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    四環(huán)素類抗生素耐藥研究進(jìn)展:質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥機制

    2022-11-22 02:18:58葉卓幸湯燕君何璐茜白紅高方舟張敏劉有勝熊倩趙建亮何良英應(yīng)光國
    生態(tài)毒理學(xué)報 2022年4期
    關(guān)鍵詞:外排類抗生素環(huán)素

    葉卓幸,湯燕君,何璐茜,2,白紅,2,高方舟,2,張敏,2,劉有勝,2,熊倩,2,趙建亮,2,何良英,2,*,應(yīng)光國,2

    1.華南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院,廣州 510006 2.廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點實驗室&環(huán)境理論化學(xué)教育部重點實驗室,華南師范大學(xué),廣州 510006

    抗生素耐藥性問題日益嚴(yán)重,對生態(tài)安全與公共健康構(gòu)成重大威脅,預(yù)計到2050年,抗生素耐藥性問題將導(dǎo)致全球每年1 000萬人的死亡,比癌癥導(dǎo)致的全球死亡人數(shù)多180萬[1]。四環(huán)素類抗生素是一類廣譜類抗生素,主要通過阻止菌體蛋白的合成對細(xì)菌產(chǎn)生作用,廣泛應(yīng)用于臨床治療、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[2]。據(jù)統(tǒng)計,四環(huán)素類抗生素每年全球的產(chǎn)量為數(shù)千噸[3],在全球的抗生素生產(chǎn)量和使用量中排名第二[4]。2010—2015年,在全球獸用抗生素的使用中,四環(huán)素類抗生素使用量位列第一,占全球獸用抗生素使用量的48%[5]。近幾十年來,四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素等一代、二代四環(huán)素類藥物是世界上最常用的抗生素[4]。

    四環(huán)素類抗生素耐藥機制已被廣泛報道,其耐藥基因分布于約130種革蘭氏陽性菌屬和革蘭氏陰性菌屬并廣泛存在于人類、動物和環(huán)境中[2,6]。四環(huán)素類抗生素的耐藥機制包括外排泵[7-9]、核糖體保護(hù)蛋白[10-13]和酶失活機制[14]。外排泵將四環(huán)素類抗生素泵出胞外從而降低了其胞內(nèi)濃度,核糖體保護(hù)蛋白與四環(huán)素類抗生素競爭在核糖體30S亞基的結(jié)合位點,酶失活則是產(chǎn)生氧化還原酶使四環(huán)素失活。外排泵和核糖體保護(hù)蛋白是臨床中對四環(huán)素類藥物最常見的耐藥類型[15]。自從第一批四環(huán)素類藥物被發(fā)現(xiàn)以來,核心結(jié)構(gòu)的不斷優(yōu)化使四環(huán)素類藥物在臨床應(yīng)用和開發(fā)中能夠克服許多耐藥性機制[15]。然而,新的四環(huán)素類抗生素耐藥基因正不斷增加,在全世界范圍內(nèi)快速傳播,嚴(yán)重影響了抗菌藥物治療的有效性。

    替加環(huán)素是首個甘氨酰環(huán)素類半合成抗生素[16],其屬于第三代新型四環(huán)素類藥物,具有超廣譜的抗菌活性,用于治療由多重耐藥病原菌引起的感染性疾病[17]。世界衛(wèi)生組織(WHO)于2019年將替加環(huán)素列為極其重要的抗菌藥物[18]。然而,有研究人員已經(jīng)從動物和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的高水平替加環(huán)素耐藥基因tet(X)變異體——tet(X3)和tet(X4)[5]。tet(X3)和tet(X4)不僅可以引起細(xì)菌對替加環(huán)素的高水平耐藥,最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為32~64 μg·mL-1,還可介導(dǎo)2個第四代四環(huán)素類新藥奧馬環(huán)素和依拉環(huán)素的高水平耐藥。值得注意的是,新型tet(X)變異體還存在交叉耐藥性,可介導(dǎo)對傳統(tǒng)的一代、二代四環(huán)素類藥物耐藥。我國不同養(yǎng)殖動物和環(huán)境樣品中均發(fā)現(xiàn)了攜帶不同tet(X)變異體的細(xì)菌[19-22]。2021年,我國學(xué)者從來自世界四大洲(亞洲、歐洲、北美洲和南美洲)的12 829個人類微生物組樣本中鑒定出322個tet(X)變異體陽性樣本[23]。因此,四環(huán)素類抗生素尤其是替加環(huán)素的耐藥機制和流行傳播迫切需要全球關(guān)注。本文綜述了四環(huán)素類抗生素耐藥機制研究進(jìn)展,報道了新的四環(huán)素類抗生素耐藥基因;重點闡述了質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥機制,詳述了tet(X)基因及其變異基因的產(chǎn)生與發(fā)展;利用生物信息學(xué)分析了大量公共數(shù)據(jù)庫已有細(xì)菌基因組,解析了替加環(huán)素耐藥基因的細(xì)菌宿主以及tet(X)基因家族在細(xì)菌染色體和質(zhì)粒中的分布特征,為進(jìn)一步監(jiān)測替加環(huán)素耐藥基因的傳播擴散提供科學(xué)參考。

    1 四環(huán)素類抗生素作用機制與耐藥機制(Action mechanisms and resistance mechanisms of tetracyclines)

