鳳仙透骨草HPLC指紋圖譜及其與抗炎活性的譜效關(guān)系

蔣 麗，郭瑞齊，管仁偉，路俊仙，王 萌，林慧彬，閆雪生，詹志來

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014；3.中國中醫(yī)科學院中藥資源中心，北京 100700）

鳳仙透骨草為鳳仙花科鳳仙花屬植物鳳仙花（Impatiens balsamina L.）的干燥莖，主要分布于江蘇、安徽、浙江、四川等地。鳳仙透骨草具有祛風濕、活血、消腫、止痛等功效，主要用于治療風濕性關(guān)節(jié)痛、屈伸不利等癥狀［1］。藥理學研究表明，鳳仙透骨草具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化等作用［2-3］。透骨草藥材同名異物現(xiàn)象嚴重，品種極其混亂［4-5］，有明顯的區(qū)域用藥性。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，鳳仙透骨草及珍珠透骨草為透骨草藥材的主流品種，用藥區(qū)域較為廣泛，其主要含有黃酮類、萘醌類、萜類等化學成分［6-10］。

中藥指紋圖譜是一種綜合、可量化的數(shù)字化評價系統(tǒng)，可全面、系統(tǒng)地展現(xiàn)樣品的成分及其特點，彌補了多組分定量分析的缺憾，為評價質(zhì)量一致性及穩(wěn)定性提供參考依據(jù)［11］。中藥譜效關(guān)系是一種辨別模式，通過對藥材化學成分特征和藥效進行數(shù)據(jù)分析，科學地表達化學成分與藥效之間的關(guān)系［12］。目前，鳳仙透骨草質(zhì)量控制主要體現(xiàn)在性狀鑒別、顯微鑒別、粉末鑒別、灰分、水分、浸出物等方面，尚未發(fā)現(xiàn)指標性成分用于質(zhì)量評價，以及指紋圖譜與活性研究相結(jié)合的報道。本實驗采用高效液相色譜（HPLC）建立鳳仙透骨草指紋圖譜，根據(jù)臨床用藥特點，以抗炎作用為切入點，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析與偏最小二乘判別分析（PLS-DA）探索指紋圖譜與抗炎活性的譜效關(guān)系［13］，初步探究鳳仙透骨草藥材發(fā)揮抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為鳳仙透骨草藥材質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

RHP-500A型高速多功能粉碎機（浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司）；XS205DU型電子天平（梅特勒-托利多國際有限公司）；Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾有限公司VWD檢測器，Chromeleon7色譜工作站）；DZKW-S-4水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 動物

SPF級KM小鼠130只，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物許可證號SCXK（魯）20190003。本研究經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院實驗動物福利與倫理委員會批準（批準號SDZYY20190915002）。

1.3 試劑及藥品

小鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號2020-12）、小鼠血清白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（批號2020-12）均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；阿司匹林腸溶片（規(guī)格：100 mg，國藥準字J20171021）購自拜爾醫(yī)藥保健有限公司；角叉菜膠（批號C11738614）購自上海麥克林生化科技有限公司；對照品金絲桃苷（批號111521-201507）、山柰酚（批號110861-202013）、槲皮素（批號100081-201610）均購自中國食品藥品檢定研究院；阿魏酸（批號0773-9910）、蘆?。ㄅ?00080-200306）均購自中國藥品生物制品檢定所；2-甲氧基-1，4-萘醌（批號2348-82-5）購自上海源葉生物科技有限公司。10批鳳仙透骨草樣品經(jīng)林慧彬研究員鑒定均為鳳仙花科植物鳳仙花（Impatiens balsamina L.）干燥莖。見表1。

表1 10批鳳仙透骨草藥材來源

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Welchrom C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；檢測波長270 nm；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫：0～20 min，13%B；20～30 min，13%～15%B；30～40 min，15%～22%B；40～50 min，22%B；50～60 min，22%～30%B；60～70 min，30%B；70～80 min，30%～35%B；80～100 min，35%～40%B；柱溫25℃；流速1 mL/min，進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備

取阿魏酸、蘆丁、2-甲氧基-1，4-萘醌、槲皮素、山柰酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為15.100 μg/mL、50.200 μg/mL、30.100 μg/mL、22.240 μg/mL、26.500 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取鳳仙透骨草粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇溶液40 mL，回流提取1.5 h，放冷后補足失重，搖勻過濾，濾液蒸干，定容于2 mL容量瓶，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 方法學考察

2.4.1.1 精密度考察 以鳳仙透骨草S1為試驗對象，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄各共有峰峰面積及保留時間，以2-甲氧基-1，4-萘醌色譜峰為參照，計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間，測得各共有峰相對保留時間的相對標準差（RSD）均小于1%，相對峰面積的RSD均小于3%，表明精密度良好。

