黑藻（Hydrilla verticillat）在鉛、鋅脅迫下的代謝組學(xué)研究

陳卓，胡芯，唐洪玉

西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，重慶 400000

水體中的鉛鋅常為相伴重金屬，其主要來(lái)源為鉛鋅礦開(kāi)采、冶煉、電池加工等工業(yè)活動(dòng)。鉛作為“重金屬五毒”之一，其在植物體內(nèi)聚集過(guò)量會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)以及影響植物的生理代謝過(guò)程，嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致植物的死亡[1]。過(guò)量的鉛進(jìn)入人體會(huì)影響人體的神經(jīng)、消化和造血系統(tǒng)，如果進(jìn)入孕婦體內(nèi)還會(huì)影響胎兒的智力。而鋅作為鉛的伴生金屬，其本身是生物體的必需元素之一，但當(dāng)其含量超過(guò)機(jī)體所需的微量需求時(shí)，同樣會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定程度的傷害[2]。黑藻（Hydrillaverticillat）又常被稱為輪葉黑藻，分類上屬于水鱉科（Hydrocharitaceae），黑藻屬（HydrillaRich），是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的敏感性植物。其對(duì)重金屬的吸附作用一直受到研究者的關(guān)注[3-10]，可作為重金屬污染環(huán)境修復(fù)植物和水體污染的指示植物[11-12]。

代謝組學(xué)（metabonomics/metabolomics）是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門新興學(xué)科，其概念是由Nicholson于1999年提出，指通過(guò)對(duì)細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)所有低分子量代謝物的定性和定量分析研究，闡明各代謝物變化規(guī)律，探討各種刺激因素對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響，從小分子代謝物視角揭示生命活動(dòng)的本質(zhì)和過(guò)程[13-14]，通過(guò)研究它們能更靈敏更準(zhǔn)確地獲知機(jī)體狀態(tài)及動(dòng)態(tài)變化過(guò)程[15-16]。代謝組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)均屬于系統(tǒng)生物學(xué)組成部分，其研究思想類似，且彼此之間有著密切聯(lián)系，但同時(shí)又有著明顯的區(qū)別[17]。在外界環(huán)境刺激下，生物體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列代謝，但不是每次刺激都會(huì)對(duì)其基因和蛋白造成顯著影響，而研究機(jī)體代謝產(chǎn)物的代謝組學(xué)能真正反映出機(jī)體已經(jīng)發(fā)生的事件[18]。因此借助代謝組學(xué)的技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)境污染物暴露帶來(lái)的毒性效應(yīng)優(yōu)勢(shì)明顯，特別是在低劑量或環(huán)境劑量污染物的毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)方面[19]。目前關(guān)于藻類在重金屬脅迫等方面的研究主要是在高濃度、單一脅迫下的吸附效果及生理生化指標(biāo)研究，對(duì)多種重金屬脅迫下黑藻的生理響應(yīng)研究較少，尤其是鉛鋅脅迫下初生代謝產(chǎn)物研究更是未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)鉛、鋅單一脅迫與鉛鋅復(fù)合脅迫下黑藻的初級(jí)代謝產(chǎn)物研究，從多個(gè)層面分析其在不同脅迫情況下的代謝差異，探究黑藻在面對(duì)鉛鋅脅迫后的響應(yīng)及作用機(jī)制，填補(bǔ)相關(guān)研究的空白并以期為鉛鋅脅迫對(duì)黑藻代謝物影響的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為鉛鋅污染檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)材料取自西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)習(xí)實(shí)訓(xùn)基地。將采集到的黑藻清洗干凈后移入室內(nèi)水池，用改良后的10% Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[20]進(jìn)行培養(yǎng)馴化，溫度為（25±0.4） ℃，pH 6.5±0.2，光照周期為12 h∶12 h（L∶D），每2天更換一次培養(yǎng)液，每天用HNO3或NaOH調(diào)節(jié)pH值。培養(yǎng)1個(gè)月后，選取新長(zhǎng)莖葉且長(zhǎng)勢(shì)一致的黑藻進(jìn)行正式試驗(yàn)。