    1.1 四環(huán)素類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)特征

    四環(huán)素類抗生素發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)40年代,目前已經(jīng)發(fā)展到第四代[2]。四環(huán)素類抗生素為廣譜抗生素,其名稱來源于4個芳香環(huán)的結(jié)合,并四苯四環(huán)素核是所有四環(huán)素類抗生素共同的基本結(jié)構(gòu)。金霉素(1948年)、土霉素(1950年)和四環(huán)素(1953年)是四環(huán)素家族的第一代成員(圖1);第二代以米諾環(huán)素(1961年)和多西環(huán)素(1967年)為代表;替加環(huán)素(1993年)于2005年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床治療,是四環(huán)素類唯一的第三代成員;奧馬環(huán)素(2013年)和依拉環(huán)素(2013年)屬于第四代成員,均于2018年獲得FDA批準(zhǔn)用于臨床治療。目前,替加環(huán)素、奧馬環(huán)素和依拉環(huán)素屬于新型四環(huán)素類抗生素。

    替加環(huán)素是一種化學(xué)修飾的米諾環(huán)素,其核心D環(huán)C9處的氫被N, N-二甲基甘氨酰胺取代,從而賦予替加環(huán)素獨特的微生物學(xué)特性和組織穿透性,替加環(huán)素抗菌譜得到擴展,其抑制蛋白質(zhì)合成的能力是米諾環(huán)素的3倍,四環(huán)素的20倍,且不受四環(huán)素類抗生素主要耐藥機制的影響[24],因此,替加環(huán)素可以治療多重耐藥病原體引起的感染,包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylocousaureus, MRSA)、耐青霉素肺炎鏈球菌(penicillin resistantStreptococcuspneumoniae, PRSP)、耐萬古霉素腸球菌(vancomycin resistantEnterococcus, VRE)以及產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases, ESBLs)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌[25]。奧馬環(huán)素是氨甲基四環(huán)素類藥物,在D環(huán)的C7處有一個二甲氨基,在D環(huán)C9處有一個氨甲基修飾,C7官能團(tuán)和C9的修飾保障了奧馬環(huán)素對抗外排泵和核糖體保護(hù)蛋白耐藥機制的穩(wěn)定性[26]。依拉環(huán)素是含氟四環(huán)素,結(jié)構(gòu)類似于替加環(huán)素,其對革蘭氏陽性球菌的抗菌能力是替加環(huán)素的2倍~4倍,對革蘭氏陰性桿菌的抗菌能力是替加環(huán)素的2倍~8倍[27]。

    圖1 典型四環(huán)素類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of representative tetracyclines

    四環(huán)素類抗生素可逆地與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合,阻止了氨酰tRNA與核糖體結(jié)合位點A的結(jié)合,從而抑制細(xì)菌蛋白的翻譯過程(圖1),由于這種結(jié)合的可逆性,四環(huán)素類抗生素在細(xì)菌體內(nèi)濃度較低時會從作用靶點離開。四環(huán)素抗菌作用能力強,而對人類副作用小的原因在于四環(huán)素與真核細(xì)胞核糖體80S亞基的結(jié)合能力相對較弱[28]。

    1.2 四環(huán)素類抗生素耐藥機制

    細(xì)菌對四環(huán)素類抗生素耐藥的分子機制包括4種:四環(huán)素類特異性外排泵、核糖體保護(hù)、酶失活和多藥外排泵(圖2)。根據(jù)華盛頓大學(xué)更新的一個四環(huán)素類耐藥基因數(shù)據(jù)庫(http://faculty.washington.edu/marilynr/; updated April 20, 2021),四環(huán)素類特異性外排泵基因共有38個,核糖體保護(hù)基因共13個,酶修飾基因共13個,未知分類基因1個,鑲嵌式核糖體保護(hù)基因(mosiac ribosomal protection)共11個,四環(huán)素類耐藥基因在GenBank中的代表序列登錄號以及基因位置如表1所示。

    細(xì)菌主動外排泵系統(tǒng)分為五大家族:主要易化超家族(major facilitator super family, MFS)、小多重耐藥家族(small multidrug resistance, SMR)、ATP結(jié)合盒家族(ATP binding cassette, ABC)、耐藥結(jié)節(jié)分化家族(resistance nodulation and cell division, RND)、多藥和毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family, MATE)。MFS、SMR和RND類外排泵均以質(zhì)子驅(qū)動力為能量將藥物泵出膜外,ABC類外排泵利用ATP水解釋放的能量將抗生素泵出膜外[29-31]。38個四環(huán)素類特異性外排泵屬于MFS家族,已發(fā)現(xiàn)的可外排四環(huán)素類抗生素的多藥外排泵有RND、MFS和ABC家族[31]。RND家族四環(huán)素類多藥外排泵主要有AdeABC、AdeIJK、AcrAB-TolC、MexAB-OprM和MexVW-OprM等;MFS家族四環(huán)素類多藥外排泵主要有MdfA、NorA、NorB、Rv1410c和Rv2333c等;ABC家族四環(huán)素類多藥外排泵主要有Rv1258C、EfrAB和VcaM等[31-33]。

    圖2 四環(huán)素類抗生素耐藥機制注:NADPH表示還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,NADP+表示煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,MFS表示主要易化超家族,ABC表示ATP結(jié)合盒家族,RND表示耐藥結(jié)節(jié)分化家族。Fig. 2 Mechanisms of tetracycline resistanceNote: NADPH stands for reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP+ stands for nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, MFS stands for major facilitator super family, ABC stands for ATP binding cassette, and RND stands for resistance nodulation and cell division.

