建立2D-HPLC同時(shí)檢測(cè)鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的方法

張 燕 ，張 鎖 ，魏 瑋 ，蘇艷麗 *，丁 靖 ，趙彩萍 ，戴尊孝 ，王 慧

（1.西安市精神衛(wèi)生中心，陜西 西安 710100；2.西安市藥學(xué)（精神衛(wèi)生）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710100*通信作者：蘇艷麗，E-mail：645403932@qq.com）

鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿和異去氫鉤藤堿等多種生物堿均來(lái)源于常用的中草藥鉤藤［1-4］，具有抗焦慮、降壓、鎮(zhèn)靜、抗驚厥和神經(jīng)元保護(hù)等藥理活性，尤其對(duì)精神狀態(tài)的改善具有重要價(jià)值。鉤藤堿能抑制外周血管收縮，使血管阻力降低，血壓下降，也具有抗血小板聚集和抗血栓的作用［5-7］。異鉤藤堿具有持續(xù)的降壓作用，擴(kuò)張血管，減慢心率，對(duì)電位依賴(lài)性鈣通道具有阻滯作用［8-9］。去氫鉤藤堿有抑制呼吸中樞和離體腸管的作用，還能改善紅細(xì)胞的變形能力，抑制不良因素對(duì)紅細(xì)胞變形能力的損害。異去氫鉤藤堿具有降壓、鎮(zhèn)靜、抗驚厥和神經(jīng)元保護(hù)等藥理活性［7-9］。鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿以及異去氫鉤藤堿對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和心腦血管系統(tǒng)具有廣泛的有益作用［10-14］。鉤藤是我院抗精神分裂癥組方消幻湯（清幻靈、清幻顆粒）［15］中的一味藥材，基于鉤藤藥用價(jià)值的研究，需要對(duì)其有效藥用成分（前述四種鉤藤生物堿）的含量進(jìn)行質(zhì)量控制。目前報(bào)道的四種鉤藤生物堿的高效液相色譜法（HPLC）和液質(zhì)聯(lián)用法（HPLC-MS）基于梯度洗脫，分析時(shí)間較長(zhǎng)［16-17］，效率較低，且HPLC-MS和飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF-MS）設(shè)備昂貴［18-19］。故本研究擬建立二維高效液相色譜法（2D-HPLC），同時(shí)測(cè)定鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿四種鉤藤生物堿含量，為鉤藤藥材的質(zhì)量控制提供新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

FLC 2701全自動(dòng)二維液相色譜系統(tǒng)（湖南德米特儀器有限公司），HC-3018R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），吉爾森移液槍?zhuān)獱柹萍加邢薰荆?，萬(wàn)分之一分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司），XW-80A漩渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司），超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），Milli-Q Academic超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥與試劑

分析級(jí)甲醇（美國(guó)安可化學(xué)公司），BPI-1（LOT：20210412-1）、API-1（LOT：20210413-1）、CAA-1D（LOT：20210415-1）、MPI-1（LOT：20210310-1）、OPI（LOT：20210427-1），均購(gòu)自湖南德米特儀器有限公司，鉤藤堿對(duì)照品（LOT：C22M11S113789）、異鉤藤堿對(duì)照品（LOT：P08A10S85061）、去氫鉤藤堿對(duì)照品（LOT：MUST-12101703）、異去氫鉤藤堿對(duì)照品（LOT：MUST-17092903）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，鉤藤藥材（西安市長(zhǎng)安大藥房，產(chǎn)地廣西）。

1.3 色譜條件

Aston SC2（3.5 mm×25 mm，5 μm）一維色譜柱，流動(dòng)相為CAA-1；Aston SH C18（3.5 mm×10 mm，5 μm）中間色譜柱；Aston SCB（4.6 mm×125 mm，5 μm）分析色譜柱，1號(hào)泵流動(dòng)相為三元流動(dòng)相混合［O為OPI，A 為 BPI-1，B 為 MPI-1，A∶B∶O=45∶14∶41（v∶v∶v）］，2號(hào)泵流動(dòng)相為水，3號(hào)泵流動(dòng)相為CAA-1D；流速1.0 mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm和245 nm；進(jìn)樣量500 μL。

