三化湯治療缺血性腦卒中的機制探討

王娟，王廷華，白雪

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 四川瀘州 646000 2 四川大學(xué)華西醫(yī)院 四川成都 610041

腦卒中是世界上最普遍的血管疾病，具有較高的發(fā)病率、致殘率、病死率，給社會、政府及家庭帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。腦卒中分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，前者是由大腦內(nèi)部血管破裂引起的，缺血性中風(fēng)是由血管堵塞引起的，這兩種情況都會導(dǎo)致大腦局部組織缺氧。雖然這兩種中風(fēng)都很嚴(yán)重，很普遍，但研究表明，缺血性中風(fēng)更常見，占中風(fēng)總數(shù)的87%[1]。血腦屏障（blood brain barrier，BBB）是大腦和外周循環(huán)之間的重要屏障，通過嚴(yán)密調(diào)節(jié)物質(zhì)交換在維持中樞系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）可引起B(yǎng)BB損傷及破壞，進一步促進缺血性腦損傷的發(fā)展[2-3]。研究表明，缺血性腦卒中患者血腦屏障的破壞可能與TJ蛋白破壞、MMPs、AQP-4 基因和蛋白、VEGF的表達上調(diào)、免疫炎癥級聯(lián)反應(yīng)被激活，大量炎性細(xì)胞因子和趨化因子釋放，破壞血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞，導(dǎo)致血腦屏障的損傷[4]。

缺血性腦卒中屬于祖國醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，總結(jié)中風(fēng)發(fā)病機理，不外乎氣機逆亂、腦脈痹阻、絡(luò)破血溢、損脈及腦[5]。金代醫(yī)家劉完素提出“腦之玄府理論”，劉完素認(rèn)為五官、四肢百骸、意識等功能的正常皆依賴于玄府開通、氣機升降出入的通利，若玄府密閉則會導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，腦之玄府閉塞是缺血性中風(fēng)的發(fā)病關(guān)鍵，故治療中風(fēng)注重宣通玄府[6]。現(xiàn)代研究表明玄府理論與血腦屏障 （bIood brain barrier，BBB）在結(jié)構(gòu)和功能方面存在著許多共性內(nèi)涵。三化湯主要由大黃、厚樸、羌活、枳實四味藥物組成，是開通玄府治療中風(fēng)病之名方，具有宣行氣血、通腑開結(jié)、調(diào)暢氣機、開通玄府的作用[7]。本文主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的知識，探究三化湯開通玄府法調(diào)節(jié)血腦屏障治療缺血性腦卒中的作用機制。

材料與方法

1 三化湯活性成分和成分靶點的收集、轉(zhuǎn)換

在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology：TCMSP）（https：//tcmspw.com/index.php）以“大黃、厚樸、羌活、枳實”成分為關(guān)鍵詞搜索各成分的所有化學(xué)成分，以吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數(shù)中的OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥0.3及BBB＜0.3為篩選條件，得到三化湯主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周的化學(xué)活性成分。并應(yīng)用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫檢索三化湯各單味藥化學(xué)成分對應(yīng)的靶點并加以整合、去重、取并集后，即為各成分靶點庫。

2 成分靶點蛋白轉(zhuǎn)化為基因名稱

在UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將搜詢得到的靶點蛋白名稱按順序逐一鍵入搜索框中搜索得到其對應(yīng)基因名稱（Gene names）。

3 缺血性腦卒中靶點獲取

應(yīng)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）與 DisGeNET（https：//www.disgenet.org/），在 搜索框中輸入關(guān)鍵詞：“ischemic stroke、 Cerebral arterial thrombosis、 Cerebral arterial thrombosis、 stroke 、cerebral infarction ”進行搜索，挖掘缺血性腦卒中相關(guān)靶點。

4 “活性成分·潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

按照BBB≥0.3及BBB＜0.3將篩選出的三化湯化學(xué)活性成分對應(yīng)的靶點和疾病靶點應(yīng)用Venny2.1數(shù) 據(jù) 庫（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得出交集靶點。