1.2 黑藻培養(yǎng)及試驗(yàn)條件

正式試驗(yàn)容器為透明整理箱（400 mm×300 mm×200 mm），底部采用固植板將黑藻固定住，試驗(yàn)條件管理同馴化期一致。培養(yǎng)一周后進(jìn)行鉛、鋅（分別以Pb（NO3）2和ZnSO4·7H2O形式加入水體中）脅迫，試驗(yàn)采用二因素設(shè)計(jì)，鉛、鋅各濃度設(shè)置參照《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 3838—2002）中的Ⅴ類和超Ⅴ類標(biāo)準(zhǔn)濃度值，具體處理設(shè)置如表1所示，共7個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)平行。在處理28 d后采集對(duì)照組S1（CK）和處理組S4（Pb0.10）、S5（Pb0.20）、S16（Zn2.00）、S21（Zn4.00）、S19（Pb0.10+Zn2.00）、S25（Pb0.20+Zn4.00）的黑藻莖葉，液氮處理后放置于-80 ℃冰箱保存。其中每個(gè)處理組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 代謝物提取

（1）選取生長(zhǎng)狀況相似的黑藻莖葉，液氮處理后置于-80 ℃冰箱保存；（2）將保存樣品放置于凍干機(jī)中真空冷凍干燥；（3）冷凍干燥后的樣品利用研磨儀在30 Hz下研磨1.5 min至粉末狀；（4）研磨后稱取100 mg粉末狀樣品，置于0.6 mL 70%甲醇提取液中溶解；（5）將溶解后的樣品置于4 ℃冰箱過(guò)夜提取，期間渦旋6次，以提高提取率；（6）處理后的樣品在10 000g下離心10 min，吸取上清，用微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，并采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測(cè)分析。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相：A相為超純水（加入0.04%的乙酸），B相為乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，10.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，11.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量4 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）溫度設(shè)置為550 ℃，質(zhì)譜電壓設(shè)置為5 500 V，簾氣（CUR）206 850 Pa，碰撞誘導(dǎo)電離（CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級(jí)桿（QQQ）中，每個(gè)離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用UPLC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)，利用構(gòu)建的植物初生代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)，智能二級(jí)譜匹配方法對(duì)物質(zhì)定性，采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)物質(zhì)相對(duì)含量，隨后利用軟件Analyst1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過(guò)三重四級(jí)桿篩選出每個(gè)物質(zhì)的特征離子，在檢測(cè)器中獲得特征離子的信號(hào)強(qiáng)度（CPS），用MultiaQuant軟件進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作。本試驗(yàn)采用單變量、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）多元統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)代謝物進(jìn)行定性定量分析。

單變量統(tǒng)計(jì)分析方法包括參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)。多元統(tǒng)計(jì)方法PCA用R軟件（www.r-project.org/）內(nèi)置統(tǒng)計(jì)prcomp函數(shù)，設(shè)置prcomp函數(shù)參數(shù)scale=True，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。OPLS-DA在原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換后，再進(jìn)行中心化處理，利用R軟件中的Metabo AnalystR包OPLSR.Anal函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。評(píng)價(jià)OPLS-DA模型時(shí)，Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力，Q2>0.5時(shí)可認(rèn)為是有效的模型，Q2>0.9時(shí)為出色的模型。

表1 試驗(yàn)處理組設(shè)置Table 1 The settings of treatment group

本研究差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)。（1）選取差異倍數(shù)值fold change≥2和fold change≤0.5代謝物，即代謝物在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中差異為2倍以上（顯著上調(diào)）或0.5倍以下（顯著下調(diào)）認(rèn)為差異顯著。（2）在上述的基礎(chǔ)上，選取VIP≥1的代謝物。VIP值表示對(duì)應(yīng)代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強(qiáng)度，一般認(rèn)為VIP≥1的代謝物為差異顯著。

2 結(jié)果分析（Results）

2.1 黑藻初生代謝物定性分析結(jié)果

本研究基于UPLC-MS/MS檢測(cè)平臺(tái)和相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)共檢測(cè)出342個(gè)代謝物，其中有機(jī)酸126種，脂類80種，氨基酸及其衍生物71種，核苷酸及其衍生物39種，糖和醇類20種，維生素6種。