1.4 溶液的制備

1.4.1 儲(chǔ)備液配置

精密稱(chēng)取去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿的對(duì)照品2.2、2.2、2.2、2.0 mg，甲醇超聲溶解并定容稀釋至10 mL，制得上述鉤藤生物堿對(duì)照品單標(biāo)儲(chǔ)備液濃度分別為220.0、220.0、220.0、200.0 μg/mL，置于-20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 對(duì)照品溶液配制

精密移取去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿對(duì)照品溶液，用甲醇將其稀釋至濃度為11 000.00、2 750.00、687.50、171.88、42.97、10.74 ng/mL 的對(duì)照品溶液，精密移取鉤藤堿對(duì)照品并用甲醇將其稀釋至濃度為 10 000.00、2 500.00、625.00、156.25、39.06、9.77 ng/mL的對(duì)照品溶液。

1.4.3 藥材供試品溶液制備

稱(chēng)取鉤藤藥材10 g置于容量為1 000 mL的燒杯中，加水至300 mL刻度線(xiàn)，加熱至微沸后煎煮30 min，將藥液過(guò)濾至另一燒杯，再次加水200 mL，加熱至微沸后煎煮30 min獲得藥液，過(guò)濾后，合并兩次濾液，置于4℃冰箱密封保存。

1.5 分析性能評(píng)價(jià)

1.5.1 專(zhuān)屬性

按照分析條件，分析時(shí)間9.5 min，將制備的供試品溶液進(jìn)樣，得到目標(biāo)物色譜保留時(shí)間。各峰間無(wú)干擾則專(zhuān)屬性良好。

1.5.2 線(xiàn)性范圍

分別取系列對(duì)照品溶液500 μL，在色譜和質(zhì)譜條件下依次進(jìn)樣。計(jì)算被測(cè)物質(zhì)在不同濃度下峰面積，與濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)，并以信噪比（S/N）=10為定量下限。

1.5.3 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

取1份四種鉤藤生物堿對(duì)照品混合溶液，在“1.3”項(xiàng)條件下進(jìn)行峰面積測(cè)定，通過(guò)連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行精密度試驗(yàn)。取1份四種鉤藤生物堿對(duì)照品混合溶液，分別于0、2、6、10、12和24 h進(jìn)樣進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。取5份四種鉤藤生物堿對(duì)照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。

1.5.4 方法回收率試驗(yàn)

取1份四種鉤藤生物堿對(duì)照品混合溶液，以相同體積分別進(jìn)行“分析色譜柱”以及在“1.3”項(xiàng)條件下分析，各進(jìn)樣6次，計(jì)算方法回收率。

1.5.5 含量測(cè)定

分別3次吸取藥材供試品溶液各1 000 μL，17 757×g離心10 min，進(jìn)樣500 μL，檢測(cè)并計(jì)算四種鉤藤生物堿的平均折合生藥量。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)處理采用Lab Solution工作站，采用Excel進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以（±s）表示，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 專(zhuān)屬性

鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿保留時(shí)間分別為9.08、8.31、7.23、7.91 min。四種鉤藤生物堿的專(zhuān)屬性色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 四種鉤藤生物堿的專(zhuān)屬性色譜圖Figure 1 Chromatogram of specific results of four Uncaria alkaloids

2.2 定量線(xiàn)性范圍

四種鉤藤生物堿回歸方程的相關(guān)系數(shù)均＞0.99，其定量線(xiàn)性范圍、檢測(cè)下限及定量下限見(jiàn)表1。

表1 四種鉤藤生物堿的回歸方程、線(xiàn)性范圍、檢測(cè)下限及定量下限Table 1 Regression equation，linear range，lower limit of detection and lower limit of quantification for four Uncaria alkaloids

2.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性

去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿四種生物堿精密度RSD均＜4%，穩(wěn)定性RSD均＜3%，重復(fù)性RSD均＜3%。見(jiàn)表2。

表2 四種鉤藤生物堿的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性Table 2 Precision，stability and repeatability test of four Uncaria alkaloids

