稀有鮈鯽腦中KISS/GPR54系統(tǒng)介導(dǎo)MT對性腺發(fā)育影響研究

陳越，楊瓊，王賢珍，呂曉潔，榮偉雅，李宇星，劉青，王偉偉，宋晶，王憲宗，劉少貞,*

1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801 2. 山西省水產(chǎn)技術(shù)推廣服務(wù)中心，太原 030002

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（environmental endocrine disrupting chemicals, EDCs）是常見的有機(jī)污染物，通過干擾生物體內(nèi)源激素產(chǎn)生、分布和代謝等發(fā)揮其作用[1]。EDCs化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以被機(jī)體吸收且不易降解[2]，通過食物鏈富集于魚體，最終危害動物及人體健康。研究表明，EDCs可以干擾水生生物內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)[3]。EDCs包括類雌激素和類雄激素，雄激素類物質(zhì)可以引起哺乳動物出現(xiàn)雄性化特征[4]，影響水生生物的組織器官正常功能，致使肝臟和性腺等器官出現(xiàn)多種病理變化[5]。

17α-甲基睪酮（17α-methyltestosterone, MT）具有合成簡單、成本較低、效果明顯等優(yōu)點(diǎn)[6]。低濃度MT暴露可以誘導(dǎo)動物精子的發(fā)生及釋放，促進(jìn)雄性器官發(fā)育，而高濃度使用可能導(dǎo)致魚類畸形或死亡[7]。MT添加投喂大口黑鱸（Micropterussalmoides），可以有效促進(jìn)雌性幼魚轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌訹8]。MT處理麥穗魚（Pseudorasboraparva）7 d，肝臟出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞核固縮等現(xiàn)象且隨著MT濃度的升高和暴露時(shí)間的延長而加劇，性腺組織切片結(jié)果顯示，雄魚性腺出現(xiàn)精卵巢（testis-ova）現(xiàn)象[5,9]。

KISS/GPR54系統(tǒng)是由配體kisspeptin的編碼基因kiss及其受體GPR54組成，魚類kiss基因主要包括2個(gè)亞型kiss1和kiss2[10]，GPR54基因也有GPR54α和GPR54β這2個(gè)亞型。KISS/GPR54系統(tǒng)通過下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonad, HPG）軸調(diào)控促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone, GnRH）分泌和釋放，從而調(diào)節(jié)下游促性腺激素，促進(jìn)性腺發(fā)育成熟[11]。d’Anglemont de Tassigny等[12]和Funes等[13]分別敲除小鼠kiss和GPR54基因，均出現(xiàn)不育和促性腺激素功能減退癥，對HPG軸功能造成嚴(yán)重影響。金魚（Carassiusauratus）成魚注射1 μg·g-1（以體質(zhì)量計(jì)）的KISS-1，血清中促黃體素（luteinizing hormone, LH）水平顯著升高[14]，為歐洲舌齒鱸（Dicentrarchuslabrax）成魚注射250 ng·g-1（以體質(zhì)量計(jì)）的KISS-2，血清中LH和促卵泡素（follicle-stimulating hormone, FSH）水平顯著升高[15]。

MicroRNAs（miRNAs）是一類長約22 nt的小分子非編碼RNA，在細(xì)胞分化、增殖、生長、衰老、凋亡、器官發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞信息傳遞等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用[16]，主要通過與靶基因3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）結(jié)合來影響基因或蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)mRNA降解或阻止蛋白質(zhì)翻譯[17]。在多種魚類中，miRNAs參與調(diào)控配子形成和性腺發(fā)育[16]，測序數(shù)據(jù)顯示，MT處理后稀有鮈鯽卵巢中存在3 949組miRNA-mRNA對[18]。目前許多研究涉及HPG軸相關(guān)miRNAs，其中miR-9和miR-200控制GnRH神經(jīng)元的發(fā)育[19]，miR-155和miR-200調(diào)控小鼠青春期前下丘腦GnRH的釋放[20]。miR-25-3p和miR-92a-3p屬于miR-25家族，可以與小鼠腦中kiss1基因的3’-UTR區(qū)結(jié)合，從而影響小鼠青春期的啟動以及動情周期[21]；中樞性性早熟女童血清中miR-137可以與kiss1基因的3’-UTR區(qū)結(jié)合發(fā)揮作用[22]；過表達(dá)miR-199-3p導(dǎo)致細(xì)胞MAPK pathway活性降低從而抑制kiss1基因表達(dá)[23]；miR-324-3p與kiss1基因的3’-UTR區(qū)結(jié)合抑制宮外孕早期kiss1基因的表達(dá)[24]。

