微囊藻毒素異構(gòu)體產(chǎn)生的調(diào)控因子及其在自然水體中分布的研究進(jìn)展

顧毓蓉，程晨，趙雁雁，薛慶舉，萬(wàn)翔，張凱曄，謝麗強(qiáng),*

1. 中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008 2. 昆山經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)安全生產(chǎn)監(jiān)督管理和環(huán)境保護(hù)局，昆山 215300 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 4. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所國(guó)家環(huán)境保護(hù)農(nóng)藥環(huán)境評(píng)價(jià)與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210044

微囊藻毒素（MCs）是淡水水體中最常見(jiàn)、研究最多的一種藍(lán)藻毒素，可由微囊藻屬（Microcystis）、長(zhǎng)胞藻屬（Dolichospermum）、浮絲藻屬（Planktothrix）、顫藻屬（Oscillatoria）、念珠藻屬（Nostoc）和束絲藻屬（Aphanizomenon）等藻類(lèi)在細(xì)胞內(nèi)合成[1-2]。MCs毒性效應(yīng)嚴(yán)重[3]，能夠通過(guò)抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶活性、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化作用、基因損傷和細(xì)胞凋亡等機(jī)制損傷肝細(xì)胞從而導(dǎo)致生物肝內(nèi)出血甚至死亡[4]。1996年，巴西醫(yī)院發(fā)生因使用被藻毒素污染的水造成60例患者死亡的嚴(yán)重事故，引起了世界各國(guó)對(duì)有毒藍(lán)藻水華和MCs污染的進(jìn)一步關(guān)注[5-6]。為了避免類(lèi)似事件的發(fā)生，我國(guó)與世界衛(wèi)生組織（WHO）均規(guī)定MC-LR在飲用水中的濃度限值為1 μg·L-1（生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范GB/T 5750—2001，地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB 3838—2002）。

MCs結(jié)構(gòu)種類(lèi)較多，得益于質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)已知的MCs異構(gòu)體數(shù)量迅速增加，現(xiàn)已報(bào)道了246種構(gòu)型[7]。不同異構(gòu)體的毒性存在較大差異，MC-LR的半數(shù)致死量（LD50）（小鼠腹腔注射）為50 μg·kg-1（以單位體質(zhì)量計(jì)），與它在結(jié)構(gòu)上僅一個(gè)L-氨基酸差異的MC-RR的LD50為500～800 μg·kg-1[8]，而[（6Z）-Adda5]MC-LR的LD50可高于1 200 μg·kg-1[9]。一般來(lái)說(shuō)，自然水體中MCs由多種異構(gòu)體組成[10-11]，僅憑總MCs或MC-LR濃度無(wú)法準(zhǔn)確判斷一個(gè)區(qū)域的MCs實(shí)際毒性和污染情況，因此，了解不同MCs異構(gòu)體在水體的分布特征對(duì)準(zhǔn)確進(jìn)行MCs毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)至關(guān)重要。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)MCs異構(gòu)體產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了一系列探究，發(fā)現(xiàn)除遺傳因子調(diào)控外，溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)元素、風(fēng)力和水力條件等環(huán)境因子也能不同程度影響藻類(lèi)生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而影響MCs的產(chǎn)生[10, 12-15]。但針對(duì)異構(gòu)體的研究多集中于原位調(diào)查數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，且分析結(jié)果在不同研究中常存在較大差異。因此，關(guān)于MCs異構(gòu)體產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)機(jī)制尚無(wú)法確定，識(shí)別MCs異構(gòu)體產(chǎn)生的關(guān)鍵影響因子、探究其調(diào)控機(jī)制仍是研究熱點(diǎn)。

綜上所述，針對(duì)MCs異構(gòu)體研究的國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀，本文主要從MCs的基本概況、異構(gòu)體分布、遺傳因子和環(huán)境因子對(duì)MCs異構(gòu)體調(diào)控的影響等幾個(gè)方面進(jìn)行概述，重點(diǎn)介紹了MCs異構(gòu)體合成的調(diào)控機(jī)制方面的重要研究，并對(duì)相關(guān)領(lǐng)域進(jìn)行了展望。這對(duì)正確認(rèn)識(shí)MCs異構(gòu)體產(chǎn)生及轉(zhuǎn)化過(guò)程以及評(píng)價(jià)MCs綜合毒性和健康風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義，并可為湖泊藍(lán)藻水華次生危害的防護(hù)與治理提供理論依據(jù)。

1 自然水MCs的基本概況（Basic profiles of MCs）

1.1 MCs的結(jié)構(gòu)特征

MCs為單環(huán)七肽結(jié)構(gòu)，多肽中2種可變L-氨基酸的替換形成了多種MCs異構(gòu)體[7, 16]（圖1），其中最常見(jiàn)的是MC-LR、MC-RR和MC-YR[17]。環(huán)狀結(jié)構(gòu)使得MCs化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，純化的MCs具有耐熱性，加熱煮沸都不能將其毒素破壞，能夠抵抗極端pH（pH=1，T=40 ℃時(shí)開(kāi)始分解）、陽(yáng)光和常見(jiàn)酶[18]。所以過(guò)濾、混凝和沉淀等傳統(tǒng)水處理工藝對(duì)MCs的去除效果較低[19-20]，處理過(guò)程中還可能會(huì)破壞藻細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的毒素釋放到水體中，反而增加了水中MCs濃度[21]。