5 關(guān)鍵靶點蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將共同潛在靶點導(dǎo)入 STRING11.0 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（設(shè)置條件：蛋白質(zhì)種類 “homo sapiens（人類）”，作用閾值 “medium confidence（0.400）”）。通過Cytoscape（Version 3.7.1）軟件，進行可視化網(wǎng)絡(luò)處理，得到三化湯活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。以同樣的方法得到缺血性腦卒中的疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。應(yīng)用Cytoscape（Version 3.7.1）軟件中的merge設(shè)置，將三化湯治療缺血性腦卒中疾病關(guān)鍵靶點可視圖像，對這些重要靶點進行分析。

6 GO分析和KEGG通路分析

通過 Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）數(shù)據(jù)庫，對靶點生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）進行GO富集分析和KEGG代謝通路富集分析，并采用線上繪圖工具Omic Share Tool（https：//www.omicshare.com/tools/index.php/）將富集結(jié)果可視化。

7 分子對接驗證

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得三化湯中活性成分的PubChem號，輸入PubChem在線數(shù)據(jù)庫平臺（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索出各活性成分小分子配體3D結(jié)構(gòu)，并使用Openbable軟件將格式轉(zhuǎn)化為Mol2格式，導(dǎo)入AutoDock tools（1.5.6）進行加氫離子，計算電荷數(shù)目，合并非極性氫后保存為pdbqt格式；在PDB在線數(shù)據(jù)庫平臺（https：//www1.rcsb.org/）中搜索出藥物核心靶點蛋白受體，通過Pymol軟件去除蛋白受體結(jié)構(gòu)的溶劑和水分子，將其導(dǎo)入Auto Dock Tools 1.5.6軟件進行同樣的處理，根據(jù)每個受體蛋白結(jié)構(gòu)的不同，定義不同的Grid Box盒子；運用分子對接技術(shù)，對其活性成分的受體與配體進行匹配，分析其結(jié)合能力，選取每個藥物配體結(jié)合能最低的結(jié)合能，保存文件，將其導(dǎo)入Pymol軟件進行對接結(jié)構(gòu)可視化。

結(jié)果

1 三化湯成分的篩選及其成分靶點

OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥0.3的藥物成分共12種（見表1），其中大黃3種，厚樸1種，羌活8種，枳實2種；其對應(yīng)的靶點共131個，其中大黃43個，厚樸26個，羌活46個，枳實17個，通過Unipot數(shù)據(jù)庫和perl軟件對蛋白名稱進行標(biāo)準(zhǔn)注釋化并刪除重復(fù)靶點，篩選得到的靶點共59個。

表1 三化湯主要的潛在活性成分（BBB≥0.3）

OB≥30%、DL≥0.18、BBB＜0.3的化學(xué)成分30種（見表2），其中大黃7種，厚樸1種，羌活5種，枳實17種；其對應(yīng)的靶點共185個，其中大黃41個，厚樸7個，羌活17個，枳實120個，刪除重復(fù)靶點后最終得到134個靶點。其中大黃的Mutatochrome（β胡蘿卜素氧化物）、Sennoside E（番瀉苷E）、Sennoside D（番瀉苷D），羌活的coumarin，glycoside（香豆素糖苷），枳實的Obacunone（黃柏酮）無法在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫查詢到對應(yīng)靶點，這些成分查閱文獻單獨分析：β胡蘿卜素是一種重要的天然色素，對人體健康十分有益。它廣泛存在于蔬菜和水果中。三種主要功能是抗氧化作用、細(xì)胞間隙連接相關(guān)功能和免疫相關(guān)功能。由于它的多種功能，β -胡蘿卜素被認(rèn)為可以預(yù)防和治療許多慢性病。胃癌是其可治療的重要疾病之一[8]。番瀉苷（sennoside）包括番瀉苷 A、B、C、D、E、F、G 等，具有瀉下、抗菌活性、保護神經(jīng)細(xì)胞等功能，對大黃進行炮制的過程中無論是清蒸、酒蒸還是酒炙，番瀉苷含量均有所下降，番瀉苷D、E含量更少，且研究甚少[9]。香豆素糖苷是合成香料、醫(yī)藥、染料及 農(nóng)藥的重要中間體，香豆素還具有植物生長調(diào)節(jié)，光敏，抗菌、抗病毒，松弛平滑肌，抗血凝等生物活性[10]。黃柏酮具有多種藥理作用，其中對腫瘤的治療作用倍受關(guān)注，研究表明，黃柏酮在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥中具有抑制細(xì)胞增殖和促進細(xì)胞凋亡的作用，但它對血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移的影響仍不清楚[11]。

