微生物和酶技術(shù)促進煙葉醇化的研究進展

崔鈺杰,鄒克興,陳義昌,劉 領(lǐng),王小東,梁 偉

（1.河南科技大學農(nóng)學院，河南 洛陽 471023；2.廣西中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，廣西 南寧 530000）

煙草歷來是我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物，其種植時間大約可追溯到16世紀末至17世紀初，相繼由菲律賓傳入福建，由越南傳入廣東，由朝鮮傳入遼東。煙葉原料的采集主要包括煙葉采收、煙葉烘烤及打葉復烤等步驟，烘烤后的煙葉雖然在內(nèi)部質(zhì)量上得到一定的提升改善，但因煙葉的青雜氣較重，對人體產(chǎn)生的刺激作用較大。而煙葉醇化是能改變煙葉復烤后所產(chǎn)生的青雜氣和吸食味道過重的技術(shù)之一，微生物和酶技術(shù)是能夠促進煙葉醇化進而改善煙葉品質(zhì)的技術(shù)手段，其優(yōu)點在于醇化效果較好、易于提取、操作簡便等，具有實際的應(yīng)用價值。通過對國內(nèi)外有關(guān)微生物和酶技術(shù)促進煙葉醇化的相關(guān)應(yīng)用研究進行綜述，為縮短煙葉醇化時間和提升煙葉品質(zhì)提供理論和科學依據(jù)。

1 微生物菌種在煙葉醇化中的機理研究

1.1 醇化煙葉表面微生物的菌種和菌群

煙葉中富含較多的微生物菌種和菌群，該菌群能促使煙葉中內(nèi)部的化學反應(yīng)。1953年，西班牙人TAMAYO 等［1］從煙葉樣本中分離到芽孢桿菌（Bacillus bacteria）和球菌（Aaureus bacteria）。1972年，美國學者POUNDS 等［2］從很多煙葉樣本中分離出微生物菌株，如嗜熱性酵母菌以及細菌等。

國內(nèi)煙草研究者對煙葉中的微生物菌種和菌群研究起步較晚。1990年，謝和等［3］以烤煙NC82為試驗材料，對葉片表層微生物種類進行研究發(fā)現(xiàn)，烤煙表面有細菌、放線菌及霉菌。1997年，韓錦峰等［4］以未進行自然發(fā)酵、人工發(fā)酵、陳化的烤煙為試驗材料，探究煙葉表面的微生物數(shù)量并對發(fā)酵階段微生物的改變進行研究。結(jié)果表明，未發(fā)酵烤煙葉面微生物數(shù)量最多，隨著自然陳化及人工發(fā)酵的進行，烤煙葉面微生物數(shù)量均逐漸減少，且出現(xiàn)的芽孢桿菌屬以及梭狀芽孢桿菌屬為優(yōu)勢種群。2000年，邱立友等［5］對烤煙NC89、K326 和紅花大金元（以下簡稱紅大）3 個烤煙品種的煙樣葉面微生物的數(shù)量、種類進行分析，發(fā)現(xiàn)3個品種的烤煙葉面均存在有細菌和霉菌，但沒有酵母菌，紅大品種烤煙葉面沒有放線菌。各個煙樣的葉面微生物中，細菌的數(shù)量最多且是優(yōu)勢微生物，而霉菌所占的比例較小，放線菌所占的比例最少。自然發(fā)酵烤煙的葉面微生物數(shù)量及種類與烤煙品種、產(chǎn)地、級別以及陳化時間之間有一定關(guān)系，品質(zhì)越好，葉面微生物的數(shù)量越大，種類越多；同一品種的烤煙，等級高的煙葉葉面微生物的數(shù)量較大，種類也較多。2008年，楊金奎等［6］以云南烤煙品種K326 為試驗材料，對不同醇化時間煙葉的表面微生物進行分離，并通過分子生物學方法對分離到的微生物的種、屬分類學水平和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行分析。結(jié)果表明，K326 表面的細菌以芽孢桿菌屬及腸桿菌屬2個菌群為主，芽孢桿菌屬的細菌是優(yōu)勢微生物類群。此外，煙葉部位等級與細菌數(shù)量也呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，即在相同醇化時間的煙樣中，中部煙葉樣品的細菌數(shù)量高于下部煙葉，而上部煙葉樣品中的細菌數(shù)量最少；細菌的種類和煙葉樣品的部位等級之間沒有明顯的相關(guān)關(guān)系。該研究結(jié)果表明，利用可培養(yǎng)微生物進行分離鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定煙葉樣品中微生物種群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，根據(jù)優(yōu)勢微生物的數(shù)量和種群研制微生物添加劑應(yīng)用到煙葉中，能夠快速達到煙葉醇化的目的，加速醇化進程改善煙葉品質(zhì)。