稀有鮈鯽（Gobiocyprisrarus）是我國極具代表性的魚種，具有生活史周期短，方便飼養(yǎng)，溫度、溶氧耐受范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，因此逐漸成為新型實(shí)驗(yàn)動物[25]。在毒理學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)和基礎(chǔ)生物學(xué)等關(guān)鍵學(xué)科領(lǐng)域均有使用稀有鮈鯽作為試驗(yàn)動物[26]。為探究MT干擾稀有鮈鯽生殖系統(tǒng)的作用機(jī)理，本研究采用0、25、50和100 ng·L-1的MT處理稀有鮈鯽7、14和21 d。qRT-PCR檢測稀有鮈鯽腦中kiss和GPR54基因mRNA及其相關(guān)miRNAs的表達(dá)變化情況，為探究MT在稀有鮈鯽體內(nèi)的作用機(jī)理提供可靠的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步推進(jìn)稀有鮈鯽成為我國特有水生模式生物提供依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試驗(yàn)動物

稀有鮈鯽選自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室同一批繁殖的8月齡成魚。試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)組，對照組為0.001%無水乙醇，低、中、高M(jìn)T處理組濃度分別設(shè)定為25、50和100 ng·L-1，雌雄分開飼養(yǎng)，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。本試驗(yàn)用水選用曝氣24 h后的自來水，半凈水暴露，pH范圍7.6±0.2，水溫范圍（25±1） ℃，光/暗周期為14 h∶10 h。養(yǎng)殖魚的密度為1 g·L-1，每天吸污（殘餌和糞便）的同時(shí)換掉水族箱1/2的水，并加入等量的水和相應(yīng)量的MT溶液，保證水族箱里MT濃度恒定。每天定時(shí)定量投喂紅蟲一次，投喂量為實(shí)驗(yàn)組內(nèi)魚總質(zhì)量的3%，觀察并記錄各組試驗(yàn)魚的健康狀況。取樣前1 d停止投餌，每組隨機(jī)選取18尾稀有鮈鯽，MS222麻醉后取腦和性腺組織，腦組織置于Trizol中研磨后-80 ℃保存?zhèn)溆?，性腺置于波恩氏液中固?4～48 h，用于石蠟組織切片觀察。

1.2 石蠟組織切片制備

取出波恩氏液固定后的性腺組織，放置于包埋盒中，自來水緩沖12 h后酒精梯度脫水（50%、70%、80%、95%和100%乙醇中進(jìn)行），二甲苯進(jìn)行透明處理；將透明好的組織浸蠟包埋（多次熬制去除大部分雜質(zhì)的石蠟），用鑷子將組織放于石蠟?zāi)＞咧?，去除氣泡，放?5 ℃烘箱中透蠟30 min后取出，除去組織旁的氣泡自然降溫凝固，修整石蠟?zāi)K。使用切片機(jī)將組織石蠟切成6 μm厚的組織，H-E染色法染色，中性樹脂膠封片處理，置于顯微鏡下觀察性腺組織病理學(xué)變化。

1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成

取出超低溫冰箱保存的稀有鮈鯽腦組織，Trizol一步法提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，分光光度計(jì)測定純度和濃度。每份組織樣本取5 μL，PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real time）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，M5 miRNA cDNA Synthesis Kit合成miRNA對應(yīng)的第一鏈cDNA。

1.4 定量引物合成

參考已有的稀有鮈鯽kiss1、kiss2、GPR54α和GPR54β的引物序列[27]，上海生工（Sangon Biotech）生物工程股份有限公司合成，普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠電泳條帶單一，清晰可見。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法對稀有鮈鯽腦中4個(gè)基因的相對表達(dá)水平進(jìn)行檢測，每組檢測6尾魚。選擇常用內(nèi)參基因ef1a、β-actin、gapdh和tuba1作為候選，參考已有引物序列[28]，篩選最佳內(nèi)參基因。

參考實(shí)驗(yàn)室已有的稀有鮈鯽第二代測序數(shù)據(jù)，使用DNAman軟件設(shè)計(jì)miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p、miR-199-3p和miR-324-3p的引物，qRT-PCR檢測稀有鮈鯽腦中5個(gè)miRNA的相對表達(dá)水平，每組檢測6尾魚，選擇U6作為內(nèi)參基因（表1）。