1.2 產(chǎn)毒基因mcy及MCs合成過(guò)程

已有研究表明，并非所有微囊藻都能產(chǎn)毒，產(chǎn)毒菌株和無(wú)毒菌株差異是由一種或多種疑似微囊藻毒素合成酶基因（mcy）造成的[22]，歐洲9個(gè)國(guó)家分離出的所有無(wú)毒藍(lán)藻菌株均顯示丟失了90%的mcy基因簇[23]。2000年，Tillett等[4]在銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa）PCC 7806的染色體中分離出了mcy基因并進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)mcy基因簇是一段55 kb的DNA，由mcyA-C和mcyD-J這2個(gè)轉(zhuǎn)錄操縱子組成（圖2（a））。中央啟動(dòng)子位于mcyA和mcyD之間，而mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、mcyI和mcyJ可能具有單獨(dú)的啟動(dòng)子[24]。根據(jù)Tillett等[4]推測(cè)，Adda側(cè)鏈合成是形成MC-LR的第1步，mcyG首先啟動(dòng)，活化苯丙素為底物，并在mcyG操縱子PKS模塊的作用下與丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA）、還原性輔酶Ⅱ（NADPH）、H+和2個(gè)S-腺苷酸硫氨酸（SAM）進(jìn)行反應(yīng)，完成第1個(gè)丙二酰輔酶A延伸，生成中間產(chǎn)物①。由mcyD基因完成Adda合成的第2階段，在mcyG基因的合成產(chǎn)物上進(jìn)行第2個(gè)丙二?；鶊F(tuán)的延長(zhǎng)和修飾，生成中間產(chǎn)物②；mcyE基因完成第3個(gè)丙二?；鶊F(tuán)的添加、延長(zhǎng)和修飾，并負(fù)責(zé)將D-谷氨酸結(jié)合到Adda鏈上，生成中間產(chǎn)物③（圖2（b））。在mcyE、mcyA、mcyB、mcyI和mcyC的作用下，Adda尾部依次延伸L-Glu、L-Ala、L-Ser、L-Leu、D-MeAs和L-Arg，逐步形成七肽，然后環(huán)化形成MC-LR。當(dāng)mcyB和mcyC中A2、A4均激活氨基酸L-Arg時(shí)，在中間產(chǎn)物⑦和⑨上分別延伸L-Arg，在最終合成為MC-RR，當(dāng)mcyB和mcyC中的A2、A4分別激活L-Try和L-Arg時(shí)，在中間產(chǎn)物⑦和⑨上分別延伸L-Try和L-Arg，最終合成MC-YR（圖2（c））。

1.3 MCs的檢測(cè)方法

MCs在自然水體中的濃度僅為μg·L-1，甚至ng·L-1級(jí)別，常規(guī)的化學(xué)方法往往難以快速、準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。高效液相色譜法（HPLC）是世界衛(wèi)生組織所推薦的MCs檢測(cè)方法，也是最常用的方法，可以對(duì)多種構(gòu)型的MCs進(jìn)行同步檢測(cè)[26]。在傳統(tǒng)HPLC基礎(chǔ)上發(fā)展的UPLC/U-HPLC結(jié)合質(zhì)譜提高了檢測(cè)MCs的靈敏度和速度[10, 27-28]。然而，目前仍有多種MCs異構(gòu)體未分離純化出標(biāo)準(zhǔn)樣品，考慮到檢測(cè)效率、成本和實(shí)際樣品濃度，通常檢測(cè)MC-LR、MC-RR和MC-YR這3種含量較高且毒性較大的異構(gòu)體[18, 29]。酶聯(lián)免疫法（ELISA）也是常見(jiàn)的檢測(cè)方法之一[30-32]，其試劑盒已經(jīng)商品化。但酶聯(lián)反應(yīng)干擾因素較多，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，而且此方法只針對(duì)MC-LR一種構(gòu)型，對(duì)其他MCs異構(gòu)體往往需要不同的標(biāo)準(zhǔn)品和試劑盒[33-34]。另外，分子生物學(xué)檢測(cè)法是建立在mcy基因和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）基礎(chǔ)上的一種新興檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)毒藻基因豐度表征MCs濃度。Via-Ordorika等[35]、Otten等[36]的研究證明產(chǎn)毒基因mcyA、mcyB、mcyE基因與MCs濃度有著顯著正相關(guān)關(guān)系。然而也有研究指出，產(chǎn)毒基因豐度與毒素濃度之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性[37]。qPCR技術(shù)在自然水樣檢測(cè)過(guò)程中受諸多因素的影響，溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)鹽等都可能影響mcy表達(dá)。可見(jiàn)，產(chǎn)毒基因豐度與MCs濃度的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

2 自然水體中MCs分布及其異構(gòu)體組成（Distribution and congeners composition of MCs in natural water body）

