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    星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤分泌一氧化氮促進(jìn)炎性水腫帶相關(guān)腫瘤微環(huán)境的研究*

    2022-11-22 10:44:04李春濤張其健張李洋付思祺曾
    關(guān)鍵詞:星形膠質(zhì)膠質(zhì)瘤

    李春濤 張其健 張李洋 付思祺曾 瑜**

    (1)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科,長沙 410008;2)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院傷口中心,長沙 410008;3)中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院皮膚科,表觀遺傳湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙 410011;4)國家老年病學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心,長沙 410008)

    腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,根據(jù)WHO病理分級(jí)分為I~IV級(jí)[1]。隨著影像學(xué)的發(fā)展,磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusionweighted imaging,DWI)能更清楚地區(qū)分腫瘤組織、水腫組織及正常的腦組織。對(duì)于低級(jí)別的膠質(zhì)瘤,磁共振波譜分析(magnetic resonance spectroscopy,MRS)提示腫瘤組織的萘乙酸(1-naphthylacetic acid,NAA)和膽堿(choline,Cho)比值顯著高于瘤周水腫組織[2]。而膠質(zhì)瘤侵襲的范圍已遠(yuǎn)超出影像所顯示的腫瘤邊界。目前認(rèn)為,膠質(zhì)瘤相關(guān)的水腫,尤其是瘤周的腦水腫促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲,并顯著影響膠質(zhì)瘤的預(yù)后[3]。炎癥所導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤微環(huán)境變化與膠質(zhì)瘤的生長與治療相關(guān)[3-4]。因此,膠質(zhì)瘤手術(shù)切除后周圍水腫組織是膠質(zhì)瘤治療與預(yù)后的重要研究方向。前期研究通過對(duì)大樣本臨床病例檢測(cè)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS),發(fā)現(xiàn)iNOS的表達(dá)情況不僅與惡性腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān),而且惡性腫瘤顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的病例中,轉(zhuǎn)移灶明顯呈現(xiàn)iNOS高表達(dá)[5]。本研究擬通過對(duì)膠質(zhì)瘤臨床病例的腫瘤組織和水腫帶中蛋白質(zhì)及一氧化氮(nitric oxide,NO)的檢測(cè)和標(biāo)定,探討星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤分泌NO促進(jìn)炎性水腫帶相關(guān)腫瘤微環(huán)境的作用。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    Thermo Finigan TSQ Quantum Discovery Max型液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,Xcalibur高級(jí)色譜工作站(賽默飛,美國)。Mettler電子天平(梅托勒,瑞士);AllegraTM 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼,美國);渦旋混合器(賽默飛,美國);TTL-30超純水器(北京同泰聯(lián),中國)。甲醇為色譜純,甲酸為分析純,超純水(TTL-30超純水器自制),氯化胺緩沖液,硫酸鋅溶液(0.42 mol/L),乙酸鋅溶液,10.6%亞鐵氰化鉀溶液;氫氧化鈉溶液(20 g/L),對(duì)氨基苯磺胺酸溶液,N-1-萘基乙二胺溶液(1 g/L),以上試劑均購自德國默克公司。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液配置:準(zhǔn)確稱取250 mg于硅膠干燥器中干燥24 h的亞硝酸鈉,加水溶解移入500 ml容量瓶中,加100 ml氯化銨緩沖液,加水稀釋至刻度混勻,在4℃避光保存。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液:臨用前,吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml,置于100 ml容量瓶中,加水稀釋至刻度此溶液每毫升相當(dāng)于5 μg亞硝酸鈉。顯色劑:臨用前將N-1-萘基乙二胺溶液(1 g/L)和對(duì)氨基苯磺胺酸溶液等體積混合。

    1.2 膠質(zhì)瘤患者標(biāo)本的收集和準(zhǔn)備

    選取2018年1月至2020年1月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科診治的初次手術(shù)且術(shù)前未進(jìn)行放化療等特殊處理、術(shù)后經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)為星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的標(biāo)本27例(WHO II級(jí)10例、II-III級(jí)7例、IV級(jí)10例)。所有患者均簽署知情同意書并獲得了中南大學(xué)湘雅醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.201703478)。取腫瘤水腫帶組織加入生理鹽水,采用組織勻漿器制成濃度為0.5 kg/L的組織勻漿,加入內(nèi)標(biāo)30 μl,渦旋后,加入乙醚-正己烷(4∶1)4 ml,渦旋3 min,3 500 r/min離心10 min。吸取上層有機(jī)相于另一離心管中,40℃水浴氮?dú)獯蹈?;下層液體再加入有機(jī)溶劑4 ml(乙醚-正己烷4∶1)提取,得到有機(jī)相,合并兩次有機(jī)相,氮?dú)獯蹈?,殘?jiān)?00μl流動(dòng)相溶解,取10μl進(jìn)樣分析。所有樣本均進(jìn)行NO檢測(cè)。