1.2 微生物菌種改善煙葉品質(zhì)的機制

糖與蛋白質(zhì)是微生物生長發(fā)育過程中必不可少的2種物質(zhì)。在微生物繁殖過程中，通過對蛋白質(zhì)進行降解及對不同類型微量元素的吸收形成不同種類的氨基酸和生物酶。糖在微生物繁殖過程中經(jīng)過發(fā)酵，分解成各種類型有機物及有機酸等，產(chǎn)生的有機物及有機酸可產(chǎn)生一定的香味。微生物的繁殖及代謝產(chǎn)生的香氣物質(zhì)可使煙葉內(nèi)的香氣成分改變，有效增加煙葉香氣。趙銘欽等［7］以河南省郟縣烤煙品種NC89為試驗材料，對烤煙葉片中的微生物活力、酶活力、過氧化物酶活力、蛋白酶活力、α-淀粉酶活性進行測定，結(jié)果表明，在陳化過程中，烤煙煙葉中具有多酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶和α-淀粉酶活性。多酚氧化酶、蛋白酶和α-淀粉酶活性在陳化初期逐漸增加，中后期逐漸降低。多酚氧化酶和過氧化酶以及增加的蛋白酶和α-淀粉酶活性可能與微生物的活性有關(guān)。由此推斷微生物與酶在一起構(gòu)成了烤煙煙葉的生物活性，烤煙煙葉葉面活性可能是推動烤煙自然發(fā)酵的催化劑。所以，需要適當增加微生物和酶，進而縮短醇化時間提升煙葉品質(zhì)。

2 微生物在煙葉醇化中的應(yīng)用

2.1 降解煙葉中有害成分

1954年，WADA 等［8］利用土壤中分離出來的假單胞細菌（Pseudomonas）中的第41小種處理煙堿溶液24 h 后，煙堿含量大幅降低，微生物數(shù)量增大，且由于pH 的降低和菌落數(shù)的增大，煙堿的分解停止。1957年，美國的FRANKENBURG 等［9］發(fā)現(xiàn)，煙堿的降解主要發(fā)生在晾制的初始階段，可降解煙堿的細菌有10 個屬17 種，其主要有假單胞菌、煙草假單胞菌、惡臭假單胞桿菌、纖維單胞菌、爭論產(chǎn)堿菌等菌種。陳興等［10］以云南烤煙煙梗為試驗材料，將短小芽孢桿菌V35 菌株（Ba?cillus pumilusVan35）制成的菌劑用于梗絲處理。結(jié)果表明，利用V35 菌劑處理后，梗絲的總糖和還原糖均較對照有所上升，總氮含量下降，纖維素和果膠含量降低，總揮發(fā)香氣物質(zhì)量上升，總氮含量下降，V35 菌劑還可有效減少其雜氣對呼吸道的刺激，增加梗絲香氣量。薛磊等［11］以云南昆明、曲靖、保山等產(chǎn)地的醇化煙葉為微生物樣品源，利用逐級稀釋法、菌株酶活性篩選等方法對菌株產(chǎn)酶功能進行篩選，并對煙絲發(fā)酵樣品的感官質(zhì)量、香味成分、煙氣有害成分釋放量進行分析。結(jié)果表明，從供試云南微生物分離源樣品中分離、篩選到可同時產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的微生物菌株；將該菌株組合形成復合微生物配方噴施到煙絲上發(fā)酵，發(fā)酵后的煙絲樣品細膩度有所改善，香氣質(zhì)和香氣量均有增加，雜氣減輕。馬林［12］以河南靈寶烤煙B3K 為試驗材料，用酶和微生物處理煙葉，并采用煙草蛋白水解法測定煙葉化學成分。結(jié)果表明，用酶和微生物處理后，煙葉中的蛋白質(zhì)、煙氣中有害氣體、焦油生成量均有明顯下降，利用酶解法和微生物發(fā)酵法能明顯提高煙葉的吸食安全性。楊宗燦等［13］從河南、福建、云南3 省的復烤煙葉表面篩選出降解蛋白質(zhì)能力較強的菌株，通過測定產(chǎn)蛋白酶活性、16S rDNA 測序、生理生化試驗對其進行鑒定后，采用正交試驗優(yōu)化菌株在煙葉中的發(fā)酵條件，考察處理后煙葉的感官質(zhì)量改善效果。結(jié)果表明，HN-3 為優(yōu)選菌株，與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）的同源性高達100%，將HN-3 菌液按照3%的煙葉質(zhì)量比例施加于抽梗后的煙葉表面，在37℃條件下發(fā)酵84 h 后，煙葉中蛋白質(zhì)降解率可達29.66%，短小芽孢桿菌HN-3能有效降解煙葉中的蛋白質(zhì)，且能顯著改善煙葉的整體感官質(zhì)量。