    表1 四環(huán)素類抗生素耐藥基因類型及其來源Table 1 Types and sources of tetracycline resistance genes

    續(xù)表1

    續(xù)表1

    四環(huán)素類抗生素耐藥性通常是通過水平轉(zhuǎn)移獲得的[34-35]。2015年,F(xiàn)orsberg等[35]從土壤宏基因組中發(fā)現(xiàn)了9個通過酶失活機制導(dǎo)致高水平四環(huán)素抗性的基因,命名為tet(47)~tet(55),其中tet(47)和tet(54)與氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶耐藥基因相鄰。tet(62)、tet(63)和tet(64)為最新發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類抗生素耐藥基因[36-38]。McGivern等[36]在暴露于抗菌劑三氯生的合成廢水中識別出了新的外排泵基因tet(62),將攜帶tet(62)的基因文庫導(dǎo)入大腸桿菌后,抗生素敏感性分析表明細(xì)菌對所測試的四環(huán)素類抗生素耐藥性增加了4倍~50倍。Zhu等[37]在來源于雞樣本的金黃色葡萄球菌多重耐藥質(zhì)粒pSA01(25 664 bp)上發(fā)現(xiàn)一個新的外排泵基因tet(63),該質(zhì)粒同時攜帶了aadD、aacA-aphD和erm(C)等耐藥基因,Tet(63)蛋白與外排泵蛋白Tet(K)的同源性為73%。Somprasong等[38]在來源于土壤樣本的烏邦伯克霍爾德菌(Burkholderiaubonensis)中發(fā)現(xiàn)新的外排泵基因tet(64),對四環(huán)素呈現(xiàn)高水平耐藥性(MIC≥256 μg·mL-1),但不能介導(dǎo)米諾環(huán)素、替加環(huán)素和依拉環(huán)素抗性。

    2 替加環(huán)素耐藥機制(Mechanisms of tigecycline resistance)

    替加環(huán)素是一種新型甘氨酰環(huán)肽類抗生素,屬于第三代四環(huán)素類抗生素,與核糖體30S亞基的結(jié)合效率是四環(huán)素的5倍[39]。替加環(huán)素不受四環(huán)素類抗生素主要耐藥機制的影響,如四環(huán)素特異性外排泵和核糖體保護(hù)機制;也不受β內(nèi)酰胺酶、靶位修飾、大環(huán)內(nèi)酯類外排泵或酶靶位改變(如旋轉(zhuǎn)酶/拓?fù)洚悩?gòu)酶)等耐藥機制的影響。這些特性使得替加環(huán)素具有超廣譜抗菌活性,是治療產(chǎn)碳青霉烯酶多重耐藥腸桿菌感染的“最后一道防線”[17]。目前,替加環(huán)素已被批準(zhǔn)作為一種單藥治療復(fù)雜感染[40]。Hoban等[41]于2004年開展了替加環(huán)素評估和監(jiān)測試驗,評估了替加環(huán)素和常用抗生素對來自11個國家40個研究中心的6 792個臨床分離株的抗菌活性,其藥敏實驗結(jié)果表明,替加環(huán)素對糞腸球菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎鏈球菌的MIC90分別為0.12、0.12、0.25和0.25 μg·mL-1,對腸桿菌科細(xì)菌MIC90為1 μg·mL-1。因此,替加環(huán)素的重要性體現(xiàn)在它對大多數(shù)多重耐藥菌具有抗菌活性,被世界衛(wèi)生組織列為極其重要的抗菌藥物[5]。

    隨著替加環(huán)素使用量的增加,現(xiàn)有研究表明替加環(huán)素耐藥性已經(jīng)出現(xiàn),臨床上最常見于鮑曼不動桿菌和腸桿菌科,尤其是多藥耐藥菌株,替加環(huán)素耐藥機制的產(chǎn)生與發(fā)展已得到廣泛關(guān)注[5,42-44]。目前發(fā)現(xiàn)的替加環(huán)素耐藥機制有:核糖體蛋白結(jié)合位點突變、細(xì)胞膜變異、主動外排泵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和修飾酶降解等。其中核糖體蛋白結(jié)合位點突變和細(xì)胞膜變異的替加環(huán)素耐藥機制報道數(shù)量較少:在肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中,核糖體S10蛋白的編碼基因rpsJ突變可介導(dǎo)替加環(huán)素耐藥[45-47];plsC基因突變和abrp基因缺失導(dǎo)致鮑曼不動桿菌細(xì)胞膜通透性改變,從而介導(dǎo)替加環(huán)素耐藥[48-49];2021年,我國學(xué)者在豬鏈球菌中發(fā)現(xiàn)了對替加環(huán)素具有抗性的核糖體保護(hù)蛋白Tet(M)的突變體,其編碼基因tet(M)位于基因島上[50]。鑒于替加環(huán)素在臨床治療中的重要性,有關(guān)其耐藥機制的報道正不斷增加,本文將詳述替加環(huán)素2種主要耐藥機制外排泵和修飾酶的形成與發(fā)展(圖3)。