1.5 內(nèi)參基因篩選

qRT-PCR方法檢測β-actin、ef1a、gapdh和tuba1在對照組及MT處理組的表達(dá)量，使用GeNorm、BestKeeper和NormFinder[29]3種方法對4個(gè)候選基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評估，確定在MT暴露后仍然穩(wěn)定的內(nèi)參基因，保證實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果的可信度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

qRT-PCR檢測稀有鮈鯽腦中kiss1、kiss2、GPR54α和GPR54β基因的相對表達(dá)量。采用TB Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus）試劑盒（TaKaRa，大連）進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)組織設(shè)置3個(gè)重復(fù)，體系為20 μL（上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL（100 ng），熒光染料SYBR Green Ⅱ 10 μL，滅菌超純水ddH2O 6.4 μL）；采用M5 miRNA qPCR Assay Kit試劑盒（聚合美，北京）檢測稀有鮈鯽腦中miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p、miR-199-3p和miR-324-3p的相對表達(dá)量，每個(gè)組織設(shè)置3個(gè)重復(fù)，體系為20 μL（上下游引物各0.4 μL，miRNA第一鏈cDNA模板2 μL（100 ng），2× M5 miRNA qPCR Mixture （ROX） 10 μL，滅菌超純水ddH2O 7.2 μL），混合均勻后于冰上快速加到八連管中。PCR程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃復(fù)性30 s；40個(gè)循環(huán)；熔解曲線（95 ℃ 10 s，52 ℃ 5 s，95 ℃ 30 s）。

1.7 數(shù)據(jù)處理分析

采用F=2-ΔΔCq對獲得的mRNA和miRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，RT-qPCR數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCq，計(jì)算公式為F=2-ΔΔCq，ΔCq處理組=（Cq目的基因處理組平均值-Cq內(nèi)參）；ΔCq對照組=（Cq目的基因?qū)φ战M平均值-Cq內(nèi)參），ΔΔCq=ΔCq處理組-ΔCq對照組。運(yùn)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析及Duncan’s多重比較檢驗(yàn)法，P<0.05為差異顯著，用不同小寫字母表示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

2 結(jié)果（Results）

2.1 MT對稀有鮈鯽性腺組織學(xué)影響

25、50和100 ng·L-1的MT處理稀有鮈鯽7、14和21 d，雌雄魚的性腺發(fā)育均受到了抑制，卵巢中的成熟卵細(xì)胞數(shù)量減少，精巢中的成熟精子比例降低。并且隨著處理時(shí)間和濃度的變化，卵巢和精巢出現(xiàn)不同的變化。

2.1.1 MT對稀有鮈鯽雌魚性腺組織學(xué)影響

石蠟切片結(jié)果如圖1所示，MT處理稀有鮈鯽雌魚7 d，對照組卵巢發(fā)育良好，成熟卵細(xì)胞（Voc）數(shù)量較多，初級卵母細(xì)胞（Poc）和次級卵母細(xì)胞（Coc）數(shù)目正常；低濃度處理組成熟卵細(xì)胞比例無明顯變化；中濃度處理組和高濃度處理組成熟卵細(xì)胞比例明顯降低，初級卵母細(xì)胞和次級卵母細(xì)胞所占比例增加。

MT處理稀有鮈鯽14 d，對照組卵巢發(fā)育正常；低濃度處理組未觀察到成熟卵細(xì)胞，而未成熟卵細(xì)胞數(shù)量增多；中濃度處理組觀察到初級卵母細(xì)胞數(shù)量增加，次級卵母細(xì)胞和成熟卵細(xì)胞數(shù)量減少；高濃度處理組卵巢中存在大量初級卵母細(xì)胞和少量次級卵母細(xì)胞，細(xì)胞個(gè)體變小。

MT處理稀有鮈鯽21 d，對照組卵巢發(fā)育正常，細(xì)胞比例未發(fā)生顯著變化；低濃度和中濃度處理組均顯示初級卵母細(xì)胞數(shù)量增加，未觀察到成熟卵母細(xì)胞；高濃度處理組卵巢中存在大量發(fā)育初期的初級卵母細(xì)胞，未觀察到成熟卵細(xì)胞和次級卵母細(xì)胞。

2.1.2 MT對稀有鮈鯽雄魚性腺組織學(xué)影響

石蠟切片結(jié)果如圖2所示，MT處理稀有鮈鯽雄魚7 d，對照組精巢發(fā)育良好，精原細(xì)胞（Sg）、次級精母細(xì)胞（Sc）和成熟精子（Sz）所占比例正常；低濃度處理組未發(fā)生顯著變化；中濃度處理組和高濃度處理組精巢中成熟精子數(shù)量減少。

