微小RNA在胰腺癌診斷中的研究進(jìn)展

謝雨婷 高軍

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433

【提要】 微小RNA(miRNA)是由20～22個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，參與基因表達(dá)調(diào)控，其異常表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示miRNA有望成為胰腺癌診斷的生物標(biāo)志物。

微小RNA(MicroRNA,miRNA)為真核生物核DNA編碼的內(nèi)源性非編碼小RNA，是由20～22個(gè)核苷酸組成的單鏈聚合物，它們與調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的靶信使RNA(messenger RNA,mRNA)的互補(bǔ)序列結(jié)合，主要在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮致癌或抑癌的作用[1-4]。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNA的抑制或上調(diào)與胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此miRNA有望成為胰腺癌診斷的生物標(biāo)志物。本文就其在胰腺癌診斷中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、miRNA在胰腺癌中的作用機(jī)制

miRNA可以靶向數(shù)百種不同的mRNA，一種mRNA也可以成為眾多miRNA的靶標(biāo)[5]。miRNA通過與mRNA的3′UTR處的多個(gè)靶標(biāo)結(jié)合，誘導(dǎo)翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄本降解，而這取決于miRNA分子與靶標(biāo)mRNA之間的互補(bǔ)程度[6]。miRNA在幾乎所有生物過程中都顯示出廣泛的調(diào)節(jié)活性，例如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等[7]。由于miRNA可以靶向癌癥相關(guān)基因，因此可作為致癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和(或)抑制細(xì)胞凋亡，或者作為腫瘤抑制因子，抑制腫瘤的發(fā)生[8]。研究表明，乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌中都發(fā)現(xiàn)了一些表達(dá)異常的miRNA的[9]，因此通過分析這些特定的miRNA有助于腫瘤的診斷，同時(shí)還可以判斷腫瘤分期及患者的治療反應(yīng)和預(yù)后等[9-11]。

miR-21是研究廣泛的miRNA之一，在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等多種類型的腫瘤中顯著上調(diào)，還在腫瘤生長、侵襲和化學(xué)耐藥性的關(guān)鍵信號(hào)通路中起作用[12]。已被證實(shí)miR-21在胰腺癌中顯著上調(diào)[13-15]，并與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及吉西他濱耐藥性有關(guān)[13,16-17]。更重要的是，在早期胰腺癌組織中即可檢測(cè)到miR-21[18]。此外，胰腺腫瘤細(xì)胞可通過誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞表達(dá)miR-21來提高其侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[19]。

研究發(fā)現(xiàn)miR-148a在胰腺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌和非小肺癌中顯著低表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞侵襲性和患者較差的存活率相關(guān)。miR-148a主要作為轉(zhuǎn)移抑制因子，通過下調(diào)波形蛋白和上調(diào)E-鈣黏蛋白，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20-22]。SMAD2是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的腫瘤抑制基因，miR-148a通過調(diào)節(jié)SMAD2抑制TGF-β介導(dǎo)的EMT來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[23]，并可抑制光甘草定治療后的TGF-β/SMAD2信號(hào)通路來減弱腫瘤細(xì)胞自我更新、復(fù)制等特性[24]。研究報(bào)道，miR-148a在胰腺癌和胰腺上皮內(nèi)瘤變組織樣本中的表達(dá)均受到抑制，且在胰腺上皮內(nèi)瘤變中還觀察到miR-148a編碼區(qū)的DNA異常高甲基化，由此推測(cè)胰腺癌細(xì)胞中miR-148a的表達(dá)受抑制可能也是由于編碼區(qū)的DNA高甲基化[25]。Liffers等[26]通過胰腺癌細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因分析觀察到細(xì)胞分裂周期25B重組蛋白(CDC25B)是miR-148a的潛在靶標(biāo)。此外，通過基于慢病毒介導(dǎo)的miR-148a在IMIM-PC2胰腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)的體外模型，他們證明了miR-148a過表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長潛力具有抑制作用。多項(xiàng)研究證明，miR-148a過表達(dá)在不同的胰腺癌模型中均產(chǎn)生顯著的抗腫瘤活性[27-29]。