表2 三化湯主要的潛在活性成分（BBB＜0.3）

利用 Cytoscape3.7.2繪 制“藥 物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），其中BBB≥0.3共有75 個節(jié)點、154 條邊（圖左），根據(jù)Degree值及靶點數(shù)前三的化合 物 分 別 是beta-sitosterol（degree=40）、Eucalyptol（degree=27）、及Ammidin（degree=18）。BBB＜0.3共有167 個節(jié)點、409 條邊（圖右），根據(jù)Degree值及靶點數(shù)前三的化合物分別是luteolin（degree=58）、naringenin（degree=38）、及nobiletin（degree=37）。（節(jié)點代表作用靶點；邊表示靶點之間的聯(lián)系強度）。

圖1 藥物-活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（BBB≥0.3（圖左）、BBB＜0.3（圖右））

2 三化湯與缺血性腦卒中共同潛在靶點的篩選

疾病與藥物交集靶點（圖2）。結(jié)果顯示，“三化湯-缺血性腦卒中”共同靶點有72個，其中易透過血腦屏障與缺血性腦卒中共26個，不易透過血腦屏障與缺血性腦卒中共同潛在靶點63個。

圖2 疾病與藥物交集靶點

3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶點

將三化湯與缺血性腦卒中共同潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得靶蛋白之間的相互作用關(guān)系，再將靶蛋白相互作用信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中（圖3）。

圖3 蛋白互作圖：BBB≥0.3（圖左）、BBB＜0.3（圖右）

利用“Analyze Network”功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)浞治觯嬎愠龈鞴?jié)點的度值degree；當(dāng)BBB≥0.3，共有26個節(jié)點，64條邊，平均自由度為4.92，篩選出符合degree≥4.92共有13個，即為三化湯易透過血腦屏障成份治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點（見表3），將前3個靶點作為核心靶點，即CASP3、PTGS2和JUN。BBB＜0.3，共有63個節(jié)點，823條邊，degree的中位數(shù)為26.12，篩選出符合degree≥26.12共有33個，即為三化湯不易透過血腦屏障成份治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點（見表4），按照度值對關(guān)鍵靶蛋白進行排序，將前3個靶點作為核心靶點，即TNF、IL6和VEGFA。

表3 三化湯治療缺血性腦卒中關(guān)鍵靶點（BBB≥0.3）

表4 三化湯治療缺血性腦卒中關(guān)鍵靶點（BBB＜0.3）

4 GO富集分析及KEGG富集分析

為了闡明三化湯治療缺血性腦卒中的作用機制，我們對三化湯治療缺血性腦卒中關(guān)鍵靶基因進行GO功能及KEGG通路富集分析。

結(jié)果表明，BBB≥0.3，在生物過程方面，主要涉及：細(xì)胞對有機環(huán)化合物的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、血液循環(huán)、對異源生物刺激的反應(yīng)、血管發(fā)育、細(xì)胞分泌等；在細(xì)胞組分方面，主要涉及膜筏、突觸前膜、小窩、血液微粒、黏著斑等；在分子功能方面，主要涉及凋亡、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、肽酶活性、核受體活性、蛋白質(zhì)同二聚活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、絲氨酸水解酶活性、磷酸酯水解酶活性等。以q值為篩選依據(jù)，繪制 GO Biological process（BP） 、GO Cellular component（CC） 及 GO Mo-lecular function（MF） 氣泡圖（見圖 6）。

