9個廣西常規(guī)香稻品種香味及香味基因變異類型分析

劉廣林 李虎 吳子帥 羅群昌 李秋雯 朱其南 陳傳華

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室，南寧 530007；第一作者：350595613@qq.com；*通訊作者：chenchuanhua@gxaas.net）

隨著生活水平的提高，消費者對優(yōu)質(zhì)稻米的需求不斷擴大，并呈多樣化。香米由于具有獨特的香味，深受消費者青睞，其市場價格也比普通大米高出許多，這也為香稻研究和推廣提供了更廣闊的市場前景[1]。香味被認為是一種重要的稻米品質(zhì)指標[2]，香味的遺傳規(guī)律以及香味物質(zhì)的研究已取得較大進展。多數(shù)研究者認為，香味是由位于水稻第8號染色體上1個隱性基因控制，研究證實是Badh2基因。Badh2基因全長1 509 bp，包含15個外顯子和14個內(nèi)含子，編碼503個氨基酸。該基因在不同部位的缺失或插入會引起B(yǎng)adh2基因功能的喪失，導(dǎo)致產(chǎn)生米香物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP），從而使水稻表現(xiàn)為有香味[3]。目前發(fā)現(xiàn)，Badh2基因在不同的香稻品種中存在多種類型的突變，以第7外顯子有1個8 bp的缺失和3個3 bp突變[4]最為常見，還有第4和第5外顯子之間存在803 bp的缺失[5]、第12外顯子處有1個3 bp的缺失[6]、第13外顯子中插入3 bp[7]、第2外顯子有1個7 bp的缺失[8]，以及5'UTR區(qū)3 bp的缺失[9]，這些變異類型已開發(fā)出Indel2[10]、In－Del4-5[5]、GRFM04[1]、FME12[6]、Indel13[7]、FMU1-2[9]等 功能標記。本研究利用這些功能標記對廣西近年育成的9個香稻品種的香味基因變異類型進行鑒定，并對這些品種的香味進行測定，以為香稻品種的推廣及其在育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以廣西近年通過審定的9個常規(guī)香稻品種為試驗材料。這9個品種均為秈稻品種，分別是八桂香、田東香、百香139、桂茉香1號、中廣香1號、桂野豐、廣糧香2號、桂香18、桂香99和廣糧香占。非香對照品種為常規(guī)秈稻油占8號。所有參試品種均于2019年晚季播種在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所同一試驗大田中，每個品種種植5行，每行12株，株行距13 cm×23 cm。整個生長時期采用普通大田常規(guī)栽培管理，每個材料隨機5株混合采樣。

1.2 分子標記法鑒定香稻香味基因型

1.2.1 引物設(shè)計

等位基因Badh2-E2為Badh2基因第2外顯子7 bp缺失，采用InDel2功能標記；Badh2-E4-5等位基因為第4～第5外顯子803 bp缺失，采用inDel4-5功能標記；Badh2-E7等位基因為第7外顯子8 bp缺失和3 bp突變，采用GRFM04功能標記；Badh2-E12為第12外顯子處有1個3 bp的缺失，采用FME12功能標記；Badh2-E13等位基因為第13外顯子3 bp插入，采用InDel13功能標記；Badh2-UTR等位基因為5'UTR區(qū)3 bp的缺失，采用FMU1-2功能標記。上述6個引物信息詳見表1，均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 badh2基因引物序列信息表

1.2.2 PCR擴增及產(chǎn)物的檢測

DNA提取采用CTAB法[11]，PCR擴增參照SHAO等[5]方法進行，PCR產(chǎn)物用8%垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用0.2%硝酸銀快速染色觀察拍照。

1.3 香味物質(zhì)2-AP含量的測定

稻谷收獲后曬干，委托華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院測定2-AP含量。具體方法如下：稱取5 g研磨好的樣品放入玻璃瓶，加入10 mL色譜純二氯甲烷，蓋上密封圈，擰緊瓶蓋稍許震蕩搖勻，放入注滿水的超聲波清洗機，40 kHz、40℃超聲240 min。取出樣品瓶冷卻至室溫，加適量無水亞硫酸鈉后立即用2 mL菌注射器吸取上清液并通過有機型針頭過濾膜（孔徑0.22μm，13 mm）將上清液注入頂空樣品瓶，加入2μL濃度為0.0917 g/L的2,4,6-三甲基嘧啶（TMP）作為內(nèi)標物，立即采用島津GC-MSQP2010plus型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀進行氣相質(zhì)譜測定。色譜條件：色譜柱為SH-Rxi-5Sil MS，長度為30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25μm，柱溫升溫程序為：40℃保持1 min，以2℃/min的速率升溫至65℃，保持1 min，然后以10℃/min的速率升溫至220℃，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%）；恒壓不分流進樣方式，進樣量為2μL。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度為200℃，離子化能量為70eV，接口溫度為250℃，四級桿溫度為150℃，全掃描方式，掃描質(zhì)量范圍35-160m/z。

