外泌體非編碼RNA在胰腺癌診療應(yīng)用中的研究進展

劉宗林 程春東 王擁衛(wèi)

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胰膽外科 肝脾外科教育部重點實驗室，哈爾濱 150000

【提要】 外泌體是由細胞分泌的40～150nm的納米級囊泡，含有微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA)等多種非編碼RNA。越來越多的研究表明，來源于外泌體的非編碼RNA具有高度的穩(wěn)定性和組織特異性，在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，同時，也可以作為指導(dǎo)胰腺癌臨床診斷和治療的特殊生物標志物。

近年來，外泌體由于在細胞功能方面的作用，特別是在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用，引起了研究者越來越多的關(guān)注[1-3]。外泌體是由細胞分泌的納米級囊泡，大小為40～150 nm，其內(nèi)包含DNA、RNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等血漿物質(zhì)，廣泛存在于人的尿液、唾液、腦脊液中，通過進入受體細胞，傳遞信息，從而發(fā)揮介導(dǎo)細胞間通信的作用。外泌體參與免疫反應(yīng)、呈遞抗原及RNA轉(zhuǎn)運、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等多種生物學過程。近年來越來越多的研究證實外泌體中的非編碼RNA在胰腺癌的診斷及治療中發(fā)揮重要的作用。本文就外泌體非編碼RNA在胰腺癌的診斷、預(yù)后判斷及治療等方面的潛在價值以及應(yīng)用做一綜述。

一、外泌體的概述

外泌體是由johnstone等于1987年在體外培養(yǎng)綿羊網(wǎng)織紅細胞時發(fā)現(xiàn)的，起初人們認為外泌體僅僅是網(wǎng)織紅細胞在成熟過程中移除轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的“排泄小泡”，直到近些年來隨著對外泌體研究的深入，其在細胞間的通信作用才逐漸被人們所認知。外泌體形成的最初階段是細胞膜向內(nèi)凹陷形成核內(nèi)體，核內(nèi)體在成熟的過程中不斷地向內(nèi)萌發(fā)，繼而形成含有腔內(nèi)小泡的多泡小體，其內(nèi)包含核酸以及可溶性蛋白質(zhì)成分，多泡小體通過與細胞膜融合將外泌體由原細胞釋放到細胞質(zhì)中。目前，內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體被廣泛認為在外泌體的形成和分泌過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。除此之外，外泌體中的Rabs蛋白是外泌體與受體細胞融合過程中重要的調(diào)節(jié)因子。外泌體源性的非編碼RNA自身穩(wěn)定性比較高，其分離、提取的方法通常根據(jù)外泌體不同的形態(tài)、密度、大小和表面蛋白標記而不同，目前主要有試劑盒法、超速離心法、超濾離心法、磁珠免疫法、交流電動微陣列芯片裝置法等，其中最為廣泛應(yīng)用的是超速離心法和試劑盒法[4]。但以上方法均存在生產(chǎn)率不足、分離純度不高的問題。近年來，出現(xiàn)了一些新的外泌體分離方法，如微流控器件、納米等離子體增強散射、膜介導(dǎo)的外切體分離和芯片實驗室等。雖然缺乏實驗室測試經(jīng)驗和臨床前實踐，但這些方法將有望提高外泌體的生產(chǎn)率以及純度。

二、外泌體非編碼RNA與胰腺癌的關(guān)系

1.外泌體非編碼RNA與胰腺腫瘤細胞增殖的關(guān)系：增殖失調(diào)是腫瘤轉(zhuǎn)化中最重要的因素之一，研究表明，外泌體非編碼RNA通過激活關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腫瘤細胞增殖中發(fā)揮重要的作用[5]。Li等[6]發(fā)現(xiàn)腫瘤產(chǎn)生的miR-222可以通過調(diào)控或重新等位p27來影響腫瘤細胞間的相互作用，進一步誘導(dǎo)附近的腫瘤細胞增殖。Fu等[7]的研究表明，外泌體來源的miR-98-5p表達降低不僅下調(diào)絲裂原活化激酶4(mitogen-activated protein kinase,MAPK4)進而促進胰腺癌細胞的增殖,而且激活了MAPK/ERK通路，該通路在腫瘤形成中至關(guān)重要。此外，Wang等[8]報道了外泌體miR-182通過靶向調(diào)節(jié)在細胞周期檢查點中發(fā)揮關(guān)鍵作用的pri-TrCP2，正向調(diào)控細胞的增殖能力，從而在胰腺癌的進展中起到重要的作用。一直以來，放療后腫瘤細胞加速再生被認為是導(dǎo)致治療失敗的重要原因之一[9]。Chen等[10]發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞死亡后釋放出的外泌體刺激殘余腫瘤細胞重新增殖，而circRNA可能作為外泌體的重要物質(zhì)參與腫瘤細胞的再增殖，外泌體circ0002130-外泌體miR4482-3p-NBN相互作用網(wǎng)絡(luò)提示潛在的海綿化miRNA和靶mRNA。最近，M2巨噬細胞被發(fā)現(xiàn)與胃癌和乳腺癌相關(guān)，其在胰腺癌的進展中同樣發(fā)揮作用。Yin等[11]發(fā)現(xiàn),敲除M2巨噬細胞外泌體中的lncSBF2-AS1可促進miR-122-5p的表達，進而抑制其下游X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的表達，從而抑制胰腺癌細胞的增殖。這在一定程度上揭示了M2巨噬細胞外泌體源性的lncSBF2-AS1與胰腺癌相互之間的關(guān)系。