2.2 單一鉛、鋅脅迫黑藻代謝物差異分析

通過(guò)對(duì)照組（S1）與Pb0.10單一處理組（S4）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為40.84%，第二主成分（PC2）值為19.86%（圖1（a））；通過(guò)對(duì)照組（S1）與Pb0.20單一處理組（S5）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為36.97%，第二主成分（PC2）值為25.01%（圖2（a）），且各圖中的2組數(shù)據(jù)分別在X軸兩側(cè)，表明對(duì)照組和單一鉛處理組之間存在明顯差異。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，經(jīng)200次排列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，模型的有效性驗(yàn)證圖如圖1（b）、圖2（b）所示，Q2分別為0.808、0.846，表明所建模型可靠。橫線對(duì)應(yīng)原始模型的R2Y和Q2，紅點(diǎn)和藍(lán)點(diǎn)分別代表Y置換后模型的R2Y’和Q2’。R2Y’和Q2’均小于原始模型的R2Y和Q2，即相應(yīng)點(diǎn)都不超過(guò)相應(yīng)的線，說(shuō)明該模型有意義。

根據(jù)代謝物差異篩選標(biāo)準(zhǔn)（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），與對(duì)照組相比，Pb0.10單一處理組有32個(gè)顯著差異代謝物，Pb0.20單一處理組有19個(gè)顯著差異代謝物。在這些差異代謝物中，共有11個(gè)相同的差異代謝物，其中，5個(gè)代謝物出現(xiàn)了顯著上調(diào)（fold change≥2），分別為N-苯乙?；?L-谷氨酰胺、芥子酸吡喃葡萄糖酯、香草酸葡萄糖苷、異水楊酸-O-葡萄糖、海藻糖-6-磷酸等酚酸類和糖類物質(zhì)；6個(gè)代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)（fold change≤0.5），分別為酪胺、對(duì)香豆酰咖啡酰酒石酸、沒(méi)食子鞣質(zhì)、溶血磷脂酰乙醇胺18:0（2n異構(gòu)）、十七烷酸和順-10-十七碳烯酸等脂類物質(zhì)。

通過(guò)對(duì)照組（S1）與Zn2.00單一處理組（S16）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為60.48%，第二主成分（PC2）值為14.56%（圖3（a））；通過(guò)對(duì)照組（S1）與Zn4.00單一處理組（S21）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為55.64%，第二主成分（PC2）值為18.81%（圖4（a）），且2組數(shù)據(jù)分別在X軸兩側(cè)，表明對(duì)照組和單一鋅處理組之間存在明顯差異。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，經(jīng)200次排列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（模型的有效性驗(yàn)證圖如圖3（b）、圖4（b）所示），Q2分別為0.979、0.974，表明所建模型極好，且該模型有意義。

圖2 對(duì)照組（S1）與Pb0.20單一處理組（S5）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗(yàn)證圖。Fig. 2 Difference analysis of metabolites between control group （S1） and Pb0.20 single treatment group （S5）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

圖3 對(duì)照組（S1）與Zn2.00單一處理組（S16）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗(yàn)證圖。Fig. 3 Difference analysis of metabolites between control group （S1） and Zn2.00 single treatment group （S16）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

根據(jù)代謝物差異篩選標(biāo)準(zhǔn)（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），與對(duì)照組相比，Zn2.00單一處理組有108個(gè)顯著差異代謝物，Zn4.00單一處理組有85個(gè)顯著差異代謝物。在這108個(gè)和85個(gè)差異代謝物中，共有65個(gè)相同的差異代謝物，其中有46個(gè)代謝物出現(xiàn)了顯著上調(diào)（fold change≥2），包括1-甲基組氨酸、5-氨基戊酸、L-（+）-精氨酸、谷胱甘肽、黃嘌呤、D-葡萄糖-6-磷酸、海藻糖-6-磷酸、γ-氨基丁酸、奎尼酸和檸檬酸等氨基酸、核苷酸、糖和有機(jī)酸物質(zhì)；有19個(gè)代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)（fold change≤0.5），包括1’-O香草酰-β-D-葡糖苷、5’-葡糖基氧代茉莉酸、芥子酸吡喃葡萄糖酯、巖白菜素、花生四烯酸和棕櫚油酸等酚酸類和脂類物質(zhì)。