據(jù)報(bào)道，MCs在世界范圍（除南極洲外）的水體中均有分布，257個(gè)國(guó)家和地區(qū)中有108個(gè)國(guó)家暴發(fā)過(guò)微囊藻水華，79個(gè)國(guó)家出現(xiàn)過(guò)MCs污染[9]。我國(guó)的太湖、巢湖、滇池和洱海等許多淡水湖泊也存在較為嚴(yán)重的藍(lán)藻水華和MCs污染問(wèn)題。

綜合已有調(diào)查結(jié)果，各地區(qū)水域中MCs異構(gòu)體的組成存在明顯差異（表1）。中國(guó)鄱陽(yáng)湖[10]、日本Suwa湖[38]、土耳其Sapanca湖[39]中主要異構(gòu)體為MC-RR，而德國(guó)Neukirchener湖[39]、希臘Zaravina湖[40]中主要異構(gòu)體為MC-LR。2013—2014年太湖中檢出的MC-LR和MC-RR占比相近，分別占40%和39%[11]，這與法國(guó)一些湖泊的調(diào)查結(jié)果相似。MC-FR和MC-WR在我國(guó)水體中檢出較少，但它們卻是新西蘭的Horowhenua水體中的主要MCs異構(gòu)體，濃度達(dá)13.86 μg·L-1和12.90 μg·L-1[41]。另外，水體中總MCs及異構(gòu)體的組成和濃度往往會(huì)因采樣季節(jié)的不同而存在差異。從季節(jié)分布特征看，總MCs濃度通常表現(xiàn)出夏季最高，秋季降低，冬季最低，隨后春季又升高的變化趨勢(shì)[11-12, 42]。在以微囊藻為優(yōu)勢(shì)產(chǎn)毒藍(lán)藻的希臘Pamvotis湖中，MC-LR表現(xiàn)出春夏升高、秋冬降低的變化趨勢(shì)，而MC-RR表現(xiàn)出秋冬占比上升（86%和71%），春夏占比下降（34%和47%）的趨勢(shì)，MC-YR僅在冬季檢出，占比為25%[40]。

表1 國(guó)內(nèi)外MCs分布及其主要異構(gòu)體類(lèi)型Table 1 MCs distribution and the main microcystin congeners all over the world

續(xù)表1

實(shí)際環(huán)境中不同的異構(gòu)體可由不同藍(lán)藻或同種藍(lán)藻的不同菌株產(chǎn)生，這些藻細(xì)胞的生物量隨生態(tài)位的變化而變化。因此，湖泊產(chǎn)毒藻類(lèi)群落結(jié)構(gòu)的差異可能造成MCs異構(gòu)體組成不同。在微囊藻或長(zhǎng)胞藻為優(yōu)勢(shì)屬的水域中，MC-LR、MC-RR通常為主要MCs異構(gòu)體[10, 40, 50]。在紅色浮絲藻為優(yōu)勢(shì)種的水體中，dmMC-RR濃度通常較高[51-52]，意大利Garda湖中檢出的dmMC-RR占總MCs的90%以上。Stechlin湖[42]中以卷曲長(zhǎng)孢藻和銅綠微囊藻為優(yōu)勢(shì)種時(shí)，主要MCs異構(gòu)體為MC-LL，而以水華束絲藻和紅色浮絲藻為優(yōu)勢(shì)種時(shí)主要MCs異構(gòu)體變?yōu)镸C-LW。可見(jiàn)，MCs異構(gòu)體組成與湖泊產(chǎn)毒藻群落結(jié)構(gòu)有著直接關(guān)系，而藻類(lèi)種群豐度又受地理位置、氣象條件、水體理化參數(shù)等多種因素影響，因此MCs異構(gòu)體的調(diào)控機(jī)制涉及多種影響因子，具有一定復(fù)雜性，需要開(kāi)展進(jìn)一步深入探究。

3 遺傳因子對(duì)MCs異構(gòu)體的調(diào)控（Regulation of genetics factor to microcystin congeners）

已有研究報(bào)道MCs結(jié)構(gòu)的7個(gè)肽段均可發(fā)生變化，但最常見(jiàn)的是2號(hào)和4號(hào)位置處的2個(gè)可變L-氨基酸（X、Z）的替換以及3號(hào)和7號(hào)位置甲基化/去甲基化（圖1）。不同MCs異構(gòu)體的出現(xiàn)是由產(chǎn)毒藍(lán)藻中mcy基因編碼的差異造成的[53]。

