)約成本的角度考慮，更適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.1mg/LNAA；在煉苗移栽方面，煉苗適宜天數(shù)為4 d，成活率高達(dá)88%。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2022.04.03

S888

A

2095-1205(2022)04-07-03

黑龍江省教育廳項(xiàng)目（20200177）

崔吉浩（1996- ），男，黑龍江牡丹江人，碩士研究生，研究方向?yàn)檫z傳育種與生物技術(shù)。

宗憲春（1966- ），女，山東金鄉(xiāng)人，博士，教授，研究方向?yàn)檫z傳育種與生物技術(shù)。