圖4 BBB≥0.3 BP 、 CC、MF氣泡圖

圖5 BBB＜0.3 BP、CC、MF氣泡圖

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

BBB＜0.3時，在生物過程方面，主要涉及：對脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號通路、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、肌肉細(xì)胞增殖、對多肽的反應(yīng)等；在細(xì)胞組分方面，主要涉及膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、谷氨酸能突觸等；在分子功能方面主要涉及：細(xì)胞因子受體結(jié)合、RNA聚合酶II特異性dna結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、MAP激酶活性、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、多肽結(jié)合、內(nèi)肽酶活力等。以q值為篩選依據(jù)，繪制 GO Biological process（BP） 、GO Cellular component（CC） 及 GO Mo-lecular function（MF） 氣泡圖（見圖7）。

圖7 KEGG通路富集分析氣泡圖

BBB≥0.3，KEGG通路分析主要涉及：與鈣離子相關(guān)通路、cAMP信號通路、VEGF信號通路、膽堿能突觸通路、5-羥色胺通路等；以q值為篩選依據(jù)，繪制KEGG氣泡圖（見圖8）。

BBB＜0.3時，KEGG通路分析主要涉及：IL-17 信號通路、動脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號通路、PPAR信號通路、炎癥介質(zhì)對TRP通道的調(diào)節(jié)；以q值為篩選依據(jù)，繪制KEGG氣泡圖（見圖9）。

5 分子對接結(jié)果

一般認(rèn)為，當(dāng)結(jié)合能＜0kcal·mol-1時，認(rèn)為分子蛋白質(zhì)自發(fā)結(jié)合并相互作用，而且結(jié)合能越低，分子構(gòu)象越穩(wěn)定。若結(jié)合力＜-5.0 kcal·mol-1，表明兩者具有較好的結(jié)合性，結(jié)合力結(jié)果見表5。

BBB≥0.3，經(jīng)篩選，靶點數(shù)前三的主要活性成分是：植物固醇（beta-sitosterol）、歐前胡素（Ammidin）、 桉樹腦（Eucalyptol），degree 值前三的靶點是CASP3、PTGS2和JUN，從上述化合物與交集靶點的分子對接結(jié)果（見表5）中不難發(fā)現(xiàn)，植物固醇與PTGS2（PDB ID：5F19）、歐前胡素與CASP3（PDB ID：1NME）、桉樹腦與 PTGS2（5F19）均具有良好的結(jié)合活性。植物固醇可與活性位點附近的 ASN-537、VAL-228、GLY-533 三種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到PTGS2、 歐前胡素可與 MET-44、GLY-45、GLU-84 三種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到 CASP3、桉樹腦可與 ARG-44、HIS-39L兩種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到PTGS2上（見圖 10）。

BBB＜0.3，靶點數(shù)前三的主要活性成分是：木犀草素（Luteolin）、柚皮素（naringenin）、川陳皮素（nobiletin），degree 值前三的靶點是TNF、IL6和VEGFA，從上述化合物與交集靶點的分子對接結(jié)果（見表5）中不難發(fā)現(xiàn)，木犀草素與IL6（PDB ID：1ALU）、柚皮素與TNF（PDB ID：2AZ5）、川陳皮素與VEGFA（1MKK）均具有良好的結(jié)合活性。木犀草素可與活性位點附近 的 LYS-86、LYS-66、GLU-93、LEU-62、ASN-61四種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到IL6、柚皮素可與 GLN-125、ASN-92兩種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF、川陳皮素可與 CYS-102、CYS-104兩種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到VEGFA上（見圖11）。

討論

目前，缺血性腦卒中的發(fā)生主要是由各種原因引起的腦組織血流供應(yīng)驟減，腦組織缺血、缺氧、壞死，引起的一系列神經(jīng)功能障礙、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或壞死，腦血管結(jié)構(gòu)改變，血腦屏障功能破壞[12-13]。涉及機制主要有：興奮性氨基酸損傷學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、氧自由基學(xué)說、神經(jīng)細(xì)胞凋亡學(xué)說、血流動力學(xué)改變學(xué)說[14]。血腦屏障的損傷是腦缺血再灌注損傷的病理生理基礎(chǔ)，缺血性腦中風(fēng)發(fā)病后，血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）的完整性受到破壞，通透性改變；研究表明，急性低壓低氧可導(dǎo)致大鼠腦組織細(xì)胞空泡化增多、水腫明顯，膠質(zhì)細(xì)胞增生顯著，影響了AQP4、Occludin、ZO-1蛋白表達，增加低壓低氧下血腦屏障的通透性[15]。故保護血腦屏障完整性是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮生理功能的重要保證。