2.外泌體非編碼RNA與胰腺腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系：侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征，也是腫瘤復(fù)發(fā)、疾病惡化甚至最終死亡的病理基礎(chǔ)。胰腺癌具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，這是胰腺癌治療效果差的主要原因。腫瘤細胞可以通過侵襲和轉(zhuǎn)移侵犯鄰近組織或者轉(zhuǎn)移到遠處，并在其他組織及器官中定植。外泌體非編碼RNA通過多種機制調(diào)控胰腺癌腫瘤細胞的自身生長及腫瘤微環(huán)境最終促進胰腺腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在衍生自胰腺腫瘤細胞的外泌體介導(dǎo)胰腺癌發(fā)展的進程中，含在外泌體內(nèi)的非編碼RNA有助于腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究報道外泌體miR-21在胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)的表達中異常活躍，這無疑對胰腺癌腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義[12]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是胰腺癌進展過程中的一個重要事件，EMT可以促進腫瘤細胞的局部浸潤以及遠處轉(zhuǎn)移[13]。研究發(fā)現(xiàn)，通過敲減外泌體miR-429和外泌體miR-141的表達可以抑制胰腺癌腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并同時提高了胰腺癌中EMT主要調(diào)控因子的表達效率[14]。Hu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，雙特異性磷酸酶(dual specificity phosphatase,DUSP)是外泌體miR-361-3P的直接作用靶點，而DUSP2可以通過直接導(dǎo)致ERK通路的失活來參與miR-361-3P誘導(dǎo)的EMT，表明miR-361-3P在胰腺癌的EMT中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Li等[6]發(fā)現(xiàn)從胰腺導(dǎo)管腺癌細胞分泌的外泌體中分離的lncRNA Sox2ot可通過充當競爭性內(nèi)源RNA促進EMT。Ma等[16]發(fā)現(xiàn)胰腺星狀細胞來源的外泌體miR-21可通過Ras/ERK通路促進腫瘤細胞的遷移，并誘導(dǎo)實現(xiàn)EMT。此外，lncRNA Sox2ot過度表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總生存率相關(guān)，其表達水平在腫瘤切除后降低[17]。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn),外泌體circRNA(circ-PDE8A)的高表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的淋巴管浸潤以及晚期TNM分期和不良的生存率相關(guān)，circ-PDE8A通過miR-338/MACC1/MET或AKT途徑促進胰腺導(dǎo)管腺癌細胞的侵襲性生長。血管生成是不同腫瘤細胞發(fā)生和發(fā)展過程中的又一重要事件，腫瘤細胞在生長的過程中，需要不斷形成新的血管來為腫瘤組織提供營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)。越來越多的文獻證明外泌體非編碼RNA在胰腺癌血管生成方面發(fā)揮重要作用。Shang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶miR-27a的外泌體可以通過B細胞異位基因2(B cell translocation gene 2,BTG2)在胰腺癌中促進人微血管內(nèi)皮細胞(human microvascular endothelial cell,HMVEC)的血管生成。

三、外泌體非編碼RNA在胰腺癌診斷及預(yù)后中的應(yīng)用

胰腺癌早期缺乏特異性癥狀，而作為臨床常規(guī)篩查的腫瘤標志物CA19-9的靈敏度和特異度相對較低[20-21]。外泌體富含蛋白質(zhì)、mRNA及非編碼RNA，可以充當細胞間RNA轉(zhuǎn)移的介質(zhì)，保護其中的RNA不被RNA酶降解，從而確保血液循環(huán)中RNA的穩(wěn)定性[22]，目前已開展大量關(guān)于外泌體提高胰腺癌早期發(fā)現(xiàn)率的研究，研究熱點為蛋白和非編碼RNA，其中非編碼RNA中的miRNA作為胰腺癌診斷和預(yù)后的生物標志物的潛力受到越來越多的關(guān)注[23]。

有學者檢測了49例患者(22例胰腺癌、6例胰腺良性腫瘤、6例慢性胰腺炎、7例壺腹癌)及8例健康對照者的血清外泌體miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，49例患者miR-17-5p和miR-21表達明顯增高，其作為腫瘤標志物的靈敏度及特異度分別為72.7%、92.6%和95.5%、81.5%。同時該研究結(jié)果顯示miR-17-5p在轉(zhuǎn)移和晚期胰腺癌中表達增高，表明其可以作為不可切除胰腺癌患者的生物標志物[24]。同時在miR-10b、miR-550、miR-196a、miR-1246及miR-451a的研究中也得到相似的結(jié)果[25-28]。這些結(jié)果表明從胰腺癌細胞中分離的外泌體miRNA可以作為早期診斷胰腺癌的生物標志物。除了血清外泌體標志物外，唾液中外泌體miRNA在診斷胰腺癌方面也具有較大潛力。Machida等[29]在包括12例胰膽管癌患者和13名健康者的研究中發(fā)現(xiàn)，唾液外泌體miR-1246和miR-4644可以作為胰膽管癌早期生物標志物，靈敏度及特異度分別為66.7%、100%和75.0%、76.9%。