1.4 香味綜合評分

稻谷收獲后曬干，委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心檢測，依據(jù)為NY/T 596-2002《香稻米》，主要評價供試樣品稻米香味強度、香味風味、滯留度的強度和時間以及綜合印象。稻米香味強度、香味風味鑒別方法：取稻米2 g放入125 mL細口具塞棕色玻璃瓶，加50 mL蒸餾水，蓋上瓶蓋后放入沸水浴15 min，移出玻璃瓶稍加冷卻，輕輕搖晃，打開瓶蓋，閉上嘴，用鼻子吸嗅蒸汽進行評價。香味滯留度和綜合印象的鑒別方法：稱10 g稻米樣品于鋁盒中，用清水攪拌淘洗，適量加水浸泡30 min，于蒸飯鍋內(nèi)加水加熱至沸騰，再將加蓋鋁盒置于蒸屜上，繼續(xù)加熱并開始計時，蒸煮40 min后停止加熱，燜10 min，打開盒蓋，取出米飯少許放入口中，一邊咀嚼一邊在吸氣過程中用鼻后嗅覺法進行評價。4項評分之和為樣品的香味綜合評分，以泰國香米為對照（85分）。香味綜合評分＜60分的不能作為香稻米。

1.5 香味類型的鑒定

參考王冠軍等[12]及NY/T596-2002《香稻米》的方法，并結(jié)合多年香味育種實踐將水稻香味分為烤面包香型、爆米花香型、茉莉香型、芋頭香型及萵苣香型。具體分類標準如下：烤面包香型具有烤面包和香鍋巴的香味，香氣怡人，香味純厚；爆米花香型有清香味，香味純正，比烤面包香型的香味輕快；茉莉香型有清香氣味，且有輕微的香肥皂化香味，極少數(shù)人不樂于接受，如KDML105；芋頭香型有芋頭清香；萵苣香型有萵苣清香。稻谷收獲后曬干，取170 g用小型精米機碾成精米，取稻米2 g放入125 mL細口具塞棕色玻璃瓶中，加50 mL蒸餾水，蓋上瓶蓋后放人沸水浴中15 min，移出玻璃瓶稍加冷卻。評價前應(yīng)先將盛有樣品的棕色玻璃瓶輕輕搖晃，然后將瓶逐個打開，閉上嘴，用鼻子吸嗅蒸氣，評價并記錄每一種樣品的香味類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 9個廣西香稻品種的香味及香味類型

從表2可見，9個品種中除桂野豐的香味類型為芋頭香型外，其他8個品種均為爆米花類型；9個品種香味綜合評分差異不大，在74～79分之間，均可判定為香稻品種；9個品種的2-AP含量在60～128μg/kg之間，均可判定為香稻品種。

表2 9個廣西常規(guī)香稻品種的香味及香味類型

2.2 9個廣西香稻品種香味基因變異類型

2.2.1 功能標記GRFM04的檢測

以9份廣西香稻品種和1份常規(guī)秈稻品種（非香對照）的基因組DNA為模板，利用Badh2基因功能標記GRFM04進行PC R擴增，PCR產(chǎn)物采用凝膠電泳進行檢測。田東香、八桂香、百香139、中廣香1號、桂野豐、桂香18、桂香99和廣糧香占均能夠擴增出201 bp帶型，桂茉香1號及非香對照油占8號僅擴增出209 bp帶型（圖1），說明田東香等8個香稻品種在Badh2基因的第7外顯子處存在1個8 bp的缺失片段和3 bp的突變，它們屬于同一種香味基因的突變類型，而桂茉香1號不屬于此種突變類型。