MT處理稀有鮈鯽雄魚14 d，對照組精巢發(fā)育良好，精原細(xì)胞、次級精母細(xì)胞和成熟精子所占比例正常；低濃度處理組和中濃度處理組未成熟的精母細(xì)胞和精原細(xì)胞的比例增加；高濃度處理組精巢中幾乎觀察不到成熟的精子，精原細(xì)胞和次級精母細(xì)胞數(shù)量增加。

圖1 17α-甲基睪酮（MT）對雌性稀有鮈鯽卵巢組織學(xué)影響（H-E染色，比例尺=200 μm）注：A1、B1、C1和D1為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雌魚7 d后的卵巢組織；A2、B2、C2和D2為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雌魚14 d后的卵巢組織；A3、B3、C3和D3為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雌魚21 d后的卵巢組織；Voc為成熟卵細(xì)胞，Coc為次級卵母細(xì)胞，Poc為初級卵母細(xì)胞。Fig. 1 Effects of 17α-methyltestosterone （MT） on ovary histopathology of female G. rarus （H-E stain, scale bars=200 μm）Note: A1, B1, C1, and D1 respectively represent the ovary tissue changes of the control group, 25, 50, and 100 ng·L-1 MT treatment groups of female fish for 7 d; A2, B2, C2, and D2 respectively represent the ovary tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of female fish for 14 d; A3, B3, C3, and D3 respectively represent the ovary tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of female fish for 21 d; Voc means vitellogenic oocyte; Coc means cortical alveolus stage; Poc means perinucleolar oocyte.

圖2 MT對雄性稀有鮈鯽精巢組織學(xué)影響（H-E染色，比例尺=50 μm）注：A1、B1、C1和D1為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雄魚7 d后的精巢組織；A2、B2、C2和D2為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雄魚14 d后的精巢組織；A3、B3、C3和D3為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雄魚21 d后的精巢組織；Sz為成熟精子，Sc為次級精母細(xì)胞，Sg為精原細(xì)胞，V為空泡化。Fig. 2 Effects of MT on testis histopathology of male G. rarus （H-E stain, scale bars=50 μm）Note: A1, B1, C1, and D1 respectively represent the testis tissue changes of the control group, 25, 50, and 100 ng·L-1 MT treatment groups of male fish for 7 d; A2, B2, C2, and D2 respectively represent the testis tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of male fish for 14 d; A3, B3, C3, and D3 respectively represent the testis tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of male fish for 21 d; Sz means spermatozoo; Sc means spermatocyte; Sg means spermatogonium; V means vacuolation.

MT處理稀有鮈鯽雄魚21 d，對照組精巢發(fā)育良好，各細(xì)胞比例正常；低濃度處理組和中濃度處理組成熟精子所占比例減少，出現(xiàn)少量細(xì)胞空泡化現(xiàn)象；高濃度處理組幾乎觀察不到成熟精子，未成熟的精母細(xì)胞和精原細(xì)胞比例增加，出現(xiàn)大量細(xì)胞空泡化現(xiàn)象。

2.2 內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果

GeNorm分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果顯示，gapdh（2.02）>tuba1（1.22）>ef1a=β-actin（0.71），ef1a和β-actin的表達(dá)最穩(wěn)定，gapdh的表達(dá)最不穩(wěn)定（圖3（a））。NormFinder分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果顯示，gapdh（1.85）>tuba1（0.84）>β-actin（0.78）>ef1a（0.25），ef1a的表達(dá)最穩(wěn)定，gapdh的表達(dá)最不穩(wěn)定（圖3（b））。Bestkeeper分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性結(jié)果顯示，gapdh（3.13）>β-actin（1.53）>tuba1（1.45）>ef1a（1.38），ef1a的表達(dá)最穩(wěn)定，gapdh的表達(dá)最不穩(wěn)定（圖3（c））。

根據(jù)上述3種方法對所有內(nèi)參基因的分析評估，結(jié)果均顯示ef1a為MT暴露后稀有鮈鯽腦中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，因此本試驗(yàn)選用ef1a為最終內(nèi)參基因。