2.3 單一鉛、鋅處理組與鉛、鋅復(fù)合處理組之間黑藻代謝物差異比較

通過(guò)Pb0.10單一處理組（S4）與Pb0.10+Zn2.00復(fù)合處理組（S19）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為45.73%，第二主成分（PC2）值為28.57%（圖5（a））；通過(guò)Pb0.20單一處理組（S5）與Pb0.20+Zn4.00復(fù)合處理組（S25）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為55.82%，第二主成分（PC2）值為17.68%（圖6（a）），且2組數(shù)據(jù)分別在X軸兩側(cè)，表明單一鉛處理組和對(duì)應(yīng)濃度的鉛、鋅復(fù)合處理組之間存在明顯差異。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，經(jīng)200次排列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（模型的有效性驗(yàn)證圖如圖5（b）、圖6（b）所示），Q2分別為0.925、0.953，表明所建模型極好。橫線對(duì)應(yīng)原始模型的R2Y和Q2，紅點(diǎn)和藍(lán)點(diǎn)分別代表Y置換后模型的R2Y’和Q2’。R2Y’和Q2’均小于原始模型的R2Y和Q2，即相應(yīng)點(diǎn)都不超過(guò)相應(yīng)的線，說(shuō)明該模型有意義。

圖4 對(duì)照組（S1）與Zn4.00單一處理組（S21）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗(yàn)證圖。Fig. 4 Difference analysis of metabolites between control group （S1） and Zn4.00 single treatment group （S21）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

圖5 Pb0.10單一處理組（S4）與Pb0.10+Zn2.00復(fù)合處理組（S19）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗(yàn)證圖。Fig. 5 Difference analysis of metabolites between Pb0.10 single treatment group （S4） and Pb0.10+Zn2.00 composite treatment group （S19）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

根據(jù)代謝物差異篩選標(biāo)準(zhǔn)（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），與Pb0.10單一處理組相比，Pb0.10+Zn2.00復(fù)合處理組有75個(gè)顯著差異代謝物；而相比Pb0.20單一處理組，Pb0.20+Zn4.00復(fù)合處理組有87個(gè)顯著差異代謝物。在這75個(gè)和87個(gè)差異代謝物中，共有45個(gè)相同的差異代謝物，其中有31個(gè)代謝物出現(xiàn)了顯著上調(diào)（fold change≥2），包括5-氨基戊酸、5-氧化脯氨酸、D-葡萄糖-6-磷酸、奎尼酸、檸檬酸和溶血磷脂酰甘油（16:0）等氨基酸、糖類、有機(jī)酸和脂質(zhì)；有14個(gè)代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)（fold change≤0.5），包括巖白菜素、煙酰胺和棕櫚油酸等酚酸類、維生素和脂質(zhì)。

圖6 Pb0.20單一處理組（S5）與Pb0.20+Zn4.00復(fù)合處理組（S25）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗(yàn)證圖。Fig. 6 Difference analysis of metabolites between Pb0.20 single treatment group （S5） and Pb0.20+Zn4.00 composite treatment group （S25） Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

2.4 鋅單一處理組與鉛、鋅復(fù)合處理組之間黑藻代謝物差異比較

通過(guò)Zn2.00單一處理組（S16）與Pb0.10+Zn2.00復(fù)合處理組（S19）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為45.54%，第二主成分（PC2）值為20.13%（圖7（a））；通過(guò)Zn4.00單一處理組（S21）與Pb0.20+Zn4.00復(fù)合處理組（S25）的PCA分析，發(fā)現(xiàn)其第一主成分（PC1）值為38.46%，第二主成分（PC2）值為21.20%（圖8（a））。且2組數(shù)據(jù)分別在X軸兩側(cè)，表明Zn2.00單一鋅處理組和對(duì)應(yīng)濃度的鉛、鋅復(fù)合處理組之間存在明顯差異。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，經(jīng)200次排列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（模型的有效性驗(yàn)證圖如圖7（b）、圖8（b）所示），Q2分別為0.603、0.755，表明所建模型可靠，且該模型有意義。

根據(jù)代謝物差異篩選標(biāo)準(zhǔn)（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），與Zn2.00單一處理組相比，Pb0.10+Zn2.00復(fù)合處理組有29個(gè)顯著差異代謝物，其中有25個(gè)代謝物出現(xiàn)了顯著上調(diào)（fold change≥2），包括對(duì)羥基苯甲酸、次黃嘌呤、鳥(niǎo)苷、葵二酸和石榴酸等酚酸類、核苷酸、有機(jī)酸和脂質(zhì)；有4個(gè)代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)（fold change≤0.5），分別為L(zhǎng)-茶氨酸、谷胱甘肽、PE（18:3/18:3+O3）和二十碳五烯酸（順-5,8,11,14,17）/EPA（C20:5）。與Zn4.00單一處理組相比，Pb0.20+Zn4.00復(fù)合處理組有17個(gè)顯著差異代謝物，其中只有2個(gè)代謝物出現(xiàn)了顯著上調(diào)（fold change≥2），分別為酚酸類的去鼠李糖異洋丁香酚苷B和對(duì)苯二甲酸；而有15個(gè)代謝物出現(xiàn)顯著下調(diào)（fold change≤0.5），包括谷胱甘肽還原型、順式-4-羥基-D-脯氨酸、2-脫氧腺苷、5-甲基胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、煙酰胺和延胡索酸（富馬酸、反丁烯二酸）等氨基酸和核苷酸類物質(zhì)。