2.4.1.2 穩(wěn)定性考察 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h按照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄各共有峰峰面積及保留時間，以2-甲氧基-1，4-萘醌色譜峰為參照，測得各共有峰相對保留時間的RSD小于1%，相對峰面積的RSD小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.1.3 重復(fù)性考察 精密稱取鳳仙透骨草粉末S1 6份，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進樣，記錄各共有峰峰面積及保留時間，以2-甲氧基-1，4-萘醌色譜峰為參照，測得各共有峰相對保留時間的RSD小于1%。相對峰面積的RSD小于3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.2 指紋圖譜的建立 精密稱取鳳仙透骨草藥材S1約1.0 g，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進樣，記錄HPLC色譜圖，將10批鳳仙透骨草藥材的色譜圖導入《中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004版），以河北鳳仙透骨草藥材S1的指紋圖譜為參照圖譜，以中位數(shù)法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.4 min，經(jīng)多點校正、自動匹配生成鳳仙透骨草藥材指紋圖譜的共有模式。見圖1、圖2。

圖1 鳳仙透骨草藥材（S1～S10）高效液相色譜法指紋圖譜疊加圖及對照圖譜（R）

圖2 鳳仙透骨草藥材混合對照品（A）及供試品共有模式（B）高效液相色譜法色譜圖

根據(jù)鳳仙透骨草藥材指紋圖譜共有模式可知，各批次鳳仙透骨草HPLC指紋圖譜共有15個共有峰，部分共有峰峰面積略有差異，表明不同批次鳳仙透骨草藥材在成分含量層面有所不同，見表2。通過各對照品保留時間與各批次藥材對比共確認了5個色譜峰，分別為阿魏酸、蘆丁（峰3）、2-甲氧基-1，4-萘醌（峰7）、槲皮素（峰8）、山柰酚（峰14）。

表2 10批不同來源鳳仙透骨草藥材共有峰峰面積

2.4.3 相似度評價 將各批次鳳仙透骨草HPLC指紋圖譜分別導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004版），對各批次鳳仙透骨草指紋圖譜全譜進行自動匹配、相似度計算。10批鳳仙透骨草藥材相似度均在0.90以上，表明不同批次鳳仙透骨草藥材質(zhì)量基本穩(wěn)定。見表3。

表3 10批不同來源鳳仙透骨草藥材相似度評價結(jié)果

2.4.4 聚類分析 將10批鳳仙透骨草色譜圖中各共有峰峰面積導入SPSS 17.0軟件進行聚類分析，采用組間連接法、歐式距離為度量標準，當距離為25時，10批鳳仙透骨草藥材共分為4類，其中Ⅰ類包括樣品S4、S6、S7、S8、S9、S10；Ⅱ類包括樣品S1、S3；Ⅲ類包括樣品S5，Ⅳ類包括樣品S2。見圖3。

圖3 10批不同來源鳳仙透骨草藥材聚類分析結(jié)果

2.4.5 主成分分析 將10批鳳仙透骨草藥材標準化的共有峰峰面積導入SPSS 17.0軟件進行主成分分析，結(jié)果見表4、表5、圖4。將特征根值、方差貢獻率作為保留主成分個數(shù)依據(jù)，以特征根值1為篩選標準，共得到3個主成分，累計貢獻率為86.015%，碎石圖也表明提取前3個成分后坡度趨于平緩，說明這3個主成分代表了鳳仙透骨草色譜峰所包含的大部分信息，可用于評價鳳仙透骨草的質(zhì)量。

圖4 10批不同來源鳳仙透骨草藥材主成分分析碎石圖

表4 10批不同來源鳳仙透骨草藥材主成分方差貢獻率

由初始因子載荷矩陣表5可知，第一主成分信息主要來源于色譜峰1、3、6、7、8、9、13、14、15；第二主 成 分 信息 主 要 來 源 于 色 譜 峰2、4、5、10、11、12、13；第三主成分信息主要來源于色譜峰2、7，進而推測鳳仙透骨草藥材各批次間質(zhì)量差異是因多種化學成分綜合作用的結(jié)果。

表5 10批不同來源鳳仙透骨草藥材共有峰初始因子載荷矩陣

利用SIMCA14.1軟件對10批鳳仙透骨草指紋圖譜共有峰進行主成分分析，見圖5。結(jié)果顯示10批藥材分類狀況與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖5 10批不同來源鳳仙透骨草藥材主成分分析得分圖