2.3 MT對稀有鮈鯽腦中KISS/GPR54系統(tǒng)基因表達(dá)的影響

2.3.1 MT對稀有鮈鯽雌魚腦中kiss與GPR54表達(dá)的影響

MT處理稀有鮈鯽雌魚7、14和21 d，低濃度（25 ng·L-1）和高濃度（100 ng·L-1）MT顯著降低腦中kiss1基因表達(dá)量。MT暴露14 d，中濃度（50 ng·L-1）組kiss1基因表達(dá)量顯著升高（圖4（a））。MT處理稀有鮈鯽雌魚7 d，中濃度組kiss2基因表達(dá)量顯著升高，而高濃度組表達(dá)量顯著降低。延長處理至14 d，低濃度組kiss2基因表達(dá)量顯著升高，為對照組的10倍，而高濃度組的表達(dá)量顯著降低。延長處理至21 d，低濃度和高濃度組kiss2基因表達(dá)量顯著升高（圖4（b））。MT暴露稀有鮈鯽雌魚7 d，低、中、高3個(gè)濃度組GPR54β基因表達(dá)量顯著降低，延長處理至14 d，GPR54α和GPR54β基因表達(dá)量顯著降低，延長處理至21 d，GPR54α表達(dá)量均降低（P<0.05，圖4）。

圖3 MT誘導(dǎo)稀有鮈鯽腦內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值Fig. 3 Stability of reference genes in brain of G. rarus exposed to MT

圖4 MT對稀有鮈鯽雌魚腦中kiss與GPR54基因表達(dá)量影響注：試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母表示顯著性水平（P<0.05）。Fig. 4 Effect of MT on kiss and GPR54 genes in brain of female G. rarusNote: The data were showed as mean±SEM; the different letters represented significant level （P<0.05）.

2.3.2 MT對稀有鮈鯽雄魚腦中kiss與GPR54表達(dá)的影響

MT處理稀有鮈鯽雄魚7 d，中濃度組腦中kiss1基因表達(dá)量顯著下降，而高濃度組表達(dá)量顯著升高（圖5（a））。低、中、高3個(gè)濃度組kiss2基因表達(dá)量顯著升高，其中50 ng·L-1MT對稀有鮈鯽kiss2基因表達(dá)的上調(diào)作用最為明顯，是對照組的11倍（圖5（b））。低濃度組腦中GPR54α基因表達(dá)量顯著升高。低濃度和高濃度處理組GPR54β基因表達(dá)量顯著升高。延長處理至14 d，中濃度組kiss1基因表達(dá)量顯著升高，而高濃度組的表達(dá)量顯著下降。低、中、高3個(gè)濃度組kiss2和GPR54α基因表達(dá)量顯著降低，高濃度組GPR54β基因表達(dá)量顯著升高。延長處理至21 d，低、中、高處理組kiss1基因表達(dá)量顯著升高，而GPR54β基因表達(dá)量顯著降低，中濃度處理組kiss2和GPR54α基因表達(dá)量顯著升高（P<0.05，圖5）。

圖5 MT對稀有鮈鯽雄魚腦中kiss與GPR54基因表達(dá)量影響注：試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母表示顯著性水平（P<0.05）。Fig. 5 Effect of MT on kiss and GPR54 genes in brain of male G. rarusNote: The data were showed as mean±SEM; the different letters represented significant level （P<0.05）.

2.3.3 MT對稀有鮈鯽雌魚腦中miRNAs表達(dá)的影響

MT處理稀有鮈鯽雌魚7 d，低濃度組miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p表達(dá)量均升高，而中濃度組和高濃度組表達(dá)量均降低，低濃度組miR-324-3p表達(dá)量顯著降低。延長處理時(shí)間至14 d，低濃度組miR-25-3p和miR-92a-3p表達(dá)量升高，而中濃度組和高濃度組miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p表達(dá)量均降低，miR-324-3p表達(dá)量無顯著變化。延長暴露時(shí)間至21 d，低濃度組miR-25-3p、miR-92a-3p和miR-137-3p，中濃度處理組miR-137-3p和高濃度處理組miR-25-3p、miR-92a-3p和miR-137-3p表達(dá)量均顯著下降，中濃度組miR-324-3p表達(dá)量顯著升高（P<0.05，圖6）。

2.3.4 MT對稀有鮈鯽雄魚腦中miRNAs表達(dá)的影響

MT處理稀有鮈鯽雄魚7 d，低濃度組miR-137-3p、miR-199-3p和miR-324-3p表達(dá)量顯著升高，miR-25-3p表達(dá)量顯著降低。中濃度和高濃度處理組miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p表達(dá)量均降低。延長處理至14 d，miR-25-3p和miR-137-3p在低濃度和中濃度處理組均顯著上升，miR-92a-3p和miR-199-3p均無顯著變化，高濃度處理組4個(gè)miRNAs表達(dá)量均顯著下降，miR-324-3p在低濃度和高濃度組中表達(dá)量顯著升高。延長暴露時(shí)間至21 d，除高濃度處理組miR-199-3p無顯著變化外，miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p在低、中、高3個(gè)濃度處理組中均顯著下降。中濃度處理組miR-324-3p表達(dá)量顯著降低，而在高濃度處理組中顯著升高（P<0.05，圖7）。