    2.1 替加環(huán)素外排泵

    與替加環(huán)素耐藥相關(guān)的外排泵主要有RND家族、MFS家族中的Tet(A)和Tet(L)外排泵突變體(圖3)。

    2.1.1 RND家族外排泵

    RND家族外排泵常見于革蘭氏陰性菌,如銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌和摩氏摩根菌[43]。RND外排泵主要利用質(zhì)子梯度來驅(qū)動外排,1個H+交換1個藥物分子。與替加環(huán)素耐藥相關(guān)的RND型外排泵包括:AcrAB-TolC[51]、SdeXY-HasF[52]、OqxAB[43,53]、TMEXcd1-TOprJ[54]和AdeABC/AdeIJK/AdeFGH[55]。

    在大腸桿菌中,RND家族外排泵AcrAB-TolC由三聯(lián)組合蛋白組成,包括膜連接蛋白(AcrA)、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)(圖3)。AcrB捕獲和轉(zhuǎn)運底物,在AcrA的協(xié)助下,激活外排泵通道,將底物泵出細(xì)菌胞外。該外排泵的調(diào)控主要有局部調(diào)控(AcrR)和全局調(diào)控(MarA、SoxS、Rob和RamA)(圖3)。acrA和acrB基因由同一個操縱子轉(zhuǎn)錄而來,AcrR是一種負(fù)調(diào)控因子,調(diào)控acrAB的表達(dá)[51]。在腸桿菌科細(xì)菌中,AcrAB外排泵是替加環(huán)素的主要耐藥機制,其局部和全局調(diào)控因子則因物種而異[42]。在大腸桿菌中,當(dāng)替加環(huán)素進(jìn)入細(xì)菌內(nèi),局部調(diào)控蛋白AcrR與之結(jié)合引發(fā)構(gòu)象改變,從而激活外排蛋白AcrAB的過表達(dá),導(dǎo)致大腸桿菌對替加環(huán)素的敏感性降低[56]。在AcrAB-TolC外排泵全局調(diào)控因子中,現(xiàn)有研究表明ramA表達(dá)增強促成了陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和克雷伯氏菌的替加環(huán)素耐藥性[53,57]。

    圖3 替加環(huán)素主要耐藥機制Fig. 3 Main mechanisms of tigecycline resistance

    OqxAB外排泵是RND家族中第一個由質(zhì)粒介導(dǎo)的外排泵,由膜融合蛋白OqxA和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白OqxB組成。Veleba等[58]對肺炎克雷伯菌的研究結(jié)果表明,rarA的過表引起OqxAB和AcrAB表達(dá)上調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致包括替加環(huán)素在內(nèi)的多耐藥表型。此外,該項研究還發(fā)現(xiàn)OqxAB外排泵受到OqxR的負(fù)調(diào)控。Veleba等[53]在另一項研究中發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌對替加環(huán)素耐藥的主要介導(dǎo)因素為RamR調(diào)控引起的RamA表達(dá)增加。隨后,Jiménez-Castellanos等[59]對肺炎克雷伯菌的研究證實了OqxAB同時受RamA和RarA的調(diào)控。綜上所述,OqxAB同時受到RarA、RamA以及OqxR的調(diào)控,其中RarA和RamA調(diào)控蛋白介導(dǎo)細(xì)菌對替加環(huán)素的耐藥性。

    SdeXY-HasF外排泵系統(tǒng)由膜融合蛋白(SdeX)、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白(SdeY)和外膜蛋白(HasF)組成。SdeXY是在機會致病菌——粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中發(fā)現(xiàn)的第一個RND型外排泵,是一種能量依賴的藥物外排泵,具有廣泛的藥物底物,在粘質(zhì)沙雷氏菌多重耐藥過程中發(fā)揮了重要作用[60]。HasF是粘質(zhì)沙雷菌的TolC同系物,參與能量依賴的流出[61]。SdeXY-HasF外排泵系統(tǒng)的上調(diào)與粘質(zhì)沙雷氏菌對替加環(huán)素的耐藥性有關(guān),進(jìn)一步的研究需要闡明SdeXY過表達(dá)的機制[52]。

    TMexCD1-TOprJ1是最近在動物源克雷伯氏菌中發(fā)現(xiàn)的由IncFIA質(zhì)粒編碼的RND型外排泵[54]。TMexCD1-TOprJ1與銅綠假單胞菌染色體編碼的MexCD-OprJ外排泵氨基酸同源性為64.5%~77.8%,在大腸桿菌中表達(dá)TMexCD1-TOprJ1導(dǎo)致替加環(huán)素外排增加。tmexcd1-toprj1基因在動物源腸桿菌和假單胞菌中較為常見[62],然而近2年在人醫(yī)臨床分離的細(xì)菌中陸續(xù)有報道該基因的檢出[63-64],TMexCD1-TOprJ1的腸桿菌已擴散到食品市場的環(huán)境污水[65]。目前,已鑒定出其他2種類似的外排泵,其中TMexCD2-TOprJ2位于解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)的質(zhì)粒和染色體[66],TMexCD3-TOprJ3發(fā)現(xiàn)于動物源變形桿菌染色體(Proteusmirabilis)[67]。這一類型外排泵基因主要分布在克雷伯氏菌的雜合質(zhì)粒中,如IncHI1B-FIB質(zhì)粒、IncC-IncX3質(zhì)粒[62,65,68]。