3.1 非特異性非核糖體肽合成酶的影響

微囊藻毒素合成基因mcy中非特異性的非核糖體肽合成酶（NRPSs）可能是造成出現(xiàn)多種MCs異構(gòu)體的一個(gè)重要因素。mcy基因簇中各開(kāi)放結(jié)構(gòu)域以模塊化方式排列，其中每個(gè)非核糖體肽合成酶都至少含有一個(gè)腺苷酸化域（A域，adenylation domains）、硫酯域（T域，thiolation domain）、氨基酸縮合域（C域，condensation domains）和肽載體蛋白（PCPs，peptidyl carrier protein）。各合成階段中延長(zhǎng)肽段所需的氨基酸底物經(jīng)過(guò)腺苷酸化后被共價(jià)鍵合到磷酸泛肽基輔因子上，與相鄰的肽基載體蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合。這些結(jié)構(gòu)域的順序、數(shù)量決定了所得聚酮化合物的結(jié)構(gòu)[54]。遺傳序列的改變也可能影響這些結(jié)構(gòu)域的功能，以A域?yàn)槔?，遺傳編碼影響了其對(duì)氨基酸的識(shí)別和激活。擬念珠藻（Nostochopsissp.）152菌株mcyB的第一個(gè)模塊（mcyB1）中D→Y單個(gè)氨基酸變化可能導(dǎo)致2號(hào)位L-Arg的引入向L-Hty轉(zhuǎn)移，mcyC中V→I單個(gè)氨基酸變化可能導(dǎo)致MCs合成過(guò)程4號(hào)位L-Arg的引入向L-Har轉(zhuǎn)移[55]。通常情況下NRPS酶的結(jié)構(gòu)保守，但mcy基因簇中NRPS的酶特異性較弱。前文提到非特異性的腺苷酸化域能夠激活不同的氨基酸，而非特異性的肽載體蛋白則能將氨基酸以不同順序的組合[56]。例如，席藻（Phormidiumsp.）LP904c菌株mcyB1和mcyC中腺苷酸化域的多特異性，使其在MCs的2號(hào)和4號(hào)位處選擇引入Leu、Arg、Phe、Trp、Tyr、Met、Hph和Hty等多種氨基酸，產(chǎn)生至少16種MCs異構(gòu)體。但該菌株的mcy基因簇不編碼Hph、Hty生物合成的酶，它們的出現(xiàn)可能是由于MCs合成過(guò)程中mcyB1和mcyC的腺苷酸化域激活了鳥(niǎo)嘌呤肽生物合成的一部分氨基酸[53]。類(lèi)似的，微囊藻CAWBG11能夠產(chǎn)生至少47種MCs異構(gòu)體，其中由于控制2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)位的mcy底物非特異性產(chǎn)生的MCs異構(gòu)體有27種，3號(hào)位的去甲基異構(gòu)體的存在表明，mcyB2中A域能同時(shí)識(shí)別Masp和Asp，因此MCs中大約有2.5%的異構(gòu)體在第3個(gè)位置包含Asp，而不是Masp[57]。

3.2 基因重組的影響

基因重組能使mcy基因簇中模塊之間發(fā)生片段交換，影響各點(diǎn)位氨基酸的特異性，從而產(chǎn)生不同的異構(gòu)體。自然環(huán)境下，重組是微囊藻菌株中mcy基因變異的一種常見(jiàn)方式，微囊藻屬菌株的mcy基因簇中mcyA1、mcyA2、mcyB1和mcyC都易受其影響[54]。Tanabe等[58]確定了1株產(chǎn)自加拿大和10株產(chǎn)自亞洲的產(chǎn)毒微囊藻的mcyA、mcyD、mcyG和mcyJ的基因序列，分析發(fā)現(xiàn)mcyA有幾處潛在重組區(qū)域，但在mcyD、mcyG和mcyJ序列中未檢測(cè)到重組。Tooming-Klunderud等[59]在mcy的NMT結(jié)構(gòu)域、側(cè)翼dnaN-mcyJ基因的間區(qū)中均檢測(cè)到多個(gè)重組事件，同時(shí)檢測(cè)到因重組導(dǎo)致的模塊mcyB1和mcyC中A域之間的片段交換。這2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的重組可能是微囊藻菌株能夠合成MC-RR的關(guān)鍵。Bj?rg等[56]對(duì)比了11種微囊藻菌株mcyABC基因在序列水平的差異，系統(tǒng)遺傳學(xué)分析結(jié)果表明mcyB1模塊的腺苷酸化域有多個(gè)系統(tǒng)發(fā)育亞組。研究者將能夠激活Leu和Arg的mcyB1腺苷酸化域分別命名為mcyB1（B型）（以PCC 7806為例）和mcyB1（C型）（以HUB 5-2-4為例），并依此將實(shí)驗(yàn)菌株分為B、C共2類(lèi)。MCs異構(gòu)體檢測(cè)結(jié)果表明，B型菌株均可合成MC-LR異構(gòu)體，而C型菌株則不僅可以合成MC-RR異構(gòu)型，還能合成出MC-LR和MC-RR混合的MCs。序列分析表明HUB 5-2-4的mcyB1與mcyC間出現(xiàn)明顯的基因重組，使mcyB1獲得了與mcyC高度相似的腺苷酸化域的序列與底物結(jié)合口袋，因此在2號(hào)和4號(hào)位均能夠激活識(shí)別Arg，產(chǎn)生MC-RR異構(gòu)體。部分C型菌株能夠同時(shí)合成MC-LR可能是由于殘基Gly236所致。此后的研究多沿用這種分類(lèi)[59-60]，Meyer等[60]發(fā)現(xiàn)能同時(shí)合成MC-LR、MC-RR和MC-YR的銅綠微囊藻NIES 843也屬于mcyB1（C型）菌株。然而，自然水體中還有產(chǎn)MC-LY、MC-LA等異構(gòu)體的銅綠微囊藻，其基因型分類(lèi)尚未建立。因此，異構(gòu)體合成與基因多態(tài)性的研究仍需進(jìn)行。