3 討論（Discussion）

3.1 MT對稀有鮈鯽性腺的影響

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可以與性激素受體競爭性結(jié)合，妨礙內(nèi)源性性激素與受體結(jié)合發(fā)揮作用，從而影響性激素正常生理功能[30]。本研究采用0、25、50和100 ng·L-1的MT暴露稀有鮈鯽7、14和21 d，隨著處理濃度和處理時(shí)間的變化，MT對稀有鮈鯽性腺的發(fā)育產(chǎn)生不同程度的抑制作用。MT處理7、14和21 d后，稀有鮈鯽雌魚卵巢都有不同程度的退化，且隨著暴露時(shí)間的延長和暴露濃度的升高，卵巢退化的程度逐漸嚴(yán)重，成熟卵細(xì)胞比例逐漸降低。研究表明，50 mg·kg-1MT投喂草魚（Ctenopharyngodonidella）30 d時(shí)卵巢中出現(xiàn)精原細(xì)胞，30～150 d卵巢受到更加嚴(yán)重的抑制作用，卵母細(xì)胞的生成和成熟受到抑制[31]。暴露MT后黑頭軟口鰷（Pimephalespromelas）和青鱂（Oryziaslatipes）卵巢退化和發(fā)育遲緩，與本研究結(jié)果一致[9]。因此，本研究和前人的研究結(jié)果表明MT可以抑制魚類卵巢的發(fā)育，阻礙生殖細(xì)胞的成熟。隨著暴露時(shí)間的延長和暴露時(shí)間的增加，成熟的精子逐漸減少，精巢退化程度逐漸嚴(yán)重。研究表明，以含體質(zhì)量0.5%的MT日糧喂養(yǎng)牙鲆（Paralichthysolivaceus）幼魚，處理組的雄性率達(dá)到100%[32]，50 ng·L-1MT暴露麥穗魚和380 ng·L-1MT暴露青鱂雄魚后處理組中雄魚性腺均出現(xiàn)精卵巢（testis-ova）現(xiàn)象[9]。MT處理7 d后引起稀有鮈鯽雄魚性腺指數(shù)顯著降低，精巢發(fā)育受到抑制[33]。性成熟的鋸蓋魚（Centropomusundecimalis）注射MT后，0.3～30 mg·kg-1濃度范圍都可以促進(jìn)精巢的生長和發(fā)育，加速精子的形成[34]。50 μg·L-1MT處理雄性鰻鱺（Anguillajaponica）45 d，性腺指數(shù)顯著升高，精巢發(fā)育受到促進(jìn)，此時(shí)精巢中以精細(xì)胞為主[35]。因此，本研究和前人的研究結(jié)果都表明了MT可以影響魚類性腺發(fā)育，高濃度MT可以抑制魚類精巢的發(fā)育。

圖6 MT對稀有鮈鯽雌魚腦中kiss1相關(guān)miRNAs表達(dá)量影響注：試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母表示顯著性水平（P<0.05）。Fig. 6 Effect of MT on kiss1 related miRNAs in brain of female G. rarusNote: The data were showed as mean±SEM; the different letters represented significant level （P<0.05）.

圖7 MT對稀有鮈鯽雄魚腦中kiss1相關(guān)miRNAs表達(dá)量影響注：試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母表示顯著性水平（P<0.05）。Fig. 7 Effect of MT on kiss1 related miRNAs in brain of male G. rarusNote: The data were showed as mean±SEM; the different letters represented significant level （P<0.05）.