研究表明miR-217具有腫瘤抑制功能。miR-217低表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖，增強(qiáng)腫瘤侵襲能力[30-31]。Zhao等[32]分析了胰腺癌患者正常胰腺組織和腫瘤組織以及胰腺癌細(xì)胞系中的miRNA表達(dá)譜，與正常胰腺組織相比，miR-217在胰腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)均顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-217后則可顯著抑制細(xì)胞生長，且與 KRAS基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外，對(duì)胰腺癌小鼠模型注射miR-217表達(dá)載體治療后，觀察到腫瘤體積變小，腫瘤生長受抑制，提示其具有治療胰腺癌的潛力。

miR-23a位于致癌的miR-23a/24/27a簇中，其在胃癌中高度過表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長[33]。在結(jié)直腸癌干細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜中，miR-23a表達(dá)最高，miR-23a過表達(dá)可抑制轉(zhuǎn)移抑制因子1，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲等[34-35]，而抑制miR-23a表達(dá)則會(huì)抑制上述病理過程。Liu等[36]報(bào)道，miR-23a在6種體外胰腺癌模型中差異性上調(diào)，miR-23a過表達(dá)與抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的凋亡蛋白酶激活因子1 表達(dá)水平降低相關(guān)聯(lián)，表明了miR-23a在胰腺癌中同樣具有致癌作用。

二、miRNA在胰腺癌診斷中的作用

1.胰腺組織標(biāo)本中miRNA的表達(dá)：胰腺內(nèi)可疑腫塊的組織學(xué)評(píng)估通常需要通過對(duì)原發(fā)腫塊或其轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行活檢，但獲得的組織量少且常有炎癥性改變，因此容易漏診且良惡性疾病難以鑒別。而miRNA具有較高的穩(wěn)定性，可以在極少量組織和炎癥性改變的樣本中被檢測(cè)到。Bloomston等[37]分析了1 100多個(gè)miRNA在正常胰腺、慢性胰腺炎和胰腺癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)90%的標(biāo)本中有21個(gè)高表達(dá)的miRNA和4個(gè)低表達(dá)的miRNA能正確區(qū)分胰腺癌和正常胰腺組織，15個(gè)高表達(dá)的miRNA和8個(gè)低表達(dá)的miRNA將胰腺癌與慢性胰腺炎區(qū)分開來，準(zhǔn)確率為93.0%。Schultz等[38]在170例胰腺癌和107例壺腹腺癌組織中分析了miRNA作為診斷腫瘤生物標(biāo)志物的潛在作用。他們?cè)u(píng)估了664個(gè)miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)84個(gè)miRNA在胰腺癌和正常胰腺組織之間差異表達(dá)，其中胰腺癌組織中43個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，41個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。此外，與慢性胰腺炎相比，胰腺癌組織中17個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，15個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。該研究采用19個(gè)miRNA對(duì)胰腺癌和壺腹腺癌與慢性胰腺炎和正常胰腺組織進(jìn)行鑒別診斷，其靈敏度為98.5%，準(zhǔn)確率為97.0%，陽性預(yù)測(cè)值為97.8%。Xue等[39]對(duì)胰腺腫瘤切除標(biāo)本中的miRNA表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示相比于正常胰腺組織，胰腺上皮內(nèi)瘤變Ⅱ～Ⅲ級(jí)及胰腺癌組織中的miR-148a、miR-217表達(dá)水平下調(diào)，miR-196表達(dá)水平顯著上調(diào)。此外，他們還檢測(cè)到miR-21在胰腺癌中過表達(dá)，miR-10b在胰腺上皮內(nèi)瘤變Ⅱ～Ⅲ級(jí)中高表達(dá)。Yao等[40]通過公共數(shù)據(jù)集篩選出胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織中差異表達(dá)的基因，并對(duì)其功能和信號(hào)通路進(jìn)行了富集分析，發(fā)現(xiàn)6個(gè)靶向間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal epithelial transition，MET)因子的miRNA(miR-1-3p、miR-31-5p、miR-340-5p、miR-23b-3p、miR-34a-5p和miR-130a-3p)，其中miR-1-3p、miR-23b-3p、miR-34a-5p、miR-130a-3p具有MET的保守結(jié)合位點(diǎn)，可以通過PI3K/AKT信號(hào)通路靶向MET，從而影響胰腺癌的進(jìn)程，提示這4個(gè)miRNA可以作為MET/PI3K/AKT途徑的上游調(diào)節(jié)劑，并有望成為胰腺癌患者診斷的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