2.4.6 PLS-DA為研究不同批次藥材間差異，利用SIMCA14.1軟件對10批不同來源鳳仙透骨草藥材指紋圖譜數(shù)據(jù)進行PLS-DA。在此模型中，變量重要性投影（VIP）值圖可直觀反映各色譜峰的貢獻程度，通常以VIP值＞1作為篩選指標的標準，VIP值＞1表明此成分起關(guān)鍵性作用。峰2、峰4、峰6、峰7（2-甲氧基-1，4-萘醌）和峰14（山柰酚）為造成不同批次間差異的關(guān)鍵性色譜峰，在鳳仙透骨草藥材質(zhì)量控制中發(fā)揮重要作用，見圖6。

圖6 10批不同來源鳳仙透骨草藥材色譜峰變量重要性投影值圖

3 抗炎活性

3.1 分組及給藥

將130只SPF級KM小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組、鳳仙透骨草醇提物組（S1～S10），每組各10只?？瞻捉M、模型組給予生理鹽水；陽性藥組給予阿司匹林腸溶片；S1～S10組給予鳳仙透骨草醇提物，給藥劑量見表6。每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。第7天給藥30 min后，除空白組外，其余各組均在小鼠右足跖皮下注射1%角叉菜膠溶液50 μL。

造模4 h后摘眼球取血，以離心半徑16 cm，12 000 r/min離心血液10 min，取上層血清，采用ELISA法，測定血清中TNF-α、IL-1β水平；同一位置剪下左右足趾，精密稱重，計算足腫脹度和抑制率［14］。見表6。

腫脹度=右腳質(zhì)量-左腳質(zhì)量

抑制率=（模型組足腫脹度-給藥組足腫脹度）/模型組足腫脹度×100%

3.2 統(tǒng)計分析

小鼠足腫脹度、抑制率、血清中TNF-α及IL-1β水平等計量資料用x±s表示，導入SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析。取α=0.05為檢驗水準。

3.3 研究結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠足腫脹度顯著升高（P＜0.01），小鼠血清中TNF-α、IL-1β水平明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，除S6、S8組，其余組小鼠足腫脹度均有明顯的降低作用（P＜0.05）；除S6、S7、S8組，其余組小鼠血清中TNF-α水平均明顯增加（P＜0.05）；除S8組，其余組小鼠血清中IL-1β水平均明顯增加（P＜0.05）。見表6。

表6 各組小鼠足腫脹度、抑制率及血清TNF-α、IL-1β水平比較±s）

表6 各組小鼠足腫脹度、抑制率及血清TNF-α、IL-1β水平比較±s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β。與模型組比較，*P＜0.05；與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 給藥劑量/（g/kg） 只數(shù) 腫脹度/mg 抑制率/% TNF-α/（ng/L） IL-1β/（ng/L）空白組 - 10 12.56±2.34 - 189.44±14.05 18.49±0.64模型組 - 10 104.83±9.80## - 391.93±10.33# 37.86±0.55#陽性藥組 0.60 10 61.49±10.68* 41.37±10.32 238.67±12.27* 19.63±0.73*S1 4.68 10 62.55±5.14* 40.33±4.90 289.42±6.99* 19.41±1.39*S2 4.68 10 65.61±5.36* 37.41±5.11 288.70±7.73* 22.87±0.85*S3 4.68 10 83.17±4.66* 20.66±4.45 333.27±7.19* 34.27±0.85*S4 4.68 10 70.18±5.19* 33.06±4.95 367.88±6.68* 21.22±0.84*S5 4.68 10 68.96±4.22* 34.22±4.03 324.06±4.28* 34.48±1.06*S6 4.68 10 92.66±4.07 11.61±3.88 382.65±5.74 32.99±0.75*S7 4.68 10 69.15±3.35* 34.03±3.19 382.91±6.07 23.85±1.19*S8 4.68 10 94.32±3.82 10.03±3.64 383.78±3.68 37.05±0.94 S9 4.68 10 77.91±3.53* 25.68±3.36 300.91±8.73* 30.43±1.48*S10 4.68 10 74.48±4.61* 28.96±4.40 325.39±6.93* 27.12±1.20*

3.4 鳳仙透骨草醇提物指紋圖譜與抗炎活性關(guān)系

3.4.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 以不同批次鳳仙透骨草醇提物對小鼠藥效指標抑制率為母序列，10批指紋圖譜15個共有峰的峰面積為子序列，經(jīng)過無量綱化、求差序列、兩極最大值最小值、計算關(guān)聯(lián)度等處理，分辨系數(shù)取0.5［15］，所得關(guān)聯(lián)度大小見表7。鳳仙透骨草醇提物15個共有峰與藥效指標的關(guān)聯(lián)度均在0.7236以上，前6位共有峰與角叉菜膠致小鼠急性炎癥具有較大關(guān)聯(lián)。由此可知，鳳仙透骨草醇提物發(fā)揮抗炎作用是多成分綜合作用的結(jié)果。依據(jù)關(guān)聯(lián)度大小，確定鳳仙透骨草各特征成分對抗炎活性貢獻的大小順序為2＞7＞4＞8＞13＞1＞10＞6＞12＞3＞9＞14＞11＞5＞15。