值得注意的是，盡管重組增加了mcy基因的多樣性，但也可能因此影響mcy基因簇的功能。Fewer等[55]的研究表明重組事件的發(fā)生和斷點(diǎn)都僅限于腺苷酸化域，mcyB1和mcyC中腺苷酸化域的交換和替換并沒(méi)有伴隨縮合域的轉(zhuǎn)移，不相容的腺苷酸化域和縮合域可能影響多肽組裝過(guò)程尤其是縮合反應(yīng)的順序和時(shí)間，甚至導(dǎo)致菌株無(wú)法通過(guò)NRPS合成所需肽段。

3.3 基因突變的影響

當(dāng)mcy基因中用于修飾氨基酸的其他結(jié)構(gòu)域（例如差向異構(gòu)、雜環(huán)化、氧化、還原、甲?；图谆龋┌l(fā)生位點(diǎn)突變、缺失和插入導(dǎo)致這些結(jié)構(gòu)域激活或失活時(shí)，也會(huì)形成不同的MCs異構(gòu)體[54]。Nishizawa等[61]從銅綠微囊藻K-139的染色體中分離出mcy基因簇，分析發(fā)現(xiàn)mcyA1的N-甲基轉(zhuǎn)移酶（NMT）結(jié)構(gòu)域被不含NMT的腺苷酸化結(jié)構(gòu)域取代時(shí)，該功能域失活產(chǎn)生了7號(hào)位去甲基的MC-LR異構(gòu)體。

4 環(huán)境因子對(duì)MCs異構(gòu)體的調(diào)控（Regulation of environmental factor to microcystin congeners）

次生代謝物是有機(jī)體在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展出的，只在生命過(guò)程中的某一階段產(chǎn)生。MCs作為一種次生代謝物，從生物學(xué)功能來(lái)看，盡管它不是藻類(lèi)生長(zhǎng)所必需的，卻是它對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，可能與產(chǎn)毒藻抗逆性、信號(hào)傳導(dǎo)和適應(yīng)性調(diào)節(jié)有關(guān)。已有的研究表明，光照、溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽濃度等環(huán)境因素都可能影響MCs及其異構(gòu)體的含量，因此MCs的合成、代謝除了由遺傳特性決定外，還受環(huán)境條件的影響[62-65]。

4.1 光照的影響

光照是藍(lán)藻進(jìn)行光合作用的必要條件，光照時(shí)間和強(qiáng)度顯著影響藻類(lèi)的生長(zhǎng)和代謝[66-67]。Deblois和Juneau[13]通過(guò)對(duì)比4種產(chǎn)毒和無(wú)毒菌株對(duì)光照的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒菌株在波動(dòng)的光照環(huán)境中對(duì)高光強(qiáng)具有更高的耐受性，低光強(qiáng)/高光強(qiáng)循環(huán)誘導(dǎo)使產(chǎn)毒菌株生物量增加259%，無(wú)毒菌株減少22%，因此光照時(shí)間和強(qiáng)度通過(guò)影響藻類(lèi)的生長(zhǎng)、代謝和產(chǎn)毒/無(wú)毒菌株競(jìng)爭(zhēng)，可能間接影響MCs的合成和釋放。從分子層面，光照強(qiáng)度通過(guò)影響產(chǎn)毒基因mcyA[68-69]、mcyB[70-71]和mcyD[70]的表達(dá)直接調(diào)控MCs的合成，對(duì)其機(jī)制的解釋主要有以下幾種觀點(diǎn)：（1）氧化應(yīng)激。當(dāng)光強(qiáng)度從7.53 μmol·m-2·s-1增加到45.15 μmol·m-2·s-1時(shí)，強(qiáng)光下光捕獲復(fù)合物的飽和可能導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生，mcyB轉(zhuǎn)錄物增加，從而促進(jìn)MCs的合成[71]。（2）mcy基因轉(zhuǎn)錄的光依賴性。根據(jù)光照條件的不同，微囊藻能夠選擇性啟用不同的mcy轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。銅綠微囊藻PCC7806菌株在31 μmol·m-2·s-1的恒定光下生長(zhǎng)時(shí)，mcyA和mcyD之間中央啟動(dòng)子區(qū)域的2個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)都能夠被檢測(cè)到；弱光條件（16 μmol·m-2·s-1）下，啟動(dòng)的mcyA和mcyD的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于ORF起始密碼子上游254 bp和143 bp，產(chǎn)生較長(zhǎng)的mcyABC轉(zhuǎn)錄物；在強(qiáng)光條件（68 μmol·m-2·s-1）下，啟動(dòng)的mcyA和mcyD的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于ORF起始密碼子上游206 bp和342 bp，產(chǎn)生較長(zhǎng)的mcyD-J轉(zhuǎn)錄物[24]。（3）通過(guò)光質(zhì)直接調(diào)節(jié)或通過(guò)另一種調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)。Kaebernick等[70]研究發(fā)現(xiàn)，紅光下銅綠微囊藻的mcyB和mcyD被上調(diào)，首次證明光質(zhì)會(huì)對(duì)mcy基因產(chǎn)生影響。另外，他們發(fā)現(xiàn)mcy轉(zhuǎn)錄物的首次增加發(fā)生在弱光條件下，第2次增加發(fā)生在31～68 μmol·m-2·s-1之間，與低光強(qiáng)（2～40 μmol·m-2·s-1）時(shí)MCs含量的變化一致，因此他們認(rèn)為影響銅綠微囊藻的光強(qiáng)度<40 μmol·m-2·s-1，同時(shí)提出假設(shè)：MCs在中低等光強(qiáng)度下合成，但僅在達(dá)到某個(gè)光照閾值強(qiáng)度時(shí)才釋放。