2.血清中miRNA的表達(dá)：雖然組織樣本中的miRNA可能有助于診斷胰腺癌，但是對(duì)于胰腺癌的早期診斷來說，血清中miRNA的實(shí)際應(yīng)用可能更為廣泛。敏感、無創(chuàng)且易于獲得的血清miRNA檢測(cè)具有巨大潛力，有望成為胰腺癌患者的新型篩查方法。目前已報(bào)道與胰腺癌相關(guān)的血清miRNA主要有miRNA-18a、miRNA-16、miRNA-196a、miRNA-221、miRNA-223、miR-1290、miR-1246等，為血清miRNA作為分子標(biāo)志物應(yīng)用于胰腺癌的早期診斷和患者預(yù)后判斷提供了參考。Morimura等[41]將36例胰腺癌患者和30名健康志愿者的血清miRNA進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血清miR-18a濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.0001)；胰腺癌患者術(shù)后血清miR-18a水平明顯低于術(shù)前(P=0.0077)；原發(fā)性胰腺癌組織中miR-18a水平與血漿中的水平相當(dāng)。Liu等[42]用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了140例胰腺癌、111例慢性胰腺炎患者和68名健康對(duì)照者血清中miR-16、miR-21、miR-155、miR-210、miR-181a、miR-196a、miR-181b的水平。與慢性胰腺炎組和健康對(duì)照組相比，胰腺癌組7種miRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)。此外，miR-16、miR-196a和CA19-9三者聯(lián)合應(yīng)用在鑒別胰腺癌和非胰腺癌以及胰腺癌與慢性胰腺炎方面更有效。Kawaguchi等[43]比較了47例胰腺癌患者和30名健康志愿者的血清樣本，發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血清miR-221水平顯著高于健康者(P<0.0005)，術(shù)后血清miR-221水平顯著降低(P=0.018)，且術(shù)前血清中miR-221濃度高的胰腺癌患者與腫瘤轉(zhuǎn)移和不可切除性顯著相關(guān)。此外，有研究比較了71例胰腺癌患者與67名健康者的血清miR-223水平，發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血清miR-223水平顯著高于健康對(duì)照者(P<0.0001)[44]。Zou等[45]從129例胰腺癌患者和107名健康對(duì)照者的血清樣本中提取了miR-7b-5p、miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-25-3p、miR-192-5p和miR-223-3p，發(fā)現(xiàn)這6種miRNA鑒別胰腺癌患者與健康者的靈敏度為95.3%，特異度為76.7%。Wei等[46]通過對(duì)3個(gè)獨(dú)立的GEO數(shù)據(jù)集進(jìn)行綜合分析，選擇了兩個(gè)上調(diào)的miRNA(miR-1290、miR-1246)，然后在120例胰腺癌、40例胰腺良性疾病患者和40名健康對(duì)照者中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，胰腺癌患者的血清miR-1290和miR-1246表達(dá)水平升高，且在腫瘤切除后顯著降低(P值<0.001)；miR-1290的AUC大于miR-1246、CA19-9(0.91比0.81、0.82)，相比于單獨(dú)用CA19-9，CA19-9結(jié)合上述單個(gè)或兩個(gè)miRNA更容易將胰腺癌患者與正常對(duì)照者鑒別開來。提示血清miR-1290、miR-1246或許可以成為胰腺癌診斷的生物標(biāo)志物，CA19-9與miR-1290或miR-1246的聯(lián)合檢測(cè)可以提高診斷胰腺癌的準(zhǔn)確率。

3.糞便中miRNA的表達(dá)：由于糞便中存在不斷脫落壞死的細(xì)胞，因此糞便可能也是一種潛在的生物樣本，用于檢測(cè)其中的miRNA作為診斷胰腺癌的生物標(biāo)志物。Link等[47]發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，胰腺癌患者糞便樣本中miR-196a、miR-216a、miR-143的表達(dá)水平較低。在另一項(xiàng)研究中，胰腺癌組糞便中miR-181b和miR-210的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組[48]。Yang等[49]對(duì)30例胰腺癌、10例慢性胰腺炎患者和15名健康對(duì)照者的糞便標(biāo)本進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與慢性胰腺炎或健康對(duì)照者比較，胰腺癌患者miR-21和miR-155的表達(dá)水平較高，而miR-216的表達(dá)水平較低，提示糞便中的miR-21、miR-155和miR-216具有作為胰腺癌診斷標(biāo)志物的潛力，但由于樣本量少，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