    1.3 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)條件

    色譜柱為Lichrospher C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨=70∶30;流速:0.2 ml/min;柱溫:35℃,進(jìn)樣量10μl。質(zhì)譜條件:離子檢測(cè)方式為選擇性離子檢測(cè)(SRM);離子極性為正離子;離子化方式為氣動(dòng)輔助電噴霧離子化(ESI);以多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方式檢測(cè)。每個(gè)級(jí)別取5例樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析。所有的測(cè)定值均在正離子模式下檢測(cè),一級(jí)掃描MS 8 100 amu/s,二級(jí)掃描MS 26 000 amu/s。質(zhì)譜鑒定的結(jié)果在DateAnalysis處理后,采用Mascot軟件搜庫。

    1.4 格里斯試劑比色法(Griess reagent)

    稱取約10 g經(jīng)絞碎混勻腫瘤水腫帶樣品,置于打碎機(jī)中,加70 ml水和12 ml氫氧化鈉溶液(20 g/L),混勻,用氫氧化鈉溶液(20 g/L)或鹽酸溶液(6 mol/L)調(diào)樣品pH=8.0,定量轉(zhuǎn)移至200 ml容量瓶中,加10 ml硫酸鋅溶液,混勻,如不產(chǎn)生白色深沉,再補(bǔ)加2~5 ml氫氧化鈉,混勻。置60℃水浴中加熱10 min,取出后冷至室溫,加水至刻度混勻。放置0.5 h,濾紙過濾,棄去初濾液20 ml,收集濾液備用。吸取10 ml上述濾液于25 ml帶塞比色管中,于管中分別加入4.5 ml氯化銨緩沖液,加2.5 ml 60%乙酸后立即加入5 ml顯色劑,加水至刻度,混勻,在暗處靜置25 min,用1 cm比色杯(靈敏度低時(shí)可換2 cm比色杯),以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn),于波長550 nm處測(cè)吸光度。同時(shí)做試劑空白。

    1.5 信號(hào)通路預(yù)測(cè)

    通 過ClusterProfiler包 以 及Proteomaps和Metascape網(wǎng)頁工具進(jìn)行富集分析,分析BioCarta、KEGG通路和GO功能注釋,根據(jù)HPLC-MS/MS結(jié)果,使用上述方法對(duì)蛋白質(zhì)或?qū)?yīng)的基因集進(jìn)行富集分析,得到富集的功能注釋及通路結(jié)果。

    1.6 量化和統(tǒng)計(jì)分析

    所有數(shù)據(jù)值均以平均值±SEM表示。兩組數(shù)據(jù)的比較使用Student-t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05被認(rèn)為是顯著的。

    2 結(jié) 果

    2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤水腫帶中富含炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)

    磁共振成像顯示15例代表性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者水腫帶,黃色圓圈為手術(shù)取材部位(圖1)。高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)上述15例星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者水腫帶組織成分,提示其富含大量炎性蛋白質(zhì),隨著腫瘤病理級(jí)別的升高,色譜質(zhì)譜波峰更多,提示高級(jí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤水腫帶中蛋白質(zhì)成分更復(fù)雜(圖2a)。這些蛋白質(zhì)中和炎癥相關(guān)的代表性蛋白質(zhì)包括:細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome coxidase,COX)、熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)、CD44抗 原、白 介 素-8(interleukin-8,IL-8)、白介素-24(interleukin-24,IL-24),凝溶膠蛋白(gelsolin,GSN)、應(yīng)激誘導(dǎo)磷酸蛋白1(stress-induced-phosphoprotein 1,STIP1)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、硫氧還蛋白過氧化物酶(peroxiredoxin,PRDX)、S100蛋白、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等(圖2b)。

    Fig.1 The edema zone and sampling position of patientsThe magnetic resonance imaging(MRI)edema zone of WHO grade II,II-III,IV astrocytoma patients and sampling position(yellow circle).