試驗(yàn)結(jié)果表明黑藻在單一Pb2+脅迫后會(huì)使酚類、糖類物質(zhì)含量增加，脂類物質(zhì)含量減少。在引入Zn2+復(fù)合脅迫后進(jìn)一步促進(jìn)了黑藻的糖類物質(zhì)含量增加，可見(jiàn)鉛鋅復(fù)合在促進(jìn)黑藻糖類物質(zhì)增加方面存在協(xié)同作用。其原因可能是植物體在受到重金屬脅迫后，體內(nèi)產(chǎn)生一系列抗逆性反應(yīng)，這些反應(yīng)的維持均需要糖類化合物提供大量能量。另外，在維持機(jī)體滲透壓穩(wěn)定方面也需要可溶性糖類起作用。

圖7 Zn2.00單一處理組（S16）與Pb0.10+Zn2.00復(fù)合處理組（S19）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗(yàn)證圖。Fig. 7 Difference analysis of metabolites between Zn2.00 single treatment group （S16） and Pb0.10+Zn2.00 composite treatment group （S19）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

圖8 Zn4.00單一處理組（S21）與Pb0.20+Zn4.00復(fù)合處理組（S25）代謝物差異分析注：（a）PCA分析得分圖；（b）OPLS-DA有效性驗(yàn)證圖。Fig. 8 Difference analysis of metabolites between Zn4.00 single treatment group （S21） and Pb0.20+Zn4.00 composite treatment group （S25）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

而黑藻在單一Zn2+脅迫后會(huì)導(dǎo)致氨基酸、核苷酸、糖和有機(jī)酸等物質(zhì)含量增加，酚酸類和脂類物質(zhì)含量減少。在高濃度脅迫下（Pb0.10+Zn2.00），鉛鋅復(fù)合可進(jìn)一步促進(jìn)Zn2+使黑藻的核苷酸、有機(jī)酸物質(zhì)含量增加，抑制Zn2+使黑藻的酚酸類和脂類物質(zhì)含量減少的作用，可見(jiàn)鉛鋅復(fù)合在促進(jìn)黑藻核苷酸、有機(jī)酸物質(zhì)增加等方面存在協(xié)同作用，在使黑藻的酚酸類和脂類物質(zhì)含量減少方面存在拮抗作用；在超高濃度脅迫下（Pb0.20+Zn4.00），鉛鋅復(fù)合會(huì)抑制Zn2+使黑藻的氨基酸和核苷酸物質(zhì)含量增加、酚酸類物質(zhì)含量減少的作用，可見(jiàn)超高濃度的鉛鋅復(fù)合在使黑藻的氨基酸和核苷酸物質(zhì)含量增加、酚酸類物質(zhì)含量減少方面存在拮抗作用。不同濃度下產(chǎn)生不同結(jié)果的主要原因是植物體對(duì)于重金屬脅迫的響應(yīng)并不是一直持續(xù)升高的，當(dāng)某種重金屬濃度逐漸升高并超過(guò)某個(gè)特定閾值后，機(jī)體代謝程度往往是逐漸升高后降低并最終保持穩(wěn)定的。

3 討論（Discussion）

目前，有關(guān)代謝組學(xué)在環(huán)境領(lǐng)域中的應(yīng)用所涉及的物種主要包括微生物、植物和動(dòng)物等。在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中，代謝組學(xué)主要研究生物機(jī)體在受到外界環(huán)境因素刺激后的代謝變化情況。與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)不同的是，代謝組學(xué)可以捕捉生物機(jī)體生理代謝的瞬間變化，其靈敏的變化可以用來(lái)指示或評(píng)價(jià)該環(huán)境因素對(duì)生物機(jī)體或組織器官的毒理效應(yīng)[21-23]，尤其是某些代謝物的上下調(diào)可能標(biāo)記著該代謝通路上的某信號(hào)缺陷或被激活[19]。由此可見(jiàn)，代謝組學(xué)在環(huán)境領(lǐng)域中的應(yīng)用是可行的。