4.尿液中miRNA的表達(dá)：血液中含有大量的miRNA，而尿液是血液經(jīng)腎小球?yàn)V過和腎小管重吸收形成的，因此尿液中也存在miRNA。此外，尿液比血液更方便采集，無創(chuàng)且可大量采樣，便于檢測(cè)。Debernardi等[50]用RT-PCR技術(shù)分析了101份尿液樣本，其中包括46例處于不同疾病階段的胰腺癌患者、29例慢性胰腺炎患者和26名健康對(duì)照者的尿液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者比較，miR-30e、miR-143、miR-223在I期胰腺癌患者中顯著過表達(dá)(P值分別為0.022、0.035、0.040)；與Ⅱ～Ⅳ期胰腺癌患者比較，miR-143、miR-223、miR-204在Ⅰ期患者的表達(dá)更高(P值分別為0.025、0.013、0.008)；miR-223、miR-204在胰腺癌患者和慢性胰腺炎患者間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.037、0.036)。ROC曲線分析顯示，miR-143診斷Ⅰ期胰腺癌的AUC為0.862，靈敏度、特異度分別為83.3%和88.5%；miR-143和miR-30e聯(lián)合診斷I期胰腺癌的AUC為0.923，靈敏度、特異度分別為83.3%和96.2%。這提示了檢測(cè)尿液中miRNA有望成為診斷胰腺癌的一種無創(chuàng)便捷的方法。

5.胰液外泌體中miRNA的表達(dá)：胰液外泌體中包含了與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)和miRNA等相關(guān)生物分子標(biāo)志物，且這些外泌體中的miRNA(ex-miRs)可以免受內(nèi)源性RNase活性的影響[51]。2010年Sadakar等[52]首次報(bào)道胰液中miR-21和miR-155的高表達(dá)可能是胰腺癌的潛在診斷標(biāo)志物。Nakamura等[53]比較了胰腺癌患者和慢性胰腺炎患者胰液外泌體中ex-miR-21、ex-miR-155的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者兩者的表達(dá)顯著高于慢性胰腺炎患者，兩者聯(lián)合診斷胰腺癌的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率分別為96%、75%和91%，比胰液細(xì)胞學(xué)診斷的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率高，提示ex-miR-21和ex-miR-155的表達(dá)水平有助于胰腺癌與慢性胰腺炎的鑒別診斷。

6.唾液中miRNA的表達(dá)：近年來越來越多的研究證明唾液作為一種新型的液體活檢具有診斷和判斷預(yù)后的價(jià)值[54]。唾液中包含了多種蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、miRNA、代謝產(chǎn)物和微生物群[55]。與組織和血清樣本相比，唾液具有非侵入、無創(chuàng)傷、易于獲取和存儲(chǔ)、收集成本低等優(yōu)勢(shì)，此外還具有可動(dòng)態(tài)監(jiān)控的功能，引起患者的不適感較小[56]。Humeau等[57]從7例胰腺癌、4例胰腺炎、2例胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液瘤患者和4名健康對(duì)照者唾液樣本中分別提取了RNA，通過qRT-PCR篩選出94種miRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，胰腺癌患者唾液中的miR-21、miR-23a、miR-23b、miR-29c顯著上調(diào)，靈敏度分別為71.4%、85.7%、85.7%、57.0%，且具有極高的特異度(100%)；與健康對(duì)照者比較，胰腺炎患者唾液中的miR-210和miR-let-7c過度表達(dá)，靈敏度分別為100%和75%，特異度為100%和80%；與胰腺炎患者比較，胰腺癌患者唾液中的miR-216上調(diào)，靈敏度為50%，特異度為100%。提示唾液中的miRNA或許可成為診斷胰腺癌的生物標(biāo)志物。

三、總結(jié)和展望

綜上所述，miRNA作為一種新型的胰腺癌診斷工具，其臨床應(yīng)用還依然處于起步階段，缺乏與常規(guī)診斷方法的廣泛對(duì)比研究，但其具有無創(chuàng)、便捷、安全和相對(duì)廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)。此外，miRNA還具有很強(qiáng)的抗降解能力，在極少量組織或體液如血清、尿液等中即可定量檢測(cè)到其穩(wěn)定表達(dá)，也利于該診斷技術(shù)的推廣。現(xiàn)階段miRNA診斷胰腺癌的基礎(chǔ)性臨床研究結(jié)果證實(shí)了其在胰腺癌診斷方面的巨大潛力，并能為胰腺癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。但當(dāng)前相關(guān)的臨床研究主要局限于較小樣本量的回顧性研究，還需要大型前瞻性研究加以證實(shí)，在擴(kuò)大樣本量的同時(shí)比較不同方法對(duì)于胰腺癌診斷的準(zhǔn)確率，尤其對(duì)于早期胰腺癌的診斷，最終將基于miRNA相關(guān)基因組學(xué)的胰腺癌診療流程在臨床工作中的規(guī)范化普及。有理由相信，miRNA將為胰腺癌的早期篩查診斷帶來新的曙光，未來給胰腺癌患者帶來更多的臨床獲益。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突