    Fig.2 The protomics analysis of astrocytoma by HPLC-MS/MS

    2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中NO的含量高于水腫帶

    通過對(duì)所有星形膠質(zhì)瘤臨床病例的腫瘤組織和水腫帶中NO的檢測(cè)和標(biāo)定,發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中NO的含量高于水腫帶,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 5)(圖3)。

    Fig.3 The nitric oxide expression in 27 cases of astrocytoma edema zone and tumor tissues

    2.3 HPLC-MS/MS結(jié)果的富集分析

    基于HPLC-MS/MS的結(jié)果,通過多種方法對(duì)結(jié)果蛋白質(zhì)/基因進(jìn)行了富集分析。BioCarta基因集提示這些蛋白質(zhì)高度參與檸檬酸代謝途徑(citric acid/KREB pathway)。與II-III級(jí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤相比,Ⅳ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤水腫帶中的基因更多地參與無氧代謝,如糖酵解(glycolysis)。更重要的是,這些目標(biāo)基因顯著參與多種氧化還原反應(yīng),如氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)和過氧化物酶活性(peroxiredoxin activity)。誘導(dǎo)性一氧化氮合酶負(fù)責(zé)催化L-精氨酸和分子氧反應(yīng)產(chǎn)生NO。NO作為一種信使分子,在全身發(fā)揮不同的功能。并可介導(dǎo)環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)等細(xì)胞質(zhì)靶蛋白的半胱氨酸S-亞硝基化。NO分子和NO合成代謝過程中生成的NO2、NO2-、NO3-和過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion,ONOO-)等含氮自由基,被統(tǒng)稱為反應(yīng)性氮代謝物。其中,iNOS、NO、ONOO-以及SOD1在氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(圖4)。

    Fig.4 Gene functional analysis

    3 討 論

    3.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤周圍的水腫帶是腫瘤引起炎癥反應(yīng)改造的微環(huán)境

    Wang等[3]分析了22例膠質(zhì)瘤水腫帶的組織病理學(xué)特征,發(fā)現(xiàn)水腫組織的主要成分是分散的侵襲性腫瘤細(xì)胞、反應(yīng)性細(xì)胞和各種血管組織。高級(jí)別膠質(zhì)瘤的侵襲性腫瘤細(xì)胞密度顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤,且靠近膠質(zhì)瘤區(qū)域的腫瘤細(xì)胞密度顯著高于遠(yuǎn)離膠質(zhì)瘤區(qū)域的腫瘤細(xì)胞密度。瘤周水腫帶是腫瘤細(xì)胞侵襲導(dǎo)致的組織重建的結(jié)果,是膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和擴(kuò)散的合適生態(tài)位,膠質(zhì)瘤是沿著神經(jīng)纖維束浸潤和播散的[6]。Henderson等[7]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的浸潤和水腫經(jīng)常難以完全區(qū)分,他們使用DTI數(shù)據(jù)可以區(qū)分水腫和低度惡性腫瘤(敏感性91.7%,特異性86.4%),提出了一種基于多DTI參數(shù)補(bǔ)充信息和空間歸一化的腫瘤浸潤概率圖。該課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),這種水腫校正方法可以改善膠質(zhì)瘤相關(guān)瘤周水腫患者神經(jīng)纖維運(yùn)動(dòng)束和語言束的可視化[8],這在一定程度上可以幫助醫(yī)生更好地切除腫瘤。因此,膠質(zhì)瘤周圍的水腫帶,是腫瘤細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)形成的一種有助于腫瘤浸潤的微環(huán)境。

    3.2 合成和分泌NO是星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞改造周圍炎性腫瘤微環(huán)境的重要方式

    NO是機(jī)體內(nèi)的重要信使分子和效應(yīng)分子,不僅參與眾多生理過程,還可通過影響腫瘤抗藥性、逃避凋亡、促進(jìn)增殖、促進(jìn)血管新生等效應(yīng)發(fā)揮促瘤作用[9]。NO的作用十分復(fù)雜,可影響腫瘤的生物學(xué)行為與炎癥反應(yīng),有時(shí)候呈促進(jìn)作用而有時(shí)呈抑制作用[10]。這種抗腫瘤和促腫瘤的雙重關(guān)系被認(rèn)為是濃度依賴性的,也取決于細(xì)胞的類型與細(xì)胞的生存環(huán)境[11-12]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病中,高劑量的NO釋放,能導(dǎo)致ONOO-和其他活性氮自由基的形成,二者可以使蛋白質(zhì)的酪氨酸硝基化,形成3-硝基酪氨酸(3NY),引起細(xì)胞的死亡[13]。