    AdeABC、AdeIJK和AdeFGH這3種RND家族外排泵被認(rèn)為與鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的耐藥有關(guān)[55,69-70],其中,AdeABC外排泵系統(tǒng)在臨床分離的產(chǎn)碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌中最為常見[71]。該外排泵系統(tǒng)由膜連接蛋白AdeA、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白AdeB和外膜通道蛋白AdeC組成,其轉(zhuǎn)錄水平受到AdeRS雙組分系統(tǒng)的調(diào)控。

    2.1.2 MFS家族外排泵

    Tet(A)外排泵,是臨床上發(fā)現(xiàn)的最常見的四環(huán)素MFS型外排泵[72],主要存在于革蘭氏陰性菌中。Tet(A)蛋白具有12個跨膜α-螺旋片段,其表達(dá)受到TetR蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,TetR蛋白屬于阻遏蛋白,四環(huán)素通過結(jié)合TetR阻遏蛋白將其從操縱子O1、O2上解離下來,進(jìn)而促進(jìn)tet(A)的表達(dá)[73]。雖然替加環(huán)素克服了四環(huán)素特異性外排泵Tet(A)的耐藥機制,但tet(A)突變體能介導(dǎo)細(xì)菌對替加環(huán)素高水平耐藥[52]。Hentschke等[74]對一株呈現(xiàn)替加環(huán)素高水平耐藥(MIC=16 μg·mL-1)的沙門菌進(jìn)行研究,分子機制分析表明tet(A)突變和ramR失活介導(dǎo)沙門菌對替加環(huán)素的高水平耐藥,且tet(A)突變體位于質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)座子Tn1721中。質(zhì)粒攜帶的tet(A)基因在臨床上產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌中廣泛存在,tet(A)的突變是導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥性的主要原因[75-76]。

    Tet(L)是MFS家族外排泵中一種具有14個跨膜片段的四環(huán)素外排泵蛋白[77-78],主要存在于革蘭氏陽性菌中。Tet(L)蛋白與Tet(K)類似,都能催化四環(huán)素-二價金屬離子Me2+復(fù)合物與H+逆向轉(zhuǎn)運而介導(dǎo)四環(huán)素類抗生素耐藥(圖3)[79]。tet(L)基因于1992年首次在葡萄球菌的質(zhì)粒pSTE1中報道[80],常在革蘭氏陽性菌(如芽孢桿菌、葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌)的質(zhì)粒中被發(fā)現(xiàn),通常位于大小、結(jié)構(gòu)不同的質(zhì)粒上,并與四環(huán)素類耐藥基因tet(T)和tet(K)、氨基糖苷類耐藥基因aadD共存[81-82]。在革蘭氏陰性菌(如巴氏桿菌和曼海姆氏菌)的質(zhì)粒中偶爾也有報道[83]。Tet(L)外排泵可以輸出四環(huán)素和強力霉素,但不能外排替加環(huán)素。然而,已有研究表明,Tet(L)外排泵過表達(dá)可導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥,如在腸球菌中,Tet(L)外排泵和Tet(M)核糖體保護(hù)蛋白的過表達(dá)介導(dǎo)了替加環(huán)素的耐藥[84]。此外,Tet(L)外排泵突變也能介導(dǎo)替加環(huán)素耐藥,我國報道了新型Tet(L)外排泵變異體——tet(L)F58L和tet(L)A117V,可介導(dǎo)葡萄球菌、彎曲桿菌對替加環(huán)素和依拉環(huán)素的耐藥性[85-86]。

    2.2 替加環(huán)素耐藥基因tet(X)及其變異體的產(chǎn)生與流行

    替加環(huán)素修飾酶是由tet(X)及其變異基因編碼的黃素依賴性單加氧酶。Tet(X)由388個氨基酸組成,在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、氧氣(O2)和鎂離子(Mg2+)存在的條件下具有催化活性,可催化降解傳統(tǒng)以及新型四環(huán)素類抗生素,pH為8.5時該酶的活性最高[14]。到目前為止,質(zhì)粒攜帶的可轉(zhuǎn)移tet(X)及其變異體有tet(X)、tet(X3)、tet(X4)、tet(X5)、tet(X6)和tet(X7),可介導(dǎo)對替加環(huán)素的高水平耐藥,其編碼的Tet(X)修飾酶可羥化替加環(huán)素的C11a,生成11a-羥基替加環(huán)素(圖3)。tet(X)基因家族在不同來源細(xì)菌或環(huán)境中的流行情況如表2所示。

    2.2.1tet(X)

    總之,通過“中國尋根之旅”的活動,組織來華青少年參加華語培訓(xùn),提高其漢語知識能力和漢語應(yīng)用水平,通過一批批的營員返回駐在國后帶動當(dāng)?shù)貪h語學(xué)習(xí)熱潮。更進(jìn)一步培養(yǎng)一批初級漢語教師,通過培訓(xùn)提高他們的教學(xué)水平,回國后在華語教學(xué)界發(fā)揮帶動作用,從而在較大范圍內(nèi)提高華文教學(xué)質(zhì)量,推動華文教育加速發(fā)展。