生物機(jī)體中游離的氨基酸及其衍生物，不僅能合成機(jī)體生命活動(dòng)所需的各種蛋白質(zhì)，還能幫助維持各種膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，是細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)的重要有機(jī)溶劑，具有保護(hù)膜系統(tǒng)、減少體內(nèi)蛋白質(zhì)降解和維持機(jī)體各類酶結(jié)構(gòu)正常等作用，能直接或間接對(duì)機(jī)體受到的脅迫做出響應(yīng)，因此氨基酸在研究機(jī)體生理機(jī)制中占有重要作用。Ruiz等[24]的研究表明缺硼狀態(tài)下可抑制機(jī)體蛋白質(zhì)合成，并降低硝酸還原酶活性以及硝酸鹽的同化能力，從而降低植物固氮能力。酚酸類物質(zhì)是一類含有酚環(huán)的有機(jī)酸，其具有殺菌的功效，廣泛存在于植物體內(nèi)，參與機(jī)體的各種代謝。核苷酸及其衍生物是一類由嘧啶堿基、核糖或脫氧核糖以及磷酸3種物質(zhì)組成的化合物，其主要參與機(jī)體核酸的構(gòu)成，同時(shí)還具有參與機(jī)體三磷酸腺苷（ATP）、脫氫輔酶等能量代謝相關(guān)的生物學(xué)功能。糖是植物進(jìn)行光合作用后的產(chǎn)物，同時(shí)也是機(jī)體進(jìn)行呼吸作用時(shí)的底物，并能為機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育提供能量，因此其在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，且有研究表明植物在應(yīng)激條件下所累積的可溶性糖可作滲透壓調(diào)節(jié)劑，對(duì)機(jī)體的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)起到保護(hù)作用[25]。維生素是維持機(jī)體健康的一類有機(jī)化合物，其不是構(gòu)成機(jī)體的基礎(chǔ)物質(zhì)，也不是能量的來(lái)源，但是卻能參與機(jī)體的代謝調(diào)節(jié)，在生物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育與抗性中起到重要作用。有機(jī)酸作為重要的小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，個(gè)別物質(zhì)具有抗氧化功能，在抗性生理過(guò)程中同樣起到至關(guān)重要的作用。Liu等[26]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸對(duì)鎘有一定活化作用，且超富集生態(tài)型東南景天可通過(guò)調(diào)節(jié)其根系內(nèi)有機(jī)酸的合成來(lái)適應(yīng)鎘的脅迫。脂質(zhì)是機(jī)體中生物膜的重要組成部分，個(gè)別脂類含量的減少會(huì)直接破壞機(jī)體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而引發(fā)一系列生理問(wèn)題。