《素問·水熱穴論》曰：“所謂玄府者，汗孔也”。劉完素認(rèn)為：“玄府：無物不有，乃氣升降出入運行之道路門戶也，廣泛存在于機體五官九竅、臟腑內(nèi)外的微觀、玄妙孔竅，與經(jīng)絡(luò)、腠理、三焦、臟腑等共同構(gòu)成運行機體精、氣、血、津、液等的循環(huán)通道，強調(diào)了玄府的“廣泛性、微觀性、開闔性和通利性”，它與血腦屏障在結(jié)構(gòu)和生理上具有高度相似之處[16]。血腦屏障與玄府皆為人體結(jié)構(gòu)層次及功能系統(tǒng)中最為細(xì)小的單位，肉眼不可見，分布廣泛。血腦屏障人體血液與腦組織液進行物質(zhì)交換的重要保護屏障系統(tǒng)，是各種離子通道及水通道蛋白的整合體，調(diào)控氣血周流，與玄府流通氣液、滲灌氣血的作用相似。在病理狀態(tài)下，玄府閉塞，氣血、津液出入門戶不通，氣機阻滯，風(fēng)、火、痰濁、淤血、濕邪等邪實阻滯與腦，神機實用，則產(chǎn)生意識功能障礙；腦血管疾病下?lián)p害血腦屏障，物質(zhì)交換屏障功能受損，有害物質(zhì)進入大腦，引起腦水腫或腦腫脹。研究表明，開通玄府法可改善大鼠卒中后腦水腫及改善神經(jīng)功能，調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷時AQP4 mRNA的異常表達[17]。

“玄府閉塞”是中風(fēng)病關(guān)鍵發(fā)病機制，中風(fēng)病病位在腦，高巔之上，唯風(fēng)可到，三化湯方用羌活以化風(fēng)，厚樸、大黃以化滯，枳實以化痰，故曰三化，活用小承氣通腑瀉熱，巧用羌活解風(fēng)邪阻絡(luò)之標(biāo)，使內(nèi)外相合，升降并濟，以解中風(fēng)病玄府閉塞之要[18-20]。

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出歐前胡素、木犀草素、柚皮素、川陳皮素等 42 個主要活性成分，可通過抗炎、抗細(xì)胞凋亡、保護血管內(nèi)皮等作用抑制 IS 的發(fā)生發(fā)展。CASP3、PTGS2、JUN、TNF、IL6和VEGFA作為核心靶點。Caspase-3是神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)[21]，缺血性腦卒中可激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[22]，研究表明，急性缺血性腦卒中患者血清caspase-3的表達水平顯著增高，神經(jīng)功能發(fā)生障礙[23]。受多種炎性細(xì)胞調(diào)節(jié)而高度表達，可抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB通路，進一步抑制細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞增殖、遷移[24-25]。JNK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogenac tivated-proteinkinase，MAPK）家族成員，參與了細(xì)胞生長、增值、凋亡等過程，腦損傷前期，大腦釋放IL6、TNF等炎性因子，JNK的激活與炎癥因子密切相光，從而引發(fā)下游蛋白c-JNK磷酸化，促進凋亡，同時可啟動Caspase-3，進一步促進神經(jīng)元細(xì)胞凋亡；研究表明Jun還可以促進了大鼠CNS神經(jīng)元和小鼠DRG神經(jīng)元的突起生長[26-27]。IL6、TNF是一種促炎因子，研究表明，急性缺血性腦卒中患者的IL6、TNF的表達顯著增高，介導(dǎo)白細(xì)胞浸潤為主的急性炎性反應(yīng)，與內(nèi)皮細(xì)胞損害、血腦屏障通透性改變、動脈粥樣硬化、血管閉塞等多種損害有關(guān)[28-29]。VEGFA作為一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，能促進血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移以及促進細(xì)胞外基質(zhì)變性、增加血管通透性，還具有促進炎癥反應(yīng)、抗凋亡等作用。研究表明，VEGFA表達上調(diào)，促進腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）的存活和血管生成[30-32]。