    tet(X)是第一個能直接滅活四環(huán)素的抗性基因。1982年,Tally等[87]在擬桿菌質(zhì)粒pBFTM10上發(fā)現(xiàn)新的四環(huán)素耐藥基因。1984年,Guiney等[88]發(fā)現(xiàn)位于質(zhì)粒pBF4的類似的耐藥基因,研究人員將該基因克隆到大腸桿菌載體中,藥敏試驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)化菌株在好氧條件下表達(dá)四環(huán)素耐藥性,而在擬桿菌屬(嚴(yán)格的厭氧菌)中不表達(dá)四環(huán)素耐藥性。1986年,Matthews和Guiney[89]的研究表明新的四環(huán)素耐藥基因位于質(zhì)粒pBFTM10上的轉(zhuǎn)座子Tn4400和質(zhì)粒pBF4上的轉(zhuǎn)座子Tn4351。1989年,Speer和Salyers[90]證明了這種四環(huán)素抗性基因產(chǎn)物對四環(huán)素進(jìn)行了化學(xué)修飾,該基因是第一個通過化學(xué)修飾四環(huán)素的耐藥機制的例子。1990年,Speer和Salyers[91]認(rèn)為該四環(huán)素基因不與已知的四環(huán)素耐藥基因雜交,屬于單獨的一類耐藥基因,并將該基因命名為tet(X)。

    2.2.2tet(X1)、tet(X2)

    2001年,Whittle等[92]首次在擬桿菌屬結(jié)合轉(zhuǎn)座子CTnDOT上發(fā)現(xiàn)了tet(X1)基因和tet(X2)基因,tet(X2)編碼的蛋白與tet(X)編碼的蛋白有99%的氨基酸同源性,然而tet(X1)編碼的蛋白與tet(X)編碼的蛋白僅有66%的氨基酸同源性。從tet(X)及其變體的首次發(fā)現(xiàn)至今,tet(X)/tet(X2)基因已在全球范圍內(nèi)廣泛傳播。2020年,F(xiàn)ang等[2]的流行病學(xué)回溯性研究表明,tet(X)/tet(X2)基因傳播范圍已超過16個國家/地區(qū),覆蓋七大洲中的五大洲,并廣泛存在于各種生態(tài)系統(tǒng)中,包括人體腸道、土壤、沉積物、醫(yī)院廢水、污水廠污水、河水、牲畜糞便和環(huán)境氣溶膠。

    2.2.3tet(X3)、tet(X3.2)、tet(X4)

    He等[5]于2019年首次發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的高水平替加環(huán)素耐藥基因tet(X3)和tet(X4),分別位于p34AB質(zhì)粒和p47EC質(zhì)粒上。Tet(X3)和Tet(X4)滅活所有的四環(huán)素家族,包括替加環(huán)素和FDA新批準(zhǔn)的依拉環(huán)素和奧馬環(huán)素。2019年,tet(X3.2)首次從來源于蝦樣本的短穩(wěn)桿菌(Empedobacterbrevis)中鑒定出,且位于質(zhì)粒pSE1-3-9kb上,tet(X3.2)與tet(X3)和tet(X4)耐藥表型類似[93]。He等[5]的流行病學(xué)研究顯示,tet(X3)/tet(X4)在山東屠宰場的豬盲腸樣本中檢出率最高(40/60, 66.7%),替加環(huán)素耐藥菌分離株主要為腸桿菌科(51/77)和不動桿菌屬(16/77)。Dong等[94]分離得到289株tet(X)變異體陽性分離株,其中大部分不動桿菌分離株(83/289)攜帶tet(X3),所有大腸桿菌分離株(84/289)均攜帶tet(X4)。Sun等[20]從4 189份樣本中鑒定出42株tet(X4)陽性的大腸桿菌分離株,其中有24株(24/42, 57.1%)大腸桿菌攜帶的tet(X4)位于質(zhì)粒pLHM10-1-p6上,樣本來源主要為豬糞便(30/4189, 0.7%),在污水、蔬菜和人身上均未檢出。Li等[95]采用全基因組測序(WGS)和單質(zhì)粒分子分析方法,研究了tet(X4)載體質(zhì)粒的多樣性,攜帶tet(X4)的質(zhì)粒大小范圍為9~294 kb,質(zhì)粒種類有ColE2-like、IncQ、IncX1、IncA/C2、IncFII、IncFIB和具有不同復(fù)制子的雜交質(zhì)粒。2020年,F(xiàn)ang等[2]的流行性病學(xué)回溯性研究表明,tet(X3)和tet(X4)已廣泛分布于不動桿菌屬和腸桿菌科,樣本來源于動物、人、食物和環(huán)境中。

    表2 tet(X)基因在不同來源細(xì)菌或環(huán)境中的流行情況Table 2 Distribution of tet(X) genes in bacteria or environments from different sources

    2.2.4tet(X5)~tet(X14)