尼古?。?-甲基-2-（3-吡啶基）-吡咯烷］，俗名煙堿，是一種存在于茄科植物（茄屬）中的生物堿，是煙草的重要成分，占煙葉干重的2%～8%［14］。尼古丁會使人產(chǎn)生依賴或上癮，大量攝入尼古丁能增加心跳速率，導致血壓升高并降低食欲，嚴重的還能引起心血管疾病、癌癥、基因突變、畸形等疾病發(fā)生。生物降解法是消除降解煙葉中尼古丁含量最有效的方法。陳辰等［15］以湖南省郴州市煙草種植基地的煙草為試驗材料，從樣品中提取尼古丁降解菌ZUC-3，并對不同條件下的尼古丁降解特性進行研究。結(jié)果表明，ZUC-3的適宜發(fā)酵條件為溫度30℃、起始pH 7.0、接種量10%、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min，該條件下，尼古丁降解率可達91.53%。李天麗等［16］從醇化煙葉中分離得到可降解煙堿活性的菌群Q6，從菌群Q6 中得到1 株煙堿降解菌D1，經(jīng)菌落形態(tài)、生理生態(tài)等相關(guān)性研究，將其鑒定為根癌土壤桿菌。該菌種可有效降解煙葉中的煙堿，從而達到煙葉醇化效果。這也為尼古丁的生物降解提供了新的微生物資源和技術(shù)手段。

2.2 提升煙葉品質(zhì)