CAMP相關(guān)信號通路廣泛參與神經(jīng)元的存活、生長及神經(jīng)元突觸相關(guān)物質(zhì)的合成、傳遞等環(huán)節(jié)，能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增強海馬神經(jīng)元再生。研究表明，血管性癡呆大鼠模型中，海馬cAMP含量、PKA、pCREB蛋白顯著下調(diào)，給予藥物干預(yù)后均可提高cAMP含 量[33-36]。缺血性腦卒中的發(fā)生引起興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的過度釋放，使突觸后膜處于持續(xù)性去極化狀態(tài)，造成大量Ca2+內(nèi)流，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的生化反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂，線粒體內(nèi)Ca2+超載時，線粒體腫脹、結(jié)構(gòu)裂解，同時激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[37-38]。在腦缺血缺氧性疾病中VEGF可通過調(diào)節(jié) CBF、促進血管新生、建立側(cè)支循環(huán)，發(fā)揮改善腦灌注的積極效應(yīng)；但同時另一方面病理性升高的 VEGF 水平會增強血管通透性和滲漏，并破壞血腦屏障的完整性，促進血腦屏障泄露；VEGF 促進血管新生的同時，其介導(dǎo)的血腦屏障損傷機制，可能是其直接活化 Src，或通過 AKT/eNOS 生成 NO 依賴性介導(dǎo)的亞硝基化，兩種途徑均激活了 caveolin-1，抑制了 eNOS 活性，在 VEGF/eNOS 途徑中形成eNOS/NO/Src/caveolin-1 的負(fù)反饋[39-42]。

白介素-17 是一種促炎細(xì)胞因子，研究表明，它可以促進細(xì)胞增值，分化、凋亡，調(diào)控PI3K/AKT/FAS/FASL信號通路抑制Hep-2細(xì)胞凋亡，能調(diào)控JAK/STAT3信號通路，在喉癌的血管生成中起到重 要[43-44]。IL-17在腦病理狀態(tài)下，表達含量明細(xì)增高，研究表明，會激活NF-κB、JAKs/STATs等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，使血腦屏障通透性增高[45]。PI3K和AKT具有促進細(xì)胞增殖、抗凋亡的作用[46]，PI3K-Akt信號通路可以介導(dǎo)的PPAR γ表達雙向調(diào)節(jié)3T3 - L1細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，同時AKT可特異性磷酸化內(nèi)皮一氧化氮氧合酶（endothial nitric oxide synapse，eNOS，介導(dǎo)血管新生與內(nèi)皮細(xì)胞功 能[47-48]?；罨腁kt可通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，促使核因子NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，NF-κB可調(diào)控多種炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等炎癥因子，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[49]?；钚匝酰≧OS ）參與了腦卒中的發(fā)病，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs ）是ROS起作用的重要靶點，激活PPAR δ清除ROS發(fā)揮抗氧化作用，保護神經(jīng)功能[50]。從分子對接的結(jié)果來看，除歐前胡素與JUN的結(jié)合效果稍差外，其余各成分與核心靶點都具有良好的結(jié)合活性。

本研究通過利用數(shù)據(jù)挖掘、生信分析等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)三化湯可通過 CASP3、PTGS2、JUN、TNF、IL6和VEGFA 等靶點作用于 與鈣離子相關(guān)通路、cAMP信號通路、VEGF信號通路、膽堿能突觸通路、5-羥色胺通路、IL-17 信號通路、動脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號通路、PPAR信號通路等 等多條信號通路，在改善血腦屏障通透性、抗炎、抗氧化、促進血管生成、抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮保護神經(jīng)功能的作用，具有多成分、多途徑、多靶點的作用特點。但研究也存在不足，如可能遺漏部分生物利用度差但發(fā)揮良好作用的活性成分、對接成分偏少等，后期仍需進一步開展細(xì)胞、動物等實驗進行驗證。