3.2 MT對稀有鮈鯽腦中KISS/GPR54系統(tǒng)的影響

KISS/GPR54系統(tǒng)在魚類個(gè)體生殖和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[36]，在調(diào)控魚類生殖內(nèi)分泌中系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，不僅參與調(diào)節(jié)魚類青春期起始，參與調(diào)節(jié)魚類繁殖行為，使其表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性，還可以調(diào)節(jié)魚類季節(jié)性繁殖的生殖內(nèi)分泌，調(diào)控魚類性腺發(fā)育，促進(jìn)分泌GnRH和促性腺激素[37]。研究結(jié)果顯示，MT暴露稀有鮈鯽后，ef1a是腦中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，與雙酚A暴露稀有鮈鯽腦中穩(wěn)定表達(dá)基因一致[28]。MT處理雌魚7 d和14 d，kiss2基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，延長處理至21 d，kiss1與GPR54α表達(dá)量均降低。MT處理稀有鮈鯽雄魚7 d，kiss1基因表達(dá)量先降低后升高，而kiss2基因表達(dá)量均顯著升高，延長處理至14 d，kiss1基因表達(dá)量先升高后降低，kiss2基因表達(dá)量則降低，延長處理至21 d，kiss1表達(dá)量均升高，而GPR54β則降低。表明不同濃度的外源性雄激素MT能夠改變稀有鮈鯽KISS/GPR54系統(tǒng)基因的表達(dá)模式，該系統(tǒng)在稀有鮈鯽個(gè)體生殖和發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。大多數(shù)脊椎動物的研究報(bào)道指出KISS/GPR54系統(tǒng)結(jié)合HPG軸來調(diào)控GnRH的分泌和釋放，從而控制下游的促性腺激素的釋放和分泌[38-39]。在嚙齒動物的研究中，KISS/GPR54系統(tǒng)通過應(yīng)答由雌雄激素引起的正負(fù)反饋調(diào)節(jié)來調(diào)控下游促性腺激素的釋放和分泌[40]。因此我們認(rèn)為稀有鮈鯽HPG軸下游的調(diào)控機(jī)制與哺乳動物相似，KISS/GPR54系統(tǒng)發(fā)揮關(guān)鍵作用。

GPR54β可以直接在垂體水平或者通過性腺激素的反饋?zhàn)饔脕碚{(diào)控促性腺激素的分泌。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，25、50或100 ng·L-1的MT處理7 d，可引起稀有鮈鯽雌魚腦中GPR54β基因mRNA的表達(dá)量顯著降低，我們推測MT通過抑制KISS與GPR54β的結(jié)合在垂體水平抑制下游激素的分泌，進(jìn)而抑制稀有鮈鯽卵巢的發(fā)育，這與前人研究結(jié)果一致[27,39]。隨著稀有鮈鯽雌魚暴露時(shí)間延長至21 d，3個(gè)處理組與對照組表達(dá)量均無明顯差異，MT的抑制作用逐漸減弱直至消失，這可能是MT干擾卵巢類固醇激素合成，從而引起神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)HPG軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，使GPR54β基因表達(dá)恢復(fù)正常水平，進(jìn)而恢復(fù)其原有生理功能狀態(tài)。這可能是機(jī)體在一定生理能力范圍內(nèi)，為了適應(yīng)不同環(huán)境狀態(tài)的一種生理補(bǔ)償效應(yīng)[40]。

在硬骨魚類中，存在2種kiss基因分別為kiss1和kiss2以及2種GPR54基因分別為GPR54α（GPR54-2b）和GPR54β（GPR54-1b），且不同配體與受體之間能夠相互作用，信號傳導(dǎo)機(jī)制復(fù)雜多變，其不同的結(jié)合方式會導(dǎo)致其發(fā)揮不同的生理功能[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，稀有鮈鯽雌魚腦內(nèi)kiss1與GPR54α基因的表達(dá)模式相同，在稀有鮈鯽雄魚腦中kiss2與GPR54α的表達(dá)模式相同，因此，我們推測在雌魚腦內(nèi)kiss1與GPR54α基因可能對外源激素MT有相同的應(yīng)答模式，也有可能是配體與受體特異性結(jié)合形成配體-受體對共同發(fā)揮作用。在稀有鮈鯽雄魚腦中kiss2與GPR54α表達(dá)模式相同，可能對MT具有相同的響應(yīng)模式，或者結(jié)合形成特異性配體-受體對。此結(jié)果與克氏雙鋸魚（Amphiprionclarkii）中的研究結(jié)果不同，克氏雙鋸魚腦和性腺中kiss1與GPR54-1b幾乎具有相同的表達(dá)模式，說明kiss1可能通過GPR54-1b作為配體-受體對參與克氏雙鋸魚的生理調(diào)節(jié)[42]。歐洲海鱸kiss1與GPR54α親和性較高，而kiss2與GPR54β親和性較高[43]。金魚kiss1與GPR54β親和性較高，而kiss2與GPR54α親和性也較高[44]。因此我們推測kiss與GPR54基因的表達(dá)模式具相關(guān)性，但在不同魚類中表達(dá)或調(diào)控方式不同，需要進(jìn)一步深入研究KISS/GPR54系統(tǒng)參與魚類生殖的調(diào)控機(jī)制。