研究表明采用煙葉表面接種微生物的方法可提升煙葉醇化，改善煙葉品質(zhì)，提升煙葉香氣［17］。黃靜文等［18］從烤煙葉面上分離選擇獲得一株短小芽孢桿菌Van35，將其制成菌劑噴施于煙絲，在45°C，60%溫濕度條件下發(fā)酵21 d。結(jié)果表明，發(fā)酵后的煙絲中總糖、還原糖和鉀含量升高，纖維素、蛋白質(zhì)、總氮和煙堿含量均有所下降。陳興等［19］用酪蛋白培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對醇化煙葉上分離出的細菌進行篩選得到降解蛋白質(zhì)能力較強的菌株P(guān)E1，對其蛋白酶活性的測定表明，PE1 菌株的蛋白酶活性最高，將PE1 的粗酶液用于煙絲處理，煙絲蛋白質(zhì)的分解率隨著處理濃度的提高而增加，煙絲的感官品質(zhì)也有所改善。衛(wèi)青等［20］以紅花大金元煙葉品種為試驗材料，從中篩選出一株產(chǎn)蛋白酶及多糖酶的真菌RSCT26，經(jīng)分離純化的RSCT26 進行培養(yǎng)，其菌落外觀呈圓形，黑褐色，培養(yǎng)7 d直徑約為5.5 cm。通過對醇化紅大煙葉表面分離的產(chǎn)蛋白酶及多糖酶的菌株RSCT26 進行鑒定，該菌株為鏈格孢屬（Al?ternaria alternata）。煙葉經(jīng)RSCT26 菌劑處理后，煙膏中可溶性總糖和還原糖含量顯著增加，蛋白質(zhì)和總氮含量降低，再造煙葉產(chǎn)品經(jīng)感官評吸香氣量較足，煙葉青雜氣和品質(zhì)方面都有明顯的改善。庹有朋等［21］以四川涼山云85（C3F）、2015年四川攀枝花云85（C4F）、2015年云南曲靖云85（C3F）、2015年云南楚雄云85（C2F）、2017年四川攀枝花云85（C3F）5 種煙葉等級為試驗材料，分析煙葉中微生物的菌群數(shù)量和優(yōu)勢微生物種群，共篩選出22 株優(yōu)勢菌株并添加到煙葉發(fā)酵中，控制對煙葉發(fā)酵的醇化條件，對發(fā)酵醇化的煙葉進行感官評吸與分析檢測。結(jié)果表明，煙葉中微生物主要以腸桿菌屬、芽孢桿菌屬為主，經(jīng)過7 個月發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，添加Enterobac?ter hormaechei strain C4、Enterobacter hormaechei subsp.steigerwaltii strain34998、Peanibacillus polymyxa strain HY96-2、Bacillus licheniformis strain MER TA88、Bacillus licheniformis strain POTC5 種菌株的煙葉，其香氣值、香氣量有明顯的提升，刺激性、青雜氣味得到有效控制，達到了發(fā)酵2～3年成熟發(fā)酵煙葉的效果。經(jīng)理化檢測，煙葉中的還原糖、總糖的含量都高于自然發(fā)酵的煙葉，植物堿與總氮都呈下降的趨勢，氮堿比、糖堿比、施木克值均優(yōu)于自然發(fā)酵，煙葉經(jīng)發(fā)酵后向高品質(zhì)發(fā)展。對發(fā)酵后煙葉進行高通量測序發(fā)現(xiàn)，添加的微生物成為優(yōu)勢主導發(fā)酵微生物，占微生物總量的30%以上，對煙葉醇化發(fā)酵過程中的物質(zhì)變化起到關(guān)鍵作用。阮祥穩(wěn)等［22］利用復合酶（纖維素酶、蛋白酶），在48℃、65%的相對濕度條件下對B3F、C3F、X3F 煙葉進行醇化。結(jié)果表明，發(fā)酵后煙葉的總氮含量與煙堿含量變化不大，總糖含量比對照樣品分別提高16.8%、16.2%、11.7%，平均提高14.9%。其中上部煙葉B3F增幅最大，下部煙葉X3F增幅最小，處理后煙葉的總糖含量趨于較佳值。經(jīng)酶處理后煙葉的綜合評吸效果有較大提高，煙葉品質(zhì)有明顯改善，其中香氣質(zhì)變好，香氣量增加，雜氣和刺激性減小。