    利用經(jīng)典的格里斯試劑檢測(cè)亞硝酸鹽含量,證實(shí)在膠質(zhì)瘤的腫瘤組織及水腫帶中存在NO。膠質(zhì)瘤的腫瘤組織中NO含量高于周圍水腫帶,從側(cè)面證實(shí)腫瘤細(xì)胞中的一氧化氮合酶的活性是明顯高于腫瘤周圍組織的。這一結(jié)果與Lam-Himlin等[14]的研究一致。課題組前期發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,在其他惡性腫瘤(肺癌)的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移病例中,iNOS與惡性腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān),并且在腫瘤顱內(nèi)轉(zhuǎn)移灶呈現(xiàn)高表達(dá)[5]。NOS廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),目前已發(fā)現(xiàn)存在3個(gè)亞型:神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal NOS,nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS,eNOS)以及iNOS[15]。在炎癥反應(yīng)中,NO主要由激活的iNOS合成產(chǎn)生[16]。iNOS在炎癥和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中,及膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中,發(fā)揮重要的作用[16-17]。iNOS誘導(dǎo)參與多種癌癥的惡性增殖和腫瘤進(jìn)展,如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。iNOS是星形膠質(zhì)細(xì)胞惡性激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,它可以誘發(fā)神經(jīng)炎癥和膠質(zhì)瘤生成[17]。本課題組在對(duì)不同分級(jí)的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的水腫帶,進(jìn)行蛋白質(zhì)組的研究中,均發(fā)現(xiàn)有SOD-1的表達(dá)存在。SOD-1是一種含量豐富的32 ku同二聚體抗氧化酶,能將超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫。SOD-1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度成反比[18],過表達(dá)SOD-1能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長、抑制其凋亡[19]。

    Kato等[20]研究發(fā)現(xiàn),41例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中16例免疫組化陽性,iNOS陽性的樣本常常SOD1或SOD2陽性,尤其是iNOS的表達(dá)和SOD1的表達(dá)顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)NO可以通過抑制半胱氨酸依賴的SOD1單體化來增強(qiáng)SOD1活性并抑制氧化應(yīng)激[21]。另外,科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)NO對(duì)血管細(xì)胞中氧化還原環(huán)境的影響,NO可快速刺激血管細(xì)胞中SOD-1基因的表達(dá),進(jìn)而引起SOD-1蛋白的高表達(dá),伴隨氧化應(yīng)激分子標(biāo)志的表達(dá)和O2-水平的下降。升高的SOD-1還抵消了NO抗細(xì)胞增殖的效應(yīng)。但是,這種SOD-1蛋白水平在內(nèi)皮細(xì)胞和外膜成纖維細(xì)胞中并未增加[22]。這說明,NO對(duì)于SOD-1的影響在不同細(xì)胞中亦有所不同[23]。另外,在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中SOD-1蛋白表達(dá)水平低,這與放療后的膠質(zhì)瘤SOD-1的高表達(dá)形成對(duì)比。體外實(shí)驗(yàn)中人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251的抗輻射變異也表現(xiàn)出較高的SOD-1表達(dá)[24]。

    細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5(cyclindependent kinase 5,Cdk5)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及成熟階段,通過磷酸化細(xì)胞骨架蛋白、信號(hào)分子以及調(diào)節(jié)蛋白等眾多底物蛋白的特異性絲/蘇氨酸位點(diǎn),而在神經(jīng)元的遷移分化、存活和突觸的發(fā)生、信息傳遞、可塑性等諸多方面起到了重要的作用。單體Cdk5無活性,需要與p35等因子結(jié)合才能被激活,Cdk5特異性磷酸化其底物蛋白的絲氨酸和蘇氨酸位點(diǎn)[25]。在如炎癥、氧化應(yīng)激和興奮性毒性刺激等促發(fā)鈣穩(wěn)態(tài)失衡或興奮性毒性的情況下,p35可被特定蛋白酶(如鈣蛋白酶(calpain))剪切,失去錨定在細(xì)胞膜上的氨基端序列,形成半衰期更長的p25[26-27],Cdk5與p25結(jié)合,形成的復(fù)合體主要是使細(xì)胞骨架蛋白異常磷酸化,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡[27-28]。而SOD-1可以通過抑制Cdk5/p35通路,來維持神經(jīng)元細(xì)胞骨架的完整性[29]。結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析,提示星形膠質(zhì)瘤中腫瘤細(xì)胞有可能是通過iNOS-NO-ONOO--SOD-1細(xì)胞死亡來改造腫瘤周圍微環(huán)境。

    本研究具有一定的局限性。首先,樣本量偏少,一共只有27例,質(zhì)譜分析各個(gè)級(jí)別只選取了5例作為代表性樣本。其次,生物信息學(xué)分析的結(jié)果和作用機(jī)制需要進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

    綜上所述,星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的腫瘤周邊水腫帶,可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍微環(huán)境的一種主動(dòng)改造。腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)iNOS,合成并對(duì)外分泌大量的NO,NO形成的ONOO-將周圍腦組織的組織間隙、神經(jīng)元等細(xì)胞中的SOD-1消耗,產(chǎn)生過氧化細(xì)胞毒性,形成利于腫瘤細(xì)胞生長和侵襲的炎性腫瘤微環(huán)境。

    4 結(jié) 論

    星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤周圍水腫帶的形成是炎癥反應(yīng)的結(jié)果,膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過分泌NO調(diào)控SOD-1等炎性分子促進(jìn)侵襲性炎性腫瘤微環(huán)境的形成。

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