本研究中，MT對稀有鮈鯽雌雄魚腦中kiss1基因表達(dá)的上調(diào)作用分別為對照組為1.5倍和1.9倍，而kiss2基因表達(dá)的上調(diào)作用分別為對照組的10.4倍和11.0倍，因此，我們推測MT對稀有鮈鯽腦中kiss2基因表達(dá)的影響作用相對于kiss1基因影響較為明顯，這可能預(yù)示著稀有鮈鯽的KISS-2神經(jīng)元相較于KISS-1神經(jīng)元對外源性雄激素作用更加敏感，這與雌二醇處理雌性稀有鮈鯽和斑馬魚幼魚結(jié)果一致[27,45]。性成熟雌性斑馬魚（Daniorerio）和鱸魚（Lateolabraxjaponicus）研究中發(fā)現(xiàn)kiss2能在垂體水平較kiss1更顯著地促進(jìn)KISS/GPR54系統(tǒng)下游基因FSHβ和LHβ的表達(dá)，這說明kiss2可能是激活促性腺激素合成的關(guān)鍵因子[43,46]。對歐洲舌齒鱸分別注射KISS-1和KISS-2，注射KISS-2血清中LH升高4倍，F(xiàn)SH升高2倍，而注射KISS-1血清中LH僅為正常的2倍，而FSH則無顯著變化[15]。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，稀有鮈鯽暴露于外源性雄激素MT環(huán)境中，kiss2可能是性腺激素反饋調(diào)控過程中KISS/GPR54系統(tǒng)中的主要執(zhí)行者。

3.3 miRNA介導(dǎo)MT影響稀有鮈鯽腦中kiss1基因的表達(dá)

本研究結(jié)果表明，低濃度MT處理稀有鮈鯽7 d，雌魚腦中miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p表達(dá)顯著升高，kiss1基因表達(dá)顯著降低。miR-25家族的miR-25-3p和miR-92a-3p可以與kiss1基因的3’-UTR區(qū)結(jié)合，從而影響小鼠青春期的啟動以及動情周期[21]。在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中miR-25-3p直接靶向轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白（Sp1）發(fā)揮作用[14]。miR-92a-3p通過調(diào)控B細(xì)胞易位基因2（btg2）調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[47]，通過靶向大腫瘤抑制基因2（lats2）影響宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲[48]。中樞性性早熟女童血清中miR-137的表達(dá)與kiss1呈負(fù)相關(guān)，且與LH峰值，基礎(chǔ)LH/FSH比值呈負(fù)相關(guān)[22]，本研究結(jié)果也顯示MT通過調(diào)控miR-137的表達(dá)進(jìn)而影響kiss1的表達(dá)，進(jìn)而影響稀有鮈鯽的性腺發(fā)育。

中濃度MT處理稀有鮈鯽7 d和高濃度MT處理稀有鮈鯽14 d，雄魚腦中miR-324-3p表達(dá)顯著升高，抑制kiss1基因表達(dá)，細(xì)胞學(xué)研究表明，miR-324-3p的過表達(dá)可以抑制kiss1的表達(dá)[49]。中濃度MT處理稀有鮈鯽21 d，雄魚腦中miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p表達(dá)顯著降低，kiss1基因表達(dá)顯著升高。將靶向miR-92a-3p的vivo-morpholinos（VMO）直接注射到斑馬魚卵巢中導(dǎo)致1細(xì)胞期胚胎中成熟miR-92a-3p的豐度顯著降低，以及發(fā)育停滯的胚胎比例顯著增加[50]。miR-199通過調(diào)控信號通路或靶向基因參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡，miR-199-3p通過p38 MAPK途徑調(diào)節(jié)kiss1基因的表達(dá)，從而調(diào)控大鼠青春期的起始[24]。因此我們推斷中濃度MT處理稀有鮈鯽雄魚21 d，降低miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p的表達(dá)，進(jìn)而顯著升高kiss1的表達(dá)，從而干擾性腺發(fā)育。

綜上所述，我們推測MT通過調(diào)控miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p、miR-199-3p和miR-324-3p表達(dá)干擾kiss1基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響稀有鮈鯽性腺發(fā)育及卵細(xì)胞和精子的成熟。稀有鮈鯽kiss1基因表達(dá)受到miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p、miR-199-3p和miR-324-3p等miRNAs的調(diào)控，有待進(jìn)一步深入探究并驗(yàn)證其靶向關(guān)系。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)稀有鮈鯽kiss2基因?qū)ν庠葱孕奂に馗用舾?，可以作為監(jiān)測環(huán)境中MT的生物標(biāo)志物。