2.4 方法回收率

鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的方法回收率分別為95.75%、93.63%、100.39%、101.38%，均在（100%±10%）范圍內(nèi)。見(jiàn)表3。

表3 四種鉤藤生物堿的方法回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Test results of recovery rate of four Uncaria alkaloids

2.5 含量測(cè)定

鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿折合生藥量分別為（35.00±0.35）、（26.00±0.26）、（41.00±0.40）、（61.00±0.64）μg/g。見(jiàn)表4。

表4 四種鉤藤生物堿的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 4 Determination results of four Uncaria alkaloids（n=3）

3 討 論

在四種鉤藤生物堿2D-HPLC建立時(shí)，可能存在被分析物質(zhì)保留時(shí)間過(guò)短的問(wèn)題，會(huì)導(dǎo)致分析的物質(zhì)成分丟失，從而出現(xiàn)多個(gè)峰以及峰面積不足的問(wèn)題。因此，本研究通過(guò)延長(zhǎng)萃取時(shí)間來(lái)改善上述問(wèn)題。此外，相關(guān)文獻(xiàn)表明［20-21］，流動(dòng)相的酸堿度也會(huì)對(duì)峰形和出峰時(shí)間造成影響。本研究中，當(dāng)流動(dòng)相A∶B的比例為50∶18時(shí)，異鉤藤堿和異去氫鉤藤堿兩峰合并，出峰時(shí)間會(huì)后延；當(dāng)A∶B的比例為42∶29時(shí)，異去氫鉤藤堿與異鉤藤堿兩峰合并，時(shí)間后延約0.5 min；當(dāng)A∶B的比例為45∶10時(shí)，去氫鉤藤堿與異去氫鉤藤堿分離度較好，第三個(gè)峰即異鉤藤堿后移且與第四個(gè)峰鉤藤堿合并；當(dāng)A∶B的比例為45∶14時(shí)，得到的四種鉤藤生物堿分離度都相對(duì)較好，最終確定方法中A∶B的比例為45∶14，如圖1所示。此外，本研究選用254 nm、245 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)是綜合了四種鉤藤生物堿的檢測(cè)波長(zhǎng)，以確保分析基線(xiàn)平穩(wěn)，信號(hào)靈敏。其中，254 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下總峰面積較大，更為靈敏，故以254 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)及定量波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)建立的2D-HPLC中，四種鉤藤生物堿的出峰時(shí)間為5～9 min，相比于超高效液相色譜（UPLC）和HPLC出峰時(shí)間大多為10～30 min［22-23］，該方法分析更快，分離度較好。與質(zhì)譜相比，2D-HPLC所需的設(shè)備成本更低，檢測(cè)定量更穩(wěn)定，適用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的長(zhǎng)期應(yīng)用，可能是一種快速、高效、低廉的對(duì)四種鉤藤生物堿進(jìn)行質(zhì)量控制的方法。

對(duì)四種鉤藤生物堿的含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，選用水煎法提取有效物質(zhì)。水煎法是多數(shù)中藥材最早使用的一種簡(jiǎn)易浸出方法，也是制備浸出制劑最常用的方法，但煎煮時(shí)間以及不同產(chǎn)地的鉤藤藥材對(duì)煎煮法提取的四種鉤藤生物堿含量均有影響。本研究中，對(duì)鉤藤藥材供試品進(jìn)行含量檢測(cè)所得的結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的鉤藤生物堿含量接近［24-25］，表明該分析方法可以對(duì)鉤藤藥材水煎法及其派生的復(fù)方制劑中鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿進(jìn)行質(zhì)量控制。

本實(shí)驗(yàn)建立2D-HPLC測(cè)定鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿四種生物堿含量，為鉤藤生物堿成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了快速、高效的分析方法。本研究雖然對(duì)藥材進(jìn)行了含量測(cè)定，但未對(duì)方劑中的四種生物堿進(jìn)行追蹤，后期將應(yīng)用2DHPLC對(duì)抗精神分裂癥清幻顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制，并進(jìn)一步監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)藥物濃度，讓該分析方法更具有實(shí)踐意義。