外泌體非編碼RNA在進行預(yù)后評估方面同樣具有較大潛力。有研究證實胰腺癌患者血清外泌體中miR-155異常高表達，且與胰腺癌患者無病生存期密切相關(guān)，同時與組織中miR-155具有高度相關(guān)性，提示外泌體miR-155可作為胰腺癌患者預(yù)后的評判指標[1]。Takahasi等[28]研究證實外泌體miR-451a在術(shù)后復(fù)發(fā)的胰腺癌患者中顯著增高，miR-451a高表達與胰腺癌患者的總生存期和無病生存期密切相關(guān)。上述研究主要集中在胰腺癌患者和健康人體外泌體的差異表達，及胰腺癌外泌體作為診斷和預(yù)后的生物標志物，外泌體是否可以用于評估胰腺癌治療效果還需要進一步研究。另外，外泌體非編碼RNA作為一種潛在生物標志物在臨床應(yīng)用中仍存在許多障礙，如非編碼RNA穩(wěn)定性問題，以及外泌體分離純化過程復(fù)雜的問題等。

四、外泌體非編碼RNA在胰腺癌治療中的應(yīng)用

外泌體可由機體絕大多數(shù)細胞合成分泌，可攜帶蛋白質(zhì)、DNA、RNA等物質(zhì)進入細胞內(nèi)，同時外泌體可以促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移等生物過程，故調(diào)控外泌體內(nèi)的物質(zhì)可在腫瘤治療方面發(fā)揮較大潛力。目前關(guān)于外泌體在胰腺癌治療中應(yīng)用的研究主要分為3類：(1)腫瘤相關(guān)免疫刺激物；(2)藥物載體；(3)治療靶點。而外泌體非編碼RNA在其中主要作為藥物載體及治療靶點。

有研究發(fā)現(xiàn)miR-506在胰腺癌組織中顯著降低，其直接靶向激活STAT3-BCL2-BECN1通路可誘導(dǎo)胰腺癌細胞自噬凋亡，抑制胰腺癌的生長和遠處轉(zhuǎn)移，而將外泌體miR-506作為腫瘤治療藥物運輸?shù)妮d體，不但不會產(chǎn)生免疫排斥，而且可靶向運輸至胰腺癌細胞發(fā)揮其抗腫瘤功能[30]。眾所周知，吉西他濱是胰腺癌標準化療藥物，但其在胰腺癌患者中耐藥率較高。有研究表明外泌體miR-146在介導(dǎo)胰腺癌化療耐藥中發(fā)揮重要作用。該研究發(fā)現(xiàn)CAFs對吉西他濱具有耐藥性，CAFs在吉西他濱的作用下通過釋放miR-146陽性的外泌體作用于胰腺癌細胞進而誘導(dǎo)化療耐藥的形成，當加入GW4869(外泌體釋放抑制劑)抑制CAFs釋放外泌體后，胰腺癌細胞成活率顯著降低[20]。同時有研究發(fā)現(xiàn)miR-155表達增加，能誘導(dǎo)胰腺癌細胞化療耐藥的形成，獲得耐藥的胰腺癌細胞通過釋放miR-155陽性的外泌體介導(dǎo)周圍胰腺癌細胞化療耐藥的形成，這也為胰腺癌治療提供了新的靶點[1]。

五、不足與期望

外泌體非編碼RNA作為特殊的生物標志物應(yīng)用于臨床胰腺癌的診斷及治療仍處于早期的研發(fā)階段，在其真正投入于臨床使用之前仍需解決存在的各種問題。難點之一是外泌體的提取方法，目前學術(shù)界還沒有被廣泛認可的統(tǒng)一的外泌體提取方法。其二，目前對外泌體非編碼RNA的研究大多集中在表達水平的差異上，而對其分子功能的研究相對較少。其三，尚有大量的外泌體非編碼RNA沒有被發(fā)現(xiàn)，仍需更多的實驗研究來證明哪些外泌體非編碼RNA可作為胰腺癌的生物標志物。

綜上所述，外泌體非編碼RNA作為當下的研究熱點，為胰腺癌的早期臨床診斷及治療提供了新的方向，外泌體非編碼RNA已經(jīng)成為潛在的生物標志物，為胰腺癌的治療提供新的靶點。同時，外泌體非編碼RNA將有望作為一種創(chuàng)傷性小并且特異度和靈敏度均較高的檢測指標，在未來胰腺癌的無創(chuàng)診斷、治療靶點的選擇及預(yù)后的判別上發(fā)揮更大的作用。

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