基于本試驗(yàn)的初生代謝組學(xué)分析可知，與對(duì)照組相比，在0.10 mg·L-1和0.20 mg·L-1Pb2+單一脅迫中，共有11種相同代謝物發(fā)生同樣的顯著變化，出現(xiàn)顯著上調(diào)的主要為酚酸類和糖類物質(zhì)，出現(xiàn)顯著下調(diào)的主要為脂類物質(zhì)，其中涉及到苯丙氨酸代謝、糖類代謝和次生代謝產(chǎn)物的生物合成等生理過(guò)程，說(shuō)明鉛脅迫下，黑藻酚酸類物質(zhì)和糖類物質(zhì)起到了主要的抗性作用，同時(shí)黑藻在鉛脅迫下，其機(jī)體的脂類物質(zhì)減少，導(dǎo)致細(xì)胞膜可能受到了一定的損害。糖類的合成和分解會(huì)影響細(xì)胞的滲透性，而滲透能力的變化可以影響機(jī)體的抗逆能力，因此細(xì)胞內(nèi)糖類的累積對(duì)細(xì)胞具有一定保護(hù)作用，可以增強(qiáng)植物的抗逆能力[27]。羅慶[28]在研究不同鉛濃度下東南景天內(nèi)糖類代謝物的變化中發(fā)現(xiàn)，隨著鉛濃度的升高，東南景天根系分泌物中的半乳糖、葡萄糖和麥芽糖等糖類代謝物就表現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢(shì)。趙麗娟[17]的研究同樣證實(shí)了這一點(diǎn)，在低濃度鎘脅迫下，菠菜和玉米幼苗內(nèi)與能量代謝相關(guān)的葡萄糖、蔗糖和半乳糖等糖類化合物含量顯著上調(diào)。在鉛（1 000 mg·L-1）脅迫下，蘿卜根內(nèi)果糖、葡萄糖和半乳糖含量升高，但鎘脅迫下（400 mg·L-1）3種糖類代謝物的含量卻呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。其原因推測(cè)可能是由于在面對(duì)不同濃度重金屬脅迫下的反應(yīng)機(jī)制存在些微差距，即在低濃度下植物體分泌糖類等物質(zhì)用于富集吸收金屬離子，當(dāng)金屬離子濃度高于機(jī)體耐受閾值便停止吸收以防止對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害[17,28]。在2.00 mg·L-1和4.00 mg·L-1Zn2+單一脅迫中，共有65種相同代謝物發(fā)生同樣的顯著變化，其中氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、糖及醇類和有機(jī)酸含量均顯著上調(diào)，而酚酸類和脂質(zhì)含量均有部分上調(diào)，部分下調(diào)，涉及到檸檬酸鹽循環(huán)（TCA循環(huán)）、精氨酸和脯氨酸代謝、糖代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成（其他抗生素）、碳代謝和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子代謝等生理過(guò)程，說(shuō)明單一鋅脅迫下，促進(jìn)了黑藻機(jī)體氨基酸、核苷酸和糖類等物質(zhì)的合成，機(jī)體為抗擊逆境進(jìn)行了許多代謝調(diào)節(jié)。有研究表明，脯氨酸等氨基酸類物質(zhì)會(huì)和金屬離子螯合，形成穩(wěn)定的螯合物從而達(dá)到解毒的作用[29]。此外Zn2+單一脅迫中谷胱甘肽與對(duì)照組（CK）相比出現(xiàn)顯著上調(diào)，這與本研究所測(cè)定到的谷胱甘肽（GSH）含量變化一致，因此進(jìn)一步驗(yàn)證了鋅脅迫對(duì)黑藻GSH的影響。王珊珊[30]在柵藻對(duì)重金屬離子的富集及其機(jī)理的研究中也發(fā)現(xiàn)GSH、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）與金屬離子濃度呈正相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。由此可見(jiàn)，黑藻在重金屬耐受過(guò)程中會(huì)合成谷胱甘肽及其相關(guān)抗氧化酶等物質(zhì)以保護(hù)細(xì)胞免受傷害。本研究還發(fā)現(xiàn)，N苯乙?；?L-谷氨酰胺、酪胺、對(duì)香豆?？Х弱＞剖?、沒(méi)食子鞣質(zhì)和異水楊酸-O-葡萄糖只在單一鉛脅迫組中發(fā)生了顯著變化，因此這幾種代謝物或許可以作為鉛脅迫的代謝標(biāo)志物，而5-氨基戊酸、L-（+）-精氨酸、L-冬胺基乙酸-L-苯丙胺基乙酸和L-焦谷氨酸等多個(gè)代謝物只在單一鋅脅迫組中發(fā)生了顯著變化，因此這些代謝物或許可以作為鋅脅迫的代謝標(biāo)志物。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)芥子酸吡喃葡萄糖酯和香草酸葡萄糖苷這2種代謝物在單一鉛脅迫中表現(xiàn)為顯著上調(diào)，而在單一鋅脅迫中表現(xiàn)為顯著下調(diào)，說(shuō)明這2種代謝物的含量或許可以作為區(qū)分鉛、鋅脅迫的指示代謝物。