迄今為止，關(guān)于光照對(duì)MCs異構(gòu)體影響的研究較少，且已有研究的結(jié)論各不相同。合成MC-LR與MC-D-（Asp3）-LR銅綠微囊藻PCC7806菌株與合成MC-RR、MC-LR和MC-YR的銅綠微囊藻NIES 843菌株在不同光照條件下各MCs異構(gòu)體含量占比變化差異不大[60]。但光強(qiáng)能極大影響阿氏浮絲藻產(chǎn)MCs異構(gòu)體的情況，強(qiáng)光能夠上調(diào)其mcy的表達(dá)，[Asp3]MC-RR的含量隨光強(qiáng)增加而減少，而[Asp3]MC-LR的含量則隨光強(qiáng)增加而增加[72]。高光強(qiáng)下[Asp3]MC-LR與RR濃度的比值增加了4倍[73]。研究者因此提出了2種假設(shè)：（1）光照通過(guò)改變結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)直接影響異構(gòu)體合成。mcyB第一個(gè)模塊的底物結(jié)合位點(diǎn)的因光照不同發(fā)生構(gòu)象變化導(dǎo)致模塊的底物特異性的發(fā)生變化，引入不同氨基酸進(jìn)行肽鏈的延長(zhǎng)；（2）通過(guò)影響細(xì)胞代謝間接影響異構(gòu)體合成。不同的光照條件引起了細(xì)胞內(nèi)可利用的氨基酸組成的變化，高光照強(qiáng)度下增加光合作用可以提高細(xì)胞的C/N比，相對(duì)較少的氮可用于合成富氮的精氨酸分子，導(dǎo)致微囊藻毒素合成從[Asp3]MC-RR轉(zhuǎn)移到[Asp3]MC-LR[72]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，高光強(qiáng)能夠促進(jìn)阿氏浮絲藻毒素的產(chǎn)生，卻不能改變異構(gòu)體的組成[74]。因此，針對(duì)光強(qiáng)對(duì)MCs異構(gòu)體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4.2 溫度的影響

自然水體中，MCs的濃度與產(chǎn)毒藻種類(lèi)與生物量密切相關(guān)。溫度作為影響藍(lán)藻生長(zhǎng)、代謝的重要環(huán)境因子，也能影響MCs的產(chǎn)生。多項(xiàng)野外調(diào)查結(jié)果表明，在中國(guó)太湖[75]、巢湖[12]、鄱陽(yáng)湖[76]和韓國(guó)大韓水庫(kù)[77]，水溫與產(chǎn)毒微囊藻生物量、細(xì)胞內(nèi)MCs濃度呈正相關(guān)。值得注意的是，室內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究普遍表明MCs的最高釋放溫度要高于最佳生長(zhǎng)溫度。銅綠微囊藻最佳生長(zhǎng)溫度為25 ℃，但MC-LR釋放的最佳溫度為28 ℃[78]；阿氏浮絲藻的最佳生長(zhǎng)溫度為19 ℃，但MCs釋放的最佳溫度在20～25 ℃[79]。研究者們認(rèn)為這可能是由溫度引起的氧化應(yīng)激所造成，MCs釋放對(duì)溫度響應(yīng)機(jī)制可以防止不利生長(zhǎng)條件對(duì)細(xì)胞的損害。Scherer等[80]發(fā)現(xiàn)20～30 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，銅綠微囊藻上調(diào)mcyB和mcyD基因，這說(shuō)明產(chǎn)毒基因的表達(dá)受溫度影響，為溫度對(duì)MCs的調(diào)控進(jìn)一步提供了分子水平上的證據(jù)。