隨著我國科學技術(shù)的迅速提升，技術(shù)手段和設(shè)備有了質(zhì)的改變，一些煙草科研工作者嘗試利用新的微生物技術(shù)融合來促進煙葉醇化的品質(zhì)。李源棟等［23］在煙草根際土壤中提取得到溶桿菌（C8-1），該菌能夠產(chǎn)生苯甲醛、欖香烯、欖香醇、α-桉葉醇。將噴施菌劑的煙絲放入恒溫恒箱內(nèi)發(fā)酵48 h，與對照組相比，其總糖、還原糖含量增加較大，總氮、纖維素、蛋白質(zhì)、煙堿含量有所下降，糖氮比、糖堿比、氮堿比有所改善。該處理加速了煙葉發(fā)酵，提高了煙葉等級質(zhì)量。張展等［24］通過微膠囊化技術(shù)，將微生物制劑和酶制劑進行包裹，形成利于微生物存活的微環(huán)境，從而利于微生物制劑及生物酶在煙葉表面較長時間內(nèi)發(fā)揮作用，加速煙葉中大分子物質(zhì)的降解，縮短煙葉醇化周期。劉劍鋒等［25］以釀酒葡萄為原料，利用其自帶的微生物及果肉中的糖分，在24～28℃下自然發(fā)酵制得天然酵母。該天然酵母在1～5℃環(huán)境中冷藏保持活性，經(jīng)復蘇熟成后，按5.0%～8.0%的用量施加于潤葉后的煙片，葉片在相對濕度70%～80%、溫度25～28℃與28～32℃環(huán)境下分兩個階段分別陳化36～40 h，即可達到煙葉醇化要求。該方法易操作、發(fā)酵快，陳化周期短。郝捷等［26］將煙草物料上料后切片使物料松散回潮；然后對煙草物料進行生物質(zhì)噴灑（生物質(zhì)料為蒸汽和酶制劑等體積混合的混合物），將噴灑后的煙草料物在密閉空間發(fā)酵20～150 h，溫度為30～100℃，濕度為40%～100%，對完成發(fā)酵后的物料進行干燥、包裝。該方法能夠快速進行發(fā)酵，提高了發(fā)酵效率、簡化生產(chǎn)工藝。馬俊紅等［27］在煙葉中提取一株高地芽孢桿菌J54，將該菌株制成菌劑按照煙絲重量的3%～5%進行噴施，發(fā)酵4～7 d。結(jié)果表明，高地芽孢桿菌J54可在煙葉調(diào)制或制絲過程中有效降解煙草中特有的亞硝胺（TSNAs），其降解率達5.2%～46.6%，從而改善煙葉品質(zhì)。孫蘭茜等［28］利用一種含蠟狀芽孢桿菌的生物制劑膠囊和調(diào)制后原煙煙葉進行混合，再將煙葉進行醇化處理，在自然醇化溫度下，生物制劑膠囊囊皮從固體凝膠狀變化為溶膠裝，內(nèi)部的苯乙酸甲酯流出與煙葉表面接觸，將煙葉表面的蠟質(zhì)溶解，再通過囊皮內(nèi)負載的角質(zhì)進行分解，最終通過膠囊內(nèi)的微生物對煙葉進行發(fā)酵處理，從而縮短醇化時間，提高煙葉品質(zhì)。蘇加坤等［29］將可增加煙絲香氣和加速煙絲陳化的菌株BA-01 制成生物制劑，該生物制劑短小芽孢桿菌BA-01的活菌數(shù)達109～1011CFU/g，使用時稱取0.001～0.015 g 生物制劑溶于1～10 mL 無菌水中，將其均勻噴灑于10～40 g晾曬煙絲，經(jīng)噴施處理的煙葉，其香氣更加充足，減少了刺激性，雜氣減弱，同時縮短了陳化周期。