    tet(X5)首次發(fā)現(xiàn)于一株來源于臨床傷口樣本的鮑曼不動桿菌,tet(X5)位于質(zhì)粒pAB17H194上,其耐藥水平略低于tet(X3)和tet(X4)[96]。He等[97]從豬肉樣本中分離出1株攜帶tet(X6)的奇異變形桿菌,tet(X6)位于染色體ICEPgs6Chn1,該染色體上還存在其他耐藥基因floR、strB、strA、aph(30)-Ia、aac(3)-IV、aph(4)-Ia和sul2。Gasparrini等[98]從一株臨床銅綠假單胞菌分離株中鑒定出tet(X7),該菌株來源于囊性纖維化患者氣管吸出物。在同一項研究中,7個tet(X)變體tet(X7)~tet(X13)通過功能宏基因組學(xué)的方法檢測出,樣本來源于環(huán)境、人類共生菌和致病菌,這些基因介導(dǎo)包括FDA最近批準(zhǔn)的奧馬環(huán)素和依拉環(huán)素在內(nèi)的所有四環(huán)素類抗生素的耐藥性。2021年,Soliman等[99]從埃及雞糞便樣本中分離出5株攜帶tet(X7)的大腸桿菌菌株,該基因位于質(zhì)粒pMS8345A上,藥敏結(jié)果表明5株分離株對替加環(huán)素的MIC值為8~16 μg·mL-1。Cheng等[100]發(fā)現(xiàn)tet(X)家族新變體tet(X14),該基因位于穩(wěn)桿菌的染色體上,菌株來源于中國養(yǎng)殖場的豬糞便樣本,該項研究表明黃桿菌科可能是tet(X14)的主要宿主。

    2020年,Liu等[101]在肉雞和豬樣本中發(fā)現(xiàn)了tet(X6)的4個亞型,亞型一來源于褐色類香味菌(Myroidesphaeus),亞型二來源于卡氏變形桿菌(Proteuscibarius),亞型三來源于奇異變形桿菌(Proteusmirabilis),亞型四來源于魯氏不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)和約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii),亞型二、三、四與亞型一的蛋白質(zhì)序列差異分別為16、4和11個氨基酸。2021年,Xu等[102]將亞型二、三、四重新命名為tet(X15)~tet(X17)。

    2.2.6tet(X18)~tet(X44)

    2021年,Umar等[103]從GenBank中收集的57個鴨疫里氏桿菌非冗余基因組序列中發(fā)現(xiàn)了26個新變異體tet(X18)~tet(X44),廣泛擴展了現(xiàn)有tet(X)家族,研究結(jié)果表明鴨疫里氏桿菌是tet(X)基因家族的天然存儲庫。此外,該項研究還在鴨疫里氏桿菌的染色體中發(fā)現(xiàn)了Tet(X2)與Tet(X4)的進(jìn)化前體Tet(X2/4)-P,對替加環(huán)素呈現(xiàn)中水平耐藥(MIC=8 μg·mL-1)。鴨疫里氏桿菌是tet(X)基因家族傳播到臨床病原體的跳板[104]。

    2.2.7tet(X45)~tet(X47)

    2021年,Zhang等[23]從12 829份人體微生物宏基因組樣本中重建了202 265個宏基因組組裝基因組(metagenome-assembled genomes, MAGs),并鑒定出3個新tet(X)基因,tet(X45)、tet(X46)和tet(X47)編碼的蛋白與tet(X2)編碼的蛋白分別有91%、97%和98%的氨基酸同源性,tet(X45)、tet(X46)和tet(X47)均對替加環(huán)素耐藥(8~16 μg·mL-1),并對奧馬環(huán)素(16~32 μg·mL-1)和依拉環(huán)素(2~4 μg·mL-1)高水平耐藥。

    綜上所述,替加環(huán)素耐藥機制已經(jīng)得到國內(nèi)外研究人員的持續(xù)關(guān)注[2, 104-106],目前已探明質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥機制有:RND型外排泵OqxAB和TMEXcd1-TOprJ1,MFS外排泵Tet(A)突變體和Tet(L)突變體,以及Tet(X)修飾酶及其變異體Tet(X3)、Tet(X4)、Tet(X5)、Tet(X6)和Tet(X7)。質(zhì)粒介導(dǎo)的高水平替加環(huán)素耐藥基因tet(X3)和tet(X4)被首次發(fā)現(xiàn)后,tet(X)變異體正以飛快的速度變化發(fā)展,目前已發(fā)展至tet(X47)。