然而，溫度對(duì)MCs異構(gòu)體的影響至今未有一致的結(jié)論。余麗等[12]發(fā)現(xiàn)自然水域中水溫低于25 ℃時(shí)有利于藻類(lèi)合成MC-LR，高于25 ℃時(shí)有利于合成MC-RR，但Xie等[81]在美國(guó)密歇根州中放置的浮游植物透析袋實(shí)驗(yàn)表明水溫不是造成MCs異構(gòu)體組成差異的原因。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，銅綠微囊藻在20 ℃時(shí)更多合成MC-RR（占83.75%），在28 ℃時(shí)更多合成MC-LR（占95.27%）[82]；當(dāng)溫度從28 ℃升高至36 ℃時(shí)，MC-LR與MC-LA濃度比值增加[83]；但Peng等[84]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度從18 ℃升高至30 ℃時(shí)，MC-LR的占比下降，MC-RR和MC-YR的占比增加，但亮氨酸與精氨酸濃度的比值，酪氨酸與精氨酸濃度的比值均未改變；魚(yú)害微囊藻（Microcystisichthyoblabe）隨溫度升高，其產(chǎn)生的MC-LR和MC-RR的濃度比值增加，且比值>1，表明高溫可能導(dǎo)致毒性較強(qiáng)的MCs異構(gòu)體（如MC-LR）占主導(dǎo)地位[85]。以上研究結(jié)果的差異可能是由不同物種和菌株對(duì)溫度的特異性響應(yīng)造成的，也可能是由產(chǎn)毒藻類(lèi)群落結(jié)構(gòu)差異造成，但細(xì)胞因溫度升高而上調(diào)藻細(xì)胞MCs合成以及MCs異構(gòu)體占比變化的原因目前尚不清楚。

4.3 營(yíng)養(yǎng)元素的影響

氮是藻類(lèi)生長(zhǎng)的必需元素，在藻細(xì)胞物質(zhì)能量代謝過(guò)程中起重要作用[86]。氮濃度1 mg·L-1時(shí)，銅綠微囊藻生長(zhǎng)受到抑制，隨著氮濃度增加，銅綠微囊藻生物量和MC-LR產(chǎn)生量也顯著增加[92]。一方面，產(chǎn)毒藻生物量的增加意味著藻類(lèi)群體具備更大產(chǎn)毒潛力；另一方面，合成MCs所用到的氨基酸均是由不同形式的氮通過(guò)一些轉(zhuǎn)化同化而成，氮濃度變化可能直接調(diào)控MCs的合成過(guò)程[93]。一些研究通過(guò)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)氮濃度影響mcy基因的表達(dá)，氮限制條件下銅綠微囊藻中參與MCs合成的酶基因被下調(diào)，而涉及剪裁和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因被上調(diào)[94-96]，但在氮脅迫下，所有涉及MCs合成的基因均被上調(diào)[97]，為氮對(duì)MCs的調(diào)控提供了直接證據(jù)。值得注意的是，mcy基因簇中的啟動(dòng)子能與響應(yīng)氮代謝環(huán)境和氧化還原變化的關(guān)鍵基因全局氮調(diào)控子（ntcA）結(jié)合，藻細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)氮同化基因和mcy基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)響應(yīng)氮濃度變化[94, 98-99]（圖3）。當(dāng)細(xì)胞處于低氮水平時(shí)，pipX與磷酸化的PII蛋白分離并與ntcA-2-OG相互作用，從而影響氮同化相關(guān)基因的表達(dá)，伴隨細(xì)胞內(nèi)2-OG含量升高，進(jìn)一步增加ntcA和PmcyA/D啟動(dòng)子的親和力[100]。已有研究顯示，MCs異構(gòu)體組成受氮源可利用性差異的影響較大。由于不同氨基酸所含氮原子數(shù)目不同（如亮氨酸含有1個(gè)氮原子而精氨酸含有4個(gè)氮原子），藻細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)氮代謝過(guò)程，改變細(xì)胞內(nèi)氨基酸組成和含量，進(jìn)而影響MCs異構(gòu)體的相對(duì)豐度。Qian等[101]通過(guò)同位素標(biāo)記方法研究發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞對(duì)水中不同氮源利用的順序是不同的，在氮的脅迫下MC-LY會(huì)顯著增加。在培養(yǎng)基中添加亮氨酸時(shí)，阿氏浮絲藻產(chǎn)生的[Asp3]MC-LR/RR比率明顯增加；添加精氨酸時(shí)，2種異構(gòu)體的比率減少[73]；而在長(zhǎng)期缺氮的條件下，突然的氮富集會(huì)使阿氏浮絲藻細(xì)胞中的氮碳比、天冬氨酸和精氨酸迅速增加，[Asp3]MC-RR在氮脈沖后強(qiáng)烈增加，而[Asp3]MC-LR增加較少[102]。隨著培養(yǎng)基中硝酸鹽的消耗，含精氨酸的MCs異構(gòu)體的相對(duì)豐度會(huì)降低[103]。

鋅、鐵是藻細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中所必需的微量元素[104]。已有研究表明，水體中鋅、鐵的濃度不僅影響藻類(lèi)的生長(zhǎng)也可能影響其產(chǎn)毒[105-106]。過(guò)高濃度的鋅會(huì)影響藻類(lèi)的光合作用、滲透平衡，甚至造成藻細(xì)胞的裂解死亡，這可能導(dǎo)致產(chǎn)毒藻胞內(nèi)MCs隨細(xì)胞破裂而釋放到水環(huán)境中[106]。鐵離子可通過(guò)Fur與mcy啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，在mcy基因表達(dá)層面直接調(diào)節(jié)MC-LR的合成[105]，伴隨鐵離子濃度下降，銅綠微囊藻中mcyD基因顯著上調(diào)[107]。當(dāng)鐵濃度<2.5 μmol·L-1時(shí)，藻類(lèi)生長(zhǎng)受到抑制，但MCs增加了20%～40%[108]。