3 酶技術(shù)在煙葉醇化中的應(yīng)用

1965年，美國菲利浦·莫里斯公司的SPANN 等［30］將煙含量約一半的煙末制成固形物稠漿，添加纖維素酶35，在室溫條件下進行發(fā)酵后制成煙草薄片，然后利用低量酶、甘油及乙酸對該煙草薄片進行處理。結(jié)果表明，處理后的煙草薄片刺激程度較低，甜味重。賀兆偉等［31］采用透明圈法和發(fā)酵液果膠酶檢測法從醇化煙片中篩選出1 株酶活較大的菌株TS63-9，初步鑒定為疣孢青霉（Peni?cillium verruculosum），該菌株產(chǎn)生的果膠酶在高溫條件下具有較高的反應(yīng)活性。楊慶等［32］以初烤煙葉為原料，研究復合酶對煙葉的醇化效果。結(jié)果表明，復合酶醇化后的煙葉，其物理構(gòu)造出現(xiàn)改變，感官品質(zhì)有一定的改善。王慧等［33］利用一種復合酶制劑來增加煙片醇厚度及香甜氣。將單酶活力在1 000～40 000 U/L 的復合酶制劑在煙片發(fā)酵過程中噴灑到煙片表面，其添加量為煙片總質(zhì)量的0.1%～3.0%，在煙片發(fā)酵或卷煙配方過程中于20～40℃下保持1～24 h。結(jié)果表明，復合酶制劑可對煙草中的蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素及煙堿等物質(zhì)進行降解，并生成氨基酸、單糖/寡糖、醇類等物質(zhì)有助于提升其飽滿度、香氣的豐富度和層次感。紀旭東等［34］將一種黑曲霉（Aspergillusniger）所生產(chǎn)的葡萄糖淀粉酶應(yīng)用到煙葉發(fā)酵中，其接種量為106CFU/mL。通風量為1∶1.0V/V·min，溫度為30℃，時間為3 d。結(jié)果表明，與對照組相比，黑曲霉能使煙葉中總糖含量升高，淀粉含量明顯降低，經(jīng)過處理的煙葉其煙氣柔順、細膩度和舒適度均有提升。米其利等［35］將一種減少煙葉特有亞硝胺的復合酶制劑均勻噴施至晾曬棚內(nèi)的煙葉的兩面，每桿煙葉噴施100～120 mL 復合酶制劑混懸液，然后將噴施處理后的煙葉置于晾曬棚內(nèi)，自然晾曬調(diào)制10～13 d。經(jīng)過復合酶制劑的處理，曬黃煙調(diào)制煙葉中亞硝胺（TSNAs）含量降低26.40%～36.81%。葉亞軍等［36］將具有產(chǎn)高酶活力中性蛋白酶的米曲霉（Asper?gillus oryzae）LCCC30141 按接種量為105～107CFU/g 添加到煙葉中，在溫度20～40℃，濕度40%～70%條件下處理5～10 d。結(jié)果表明，添加該米曲霉能加速煙葉中蛋白質(zhì)的分解，煙葉中的還原糖、硫、木質(zhì)素有明顯的減少，能明顯縮短煙葉的發(fā)酵周期，明顯改善煙葉品質(zhì)。

4 小結(jié)

隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展和工業(yè)制煙技術(shù)的飛速發(fā)展，醇化技術(shù)的重要性越來越受到煙草公司的廣泛關(guān)注。但是根據(jù)前人研究的結(jié)果來看，大多數(shù)醇化技術(shù)都表現(xiàn)為菌種單一、微生物菌群之間的關(guān)聯(lián)性較低。優(yōu)勢微生物的菌種較少、微生物制劑功能性不突出等。部分原因是由于外源生物制劑加快醇化進程的設(shè)備條件落后和煙草行業(yè)相關(guān)人才緊缺等因素的限制，使該技術(shù)或?qū)＠煌Ａ粼趯嶒炇已芯侩A段而未在實際生產(chǎn)上有大規(guī)模的應(yīng)用，造成科研成果的浪費。因此，需通過各種途徑對醇化技術(shù)進行優(yōu)化，加快醇化新技術(shù)工業(yè)化進程的開展和落實。

當前，全球經(jīng)濟一體化依舊在加速進程中，國際競爭也在日益加劇。煙草產(chǎn)業(yè)在今后的發(fā)展過程中機會與挑戰(zhàn)并存；既要加快煙葉醇化研究速度和深度，也要和國外先進煙葉醇化技術(shù)相互融合，對于提升我國煙葉質(zhì)量以及增加國內(nèi)煙草的競爭力有著不可忽視的意義。這就要求煙草科技工作者在今后研究中應(yīng)充分發(fā)揮微生物和酶學技術(shù)的相互融合并將新的技術(shù)手段貫穿于煙葉醇化領(lǐng)域，以達到規(guī)?；a(chǎn)并提高煙葉醇化效率，使再造煙葉品質(zhì)質(zhì)量進一步提升。創(chuàng)新煙葉醇化技術(shù)，將是未來煙草行業(yè)發(fā)展的主要趨勢，煙葉醇化技術(shù)勢在必行。