    2.3 tet(X)基因家族分布特征

    為了解析tet(X)基因家族的細(xì)菌宿主以及質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥基因的分布情況,基于Zhang等[23]對tet(X)及其變異體的全球溯源分析,本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了852個攜帶替加環(huán)素耐藥基因的細(xì)菌基因組加以分析。使用基因組分類數(shù)據(jù)庫(Genome Taxonomy Database, GTDB)進(jìn)行物種分類[107],使用耐藥基因數(shù)據(jù)庫(Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD)注釋細(xì)菌基因組上的耐藥基因[108]。結(jié)果表明,tet(X)基因家族宿主主要為擬桿菌門(Bacteroidota)、彎曲桿菌門(Campylobacterota)、厚壁菌門(Firmicutes_A)和變形菌門(Proteobacteria)。在細(xì)菌科水平上分屬于以下20種細(xì)菌:Acutalibacteraceae、Aeromonadaceae、Arcobacteraceae、Bacteroidaceae、Campylobacteraceae、Chitinophagaceae、Enterobacteriaceae、Flavobacteriaceae、Lachnospiraceae、Marinifilaceae、Moraxellaceae、Muribaculaceae、Paludibacteraceae、Pseudomonadaceae、Rikenellaceae、Saprospiraceae、Shewanellaceae、Sphingobacteriaceae、Tannerellaceae和Weeksellaceae。其中,腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、莫拉氏菌科不動桿菌屬(Moraxellaceae,Acinetobacter)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)、威克氏菌科(Weeksellaceae)多種細(xì)菌攜帶替加環(huán)素耐藥基因(圖4(a))。在細(xì)菌基因組水平上,852株細(xì)菌的染色體和質(zhì)粒上攜帶tet(X)、tet(X1)、tet(X3)、tet(X4)、tet(X5)和tet(X6),同時共存多種四環(huán)素類抗生素耐藥基因:tet(33)、tet(39)、tet(40)、tet(43)、tet(45)、tet(49)、tet(52)、tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(J)、tet(V)、tet(W/N/W)、tet(X1)、tet(X3)、tet(X4)、tet(X5)、tet(X6)、tet(Y)、tet32、tet36、tetA(P)、tetB(60)和tetB(P)(圖4(b))。此外,852個細(xì)菌基因組中共有74個質(zhì)粒攜帶四環(huán)素耐藥基因,這些質(zhì)粒來自不動桿菌屬10種不同細(xì)菌,如腸桿菌科大腸桿菌、費格森埃希菌、變形桿菌,擬桿菌細(xì)菌等,質(zhì)粒上總共發(fā)現(xiàn)13種四環(huán)素耐藥基因:tet(A)、tet(B)、tet(D)、tet(X3)、tet(X4)、tet(X5)、tet(X6)、tet(Y)、tet36、tetB(60)、tetM、tetR和tet(X)(圖4(b))。值得注意的是,這些菌株同時攜帶不同類型的臨床重要抗生素耐藥基因,如超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(blaCMY、blaCTX-M、blaIMP、blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaSHV和blaTEM)、質(zhì)粒介導(dǎo)的粘菌素耐藥基因(mcr-1.1、mcr-3.5、mcr-1.4、mcr-3.2、mcr-3.1和mcr-9.1)。

    圖4 tet(X)宿主細(xì)菌物種分類及其攜帶的耐藥基因注:(a) tet(X)宿主細(xì)菌物種分類;(b) tet(X)在細(xì)菌染色體和質(zhì)粒中的分布特征。Fig. 4 Phylogenetic analyses of the tet(X) carrying isolatesNote: (a) Genome taxonomy of tet(X) carrying isolates; (b) Prevalence of tet(X) in bacterial genome and plasmids.

    在852個攜帶替加環(huán)素耐藥基因的細(xì)菌中,一株攜帶tet(X)基因的超級耐藥致病菌值得關(guān)注。Hu等[109]從病人尿液樣本中分離出一株多耐藥香味類香味菌(Myroidesodoratimimus)PR63039,抗生素敏感性試驗結(jié)果顯示PR63039對所測試的21種抗生素均耐藥?;蚪M分析顯示其基因組含有大量的耐藥基因,包括β-內(nèi)酰胺酶、四環(huán)素、氯霉素、喹諾酮、多耐藥質(zhì)子泵基因、耐藥突變基因rpoB和gyrA,并且染色體和質(zhì)粒上均攜帶有tet(X)基因。從病人身上分離出來的攜帶tet(X)基因的超級耐藥菌的出現(xiàn),對抗生素療效構(gòu)成極大的威脅,應(yīng)警惕此類攜帶tet(X)及其變異體的超級耐藥致病菌介導(dǎo)的替加環(huán)素高水平耐藥性。

    3 研究展望(Research prospect)

    細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)對生態(tài)安全與公共健康構(gòu)成重大威脅,世界各國正積極采取行動,從動物-環(huán)境-人類的視角,以“大健康(One Health)”理念開展遏制細(xì)菌耐藥工作。細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)已證明替加環(huán)素耐藥基因的細(xì)菌宿主同時攜帶不同類型的臨床重要抗生素耐藥基因,表明其耐藥機制趨于復(fù)雜。因此,研究替加環(huán)素的耐藥機制和傳播機制,對臨床治療多重耐藥菌的感染和遏制細(xì)菌耐藥性具有重要意義。對于今后的研究重點,我們認(rèn)為需要主要關(guān)注幾個方面的工作。

    (1)超級耐藥菌的出現(xiàn)是多種抗生素選擇壓力下共同作用的結(jié)果。雖然目前替加環(huán)素未被批準(zhǔn)用于養(yǎng)殖行業(yè),但替加環(huán)素耐藥可導(dǎo)致第四代新型四環(huán)素類藥物的交叉耐藥,同時影響一代、二代四環(huán)素類抗生素的應(yīng)用,仍應(yīng)持續(xù)關(guān)注養(yǎng)殖業(yè)中新型替加環(huán)素耐藥機制的產(chǎn)生與發(fā)展。

    (2)替加環(huán)素高水平耐藥基因的宿主屬于不同細(xì)菌物種,并且分布于臨床環(huán)境和非臨床環(huán)境,可能會在“動物-環(huán)境-人類”鏈條中傳播,當(dāng)前耐藥細(xì)菌的傳播機制研究主要集中于臨床環(huán)境,應(yīng)加強非臨床環(huán)境(如養(yǎng)殖環(huán)境和城市環(huán)境)中的研究。

    (3)2020年后tet(X)基因家族的不斷壯大歸因于宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,tet(X)變異體成員的迅速增加說明了其大規(guī)模傳播的可能性,因此,有必要進(jìn)一步通過宏基因組學(xué)監(jiān)測新發(fā)現(xiàn)的tet(X)變異體的快速傳播,并探究其他未知的四環(huán)素修飾酶基因,重點監(jiān)測新的四環(huán)素特異性外排泵突變體介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥性。

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