參與細(xì)胞功能（例如膜運(yùn)輸、pH調(diào)節(jié)、酶活性和基因表達(dá)等）的其他營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的研究相對(duì)較少。Sandrini等[109]發(fā)現(xiàn)微囊藻對(duì)低濃度的鉀離子比對(duì)鈉、鋰等其他堿金屬陽(yáng)離子更加敏感。12 mmol·L-1的鉀離子對(duì)銅綠微囊藻PCC 7005和NIES-843的生長(zhǎng)速率影響極大，但PCC 7806及其無(wú)毒突變PCC 7806均不受其影響。由于該研究未分析它們產(chǎn)生的MCs含量和mcy基因表達(dá)的相關(guān)情況，因此無(wú)法判斷鉀離子對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)毒能力的影響。

圖3 產(chǎn)毒藻細(xì)胞中可能涉及的對(duì)MCs合成的調(diào)控機(jī)制（改自文獻(xiàn)[97, 103]）Fig. 3 Schematic diagram of potential pathways involved in the regulation of MCs biosynthesis in a microcystin-producing cyanobacterium （Modified from literature [97, 103]）

5 展望（Prospects）

經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，MCs的相關(guān)研究已經(jīng)獲得了很多重要成果，但大多是原位調(diào)查數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，深入研究MCs異構(gòu)體調(diào)控機(jī)理的較少。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)由于選擇的產(chǎn)毒菌株不同，MCs異構(gòu)體對(duì)環(huán)境因子的影響機(jī)制也存在較大爭(zhēng)議。未來(lái)應(yīng)加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的研究。

（1）進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)微囊藻產(chǎn)毒驅(qū)動(dòng)機(jī)制的研究。目前環(huán)境因子與MCs總量和異構(gòu)體組成相關(guān)性研究存在結(jié)論不一致的現(xiàn)象，微囊藻對(duì)特定環(huán)境條件的分子反應(yīng)尤其是特定溫度的反應(yīng)機(jī)制在很大程度上是未知的，有待繼續(xù)深入研究。

（2）結(jié)合MCs的生物學(xué)功能研究其調(diào)控機(jī)制。目前不同異構(gòu)體在藻細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和適應(yīng)性調(diào)節(jié)的過(guò)程中起到的功能是否有所區(qū)別尚不清楚，MCs異構(gòu)體含量變化是否會(huì)引起產(chǎn)毒藻內(nèi)結(jié)合蛋白質(zhì)靶標(biāo)的構(gòu)象變化和結(jié)合力變化，以促進(jìn)或抑制蛋白質(zhì)降解來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境變化還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

（3）加強(qiáng)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。環(huán)境脅迫下產(chǎn)毒藻細(xì)胞可能出現(xiàn)養(yǎng)分獲取、光合作用和MCs合成釋放等的交叉調(diào)節(jié)反應(yīng)，傳統(tǒng)技術(shù)往往難以捕捉其關(guān)鍵變化，而組學(xué)和測(cè)序技術(shù)能夠在分子層面更加整體和精確地認(rèn)識(shí)環(huán)境變化引起的藻細(xì)胞內(nèi)各種表達(dá)水平。

（4）建立并完善以MCs異構(gòu)體為區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)的微囊藻分類(lèi)。目前尚未有區(qū)分并量化產(chǎn)不同MCs異構(gòu)型的微囊藻豐度的方法，存在一定的技術(shù)壁壘。因此，有必要加快識(shí)別不同亞型的微囊藻的分子生物學(xué)方法（如重測(cè)序、單細(xì)胞測(cè)序等技術(shù)）的建立和完善，為揭示產(chǎn)毒菌株細(xì)胞個(gè)體、群體差異，探究產(chǎn)毒細(xì)胞個(gè)體和群落產(chǎn)毒的規(guī)律提供技術(shù)手段。

（5）加強(qiáng)產(chǎn)生MCs藻類(lèi)的系統(tǒng)性研究。魚(yú)害微囊藻、阿氏浮絲藻等其他藻種以及野外混合藻的產(chǎn)毒影響與單藻源微囊藻的結(jié)果相差迥異，且缺少對(duì)這些藻種系統(tǒng)性的研究，對(duì)于一些特定環(huán)境下的產(chǎn)毒規(guī)律值得進(jìn)一步挖掘。

（6）加強(qiáng)對(duì)MCs構(gòu)效關(guān)系的研究。MCs具有結(jié)構(gòu)多樣性，異構(gòu)體之間的結(jié)構(gòu)差異使其具有不同的活性（親疏水性、毒性效應(yīng)等）。由于MCs不同位點(diǎn)的取代復(fù)雜性，目前異構(gòu)體構(gòu)效關(guān)系的研究并不完善，亟需進(jìn)一步加強(qiáng)，這對(duì)全面了解異構(gòu)體環(huán)境歸趨、體內(nèi)代謝、毒性效應(yīng)及其降解特性等方面均有重要意義。