在復(fù)合脅迫中，Pb0.10+Zn2.00和Pb0.20+Zn4.00處理組與相應(yīng)的單一鉛處理組相比，共有45種相同代謝物發(fā)生同樣的顯著變化，出現(xiàn)顯著上調(diào)的主要為氨基酸、糖類、有機(jī)酸和脂質(zhì)，出現(xiàn)顯著下調(diào)的主要為酚酸類、維生素和脂質(zhì)，其中涉及到檸檬酸鹽循環(huán)（TCA循環(huán)）、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、糖代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成和碳代謝等生理過(guò)程，說(shuō)明相比單一鉛脅迫，鉛鋅復(fù)合脅迫后黑藻機(jī)體內(nèi)的機(jī)體受到的刺激增大，體內(nèi)產(chǎn)生大量的氨基酸、糖類等物質(zhì)來(lái)對(duì)抗不良環(huán)境。高慧兵[31]在研究中也提到，在鉛鋅復(fù)合脅迫時(shí)，蓖麻葉片中脯氨酸含量隨脅迫濃度的增加而增加，可能是高濃度脅迫時(shí)鋅、鉛發(fā)生協(xié)同作用，毒性增強(qiáng)，導(dǎo)致作為清氧劑的脯氨酸積累量增加，以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，緩解高濃度重金屬的迫害。郭曉音等[32]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，在高濃度鋅（或鎘）的加入與土壤中的鎘（或鋅）發(fā)生協(xié)同作用，導(dǎo)致秋茄中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、有機(jī)酸的積累量增加，以緩解高濃度重金屬的脅迫；另外，在復(fù)合脅迫下有多種脂質(zhì)代謝物顯著上調(diào)，其原因可能是鉛鋅脅迫后，對(duì)黑藻細(xì)胞膜的傷害增大，此時(shí)機(jī)體通過(guò)不斷地合成脂質(zhì)來(lái)修補(bǔ)重金屬對(duì)細(xì)胞的傷害；鉛鋅復(fù)合可進(jìn)一步促進(jìn)Pb2+使黑藻的糖類物質(zhì)含量增加的作用，說(shuō)明黑藻體內(nèi)的糖類物質(zhì)很有可能與超氧化物歧化酶（SOD）活性、脯氨酸（Pro）合成以及其他抗氧化酶或物質(zhì)成正相關(guān)。Pb0.10+Zn2.00處理組與Zn2.00單一脅迫相比有29個(gè)代謝差異物，其中有25種代謝物含量顯著上調(diào)，主要為酚酸類、核苷酸、有機(jī)酸和脂質(zhì)，有L-茶氨酸、谷胱甘肽、PE（18:3/18:3+O3）和二十碳五烯酸（順-5,8,11,14,17）/EPA（C20:5）4個(gè)代謝物出現(xiàn)下調(diào)。Pb0.20+Zn4.00處理組與Zn4.00單一脅迫相比有17個(gè)代謝差異物，其中15種代謝物含量顯著下降，主要為氨基酸類和核苷酸類；2種代謝物含量上升，均為酚酸類，說(shuō)明超高濃度Pb2+、Zn2+復(fù)合脅迫與單一Zn2+脅迫相比抑制了黑藻氨基酸、核苷酸的合成，導(dǎo)致黑藻機(jī)體抗性能力的下降，說(shuō)明黑藻中氨基酸和核苷酸是機(jī)體抗氧化代謝途徑中重要的組成部分。從本研究結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)，2組鉛鋅復(fù)合脅迫處理與相應(yīng)的單一鉛處理組之間有共同的差異代謝物，而與相應(yīng)的單一鋅處理組之間沒(méi)有共同的差異代謝物，因此初生代謝物一定程度上可以協(xié)助統(tǒng)一探討鉛鋅復(fù)合脅迫與單一鉛脅迫之間生理代謝的區(qū)別，但在探討鉛鋅復(fù)合脅迫與單一鋅脅迫之間生理代謝區(qū)別時(shí)可能需要根據(jù)不同情況具體去分析。

綜上所述，鉛單一脅迫主要可促進(jìn)黑藻機(jī)體酚酸類和糖類物質(zhì)的生成，抑制脂類的生成。鋅單一脅迫對(duì)機(jī)體代謝物的影響較多，其中可主要促進(jìn)氨基酸、核苷酸、糖類和有機(jī)酸等代謝物的生成，抑制部分酚酸類和脂質(zhì)代謝物的生成。相比單一鉛脅迫，鉛鋅復(fù)合脅迫可主要促進(jìn)黑藻氨基酸、糖類、有機(jī)酸和脂質(zhì)等代謝物的合成，抑制酚酸類、維生素和脂質(zhì)等代謝物的合成。相比單一鋅脅迫，高濃度鉛鋅復(fù)合脅迫（Pb0.10+Zn2.00）可主要促進(jìn)酚酸類、核苷酸、有機(jī)酸和脂質(zhì)等代謝物的合成，抑制以谷胱甘肽為代表的氨基酸等代謝物的合成；超高濃度鉛鋅復(fù)合脅迫（Pb0.20+Zn4.00）可主要促進(jìn)對(duì)苯二甲酸和去鼠李糖異洋丁香酚苷B 2種酚酸類代謝物的合成，抑制氨基酸、核苷酸、維生素和有機(jī)酸等代謝物的合成。