表7 鳳仙透骨草藥材指紋圖譜共有峰與各藥效之間的關(guān)聯(lián)度

3.4.2 PLS-DA VIP值表示自變量對因變量的解釋程度，VIP值越大，自變量對因變量的解釋能力越強［16］。利用SIMCA 14.1軟件以鳳仙透骨草指紋圖譜15個共有峰面積為自變量，不同批次鳳仙透骨草醇提物對小鼠藥效指標為因變量，進行PLS-DA，回歸系數(shù)及VIP值見圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12。由VIP值圖可知峰14對小鼠足腫脹、血清IL-1β水平影響最大，峰7對血清TNF-α水平影響最大；由回歸系數(shù)圖可知，15個共有峰均與足腫脹抑制率呈正相關(guān)，峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰10、峰11、峰12、峰14與血清TNF-α水平呈負相關(guān)，峰1、峰2、峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰9、峰13、峰14、峰15與血清IL-1β水平呈負相關(guān)。

圖7 鳳仙透骨草藥材共有峰與小鼠足腫脹抑制率變量重要性投影值圖

圖8 鳳仙透骨草藥材共有峰與小鼠血清腫瘤壞死因子-α水平變量重要性投影值圖

圖9 鳳仙透骨草藥材共有峰與小鼠血清白細胞介素-1β水平變量重要性投影值圖

圖10 鳳仙透骨草藥材共有峰與小鼠足腫脹抑制率的回歸系數(shù)圖

圖11 鳳仙透骨草藥材共有峰與小鼠血清腫瘤壞死因子-α水平的回歸系數(shù)圖

圖12 鳳仙透骨草藥材共有峰與小鼠血清白細胞介素-1β水平的回歸系數(shù)圖

4 討論

本研究通過對供試品溶液提取條件及色譜條件進行優(yōu)化，進而建立了鳳仙透骨草藥材指紋圖譜，相似度均在0.90以上，聚類分析及主成分分析得分圖表明，藥材質(zhì)量存在產(chǎn)地交叉情況，因此藥材質(zhì)量評價不能局限于產(chǎn)地因素，應(yīng)綜合多方面因素評價藥材質(zhì)量。

從抗炎活性研究結(jié)果來看，不同產(chǎn)地鳳仙透骨草醇提物對小鼠足腫脹抑制率、TNF-α、IL-1β濃度影響不同，但整體均表現(xiàn)為鳳仙透骨草醇提物對足腫脹度、TNF-α及IL-1β含量均有不同程度的降低作用，推測可能因鳳仙透骨草藥材來源不同、內(nèi)部化學成分差異造成抗炎活性的差異性。結(jié)合特征圖譜來看，PLS-DA結(jié)果中峰4、峰6、峰7、峰8、峰14代表的物質(zhì)可抑制小鼠足腫脹；峰2、峰4、峰6、峰7、峰14代表的物質(zhì)可降低小鼠血清中TNF-α水平；峰6、峰7、峰8、峰14代表的物質(zhì)可降低小鼠血清中IL-1β水平。綜合PLS-DA及灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果，峰2、峰4、峰6、峰7（2-甲氧基-1，4-萘醌）、峰8（槲皮素）、峰14（山柰酚）對發(fā)揮抗炎活性關(guān)聯(lián)性較大，為鳳仙透骨草藥材質(zhì)量控制提供參考依據(jù)，但峰2、峰4、峰6的結(jié)構(gòu)鑒定、含量測定等方面還需進一步研究。

本研究成功建立了鳳仙透骨草HPLC指紋圖譜及其與抗炎活性的譜效關(guān)系，可以清晰地從指紋圖譜中代表的化學成分與鳳仙透骨草抗炎活性的相關(guān)性推測抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)?；疑P(guān)聯(lián)度分析結(jié)果表明，15個共有峰與藥效之間的關(guān)聯(lián)度均在0.7236以上，說明鳳仙透骨草發(fā)揮抗炎效果是成分群綜合作用的結(jié)果，并非僅由個別成分決定，是多種成分的綜合體現(xiàn)。本研究僅針對鳳仙透骨草部分成分進行了抗炎活性的驗證，其他成分藥理活性尚有待進一步探究。