圖1 9個香稻品種的GRFM04分子標記檢測結(jié)果

2.2.2 功能標記FMU1-2、InDel2、InDel4-5、FME12和InDel13檢測

以9份廣西香稻品種和1份常規(guī)秈稻品種（非香對照）的基因組DNA為模板，利用Badh2基因功能標記FMU1-2、InDel2、InDel4-5、FME12和InDel13進行PC R擴增，PCR產(chǎn)物采用凝膠電泳分別檢測。檢測結(jié)果表明，利用Badh2基因功能標記FMU1-2、InDel2、InDel4-5、FME12和InDel13都只擴增出1條帶，大小分別為163 bp（圖2A）、107 bp（圖2B）、1123 bp（圖2C）、192 bp（圖2D）和194 bp（圖2E）的片段，說明這9個香稻品種在Badh2基因的5’UT R區(qū)和第2、4、5、12、13外顯子處均不存在突變，它們都不屬于這種香味基因突變類型。

圖2 9個香稻品種的FMU1-2（A）、InDel2（B）、InDel4-5（C）、FME12（D）和InDel13（E）分子標記檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前常用水稻香味表型鑒定方法有咀嚼法、熱水法、氫氧化鉀法和儀器測定法等。其中，咀嚼法、熱水法、氫氧化鉀法主要是通過嗅覺及味覺感官來鑒定，方法簡單但速度慢，樣品多時誤差較大?，F(xiàn)在用得較多的儀器測定法主要是利用氣相色譜儀測定2-AP含量[12]。本研究委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心對供試品種進行香味綜合評分評定，委托華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院對供試品種香氣的主要成分2-AP含量進行測定，香味綜合評分主要通過感官法進行，2-AP含量測定屬儀器測定法，兩種方法在香與非香方面判定結(jié)果基本一致，感官法9個品種的香味評分均大于60分，儀器檢測法均檢測到2-AP的存在，兩種方法均能判定9個供試品種為香稻品種；在香味濃淡方面，用感官法檢測出各供試品種香味綜合分數(shù)值在74～79分之間，差異不大；用儀器檢測法檢測到2-AP含量則在60～128μg/kg之間，含量最高的品種是最低品種的2倍左右。目前尚未有將2-AP含量與香味濃淡程度相互匹配的標準，無法判斷人的感官對2-AP含量在60～128μg/kg之間的感知是否相近，這有待進一步研究。2-AP含量在水稻中很低，儀器能檢測到的微小量而人的器官并不一定能感覺到，因此，儀器檢測法對香味鑒定更有優(yōu)勢，但要鑒定香味的濃淡，仍需開展進一步研究，弄清人們能感受到濃香、香、微香所對應(yīng)的2-AP含量范圍，并制定相應(yīng)的標準。

分子標記輔助選擇能夠有針對性的進行性狀改良，進行多基因聚合，具有提高選擇效率和縮短育種年限的明顯優(yōu)勢[13]。由于香味為隱性基因控制的性狀，且在香稻的雜合株型中，香味是以粒為單位分離，既有香粒，也有不香粒，利用標記檢測還能有效避免含有香味基因的優(yōu)良雜合個體在選擇過程中被淘汰[14]，目前已有不少應(yīng)用香型分子標記輔助選育出香型水稻新品種的報道[15-18]。弄清育種親本的香味基因變異類型是開展香型分子標記輔助育種的關(guān)鍵。曾宇等[19]對179份廣西特色香稻地方品種香味基因型進行鑒定，檢測出InDel7等位基因類型40份、InDel4-5等位基因37份、InDel2等位基因1份，但該179份供試香稻材料多為地方粳糯稻品種。本研究中9個供試香稻品種均為廣西生產(chǎn)上曾經(jīng)或正在大面積推廣的香稻品種，亦為廣西香稻育種常用親本，研究結(jié)果表明，八桂香等8個香稻品種為第7外顯子缺失8 bp變異類型，這種基因型是香稻品種中最常見的變異類型。KOVACH等[20]對117個水稻品種進行檢測，發(fā)現(xiàn)第7外顯子缺失8 bp這種基因型占到被測樣品的79.5%。針對這種變異類型 已 經(jīng) 開 發(fā) 了GRFM04[2]、InDel7[10]、YY5-YY8[14]、PMFGR[21]多種功能標記，可利用現(xiàn)有的功能標記進行分子標記選擇加快香稻新品種的選育進程。而桂茉香1號香味評分75分、2-AP含量74.83μg/kg，但卻不屬于本研究檢測的6種Badh2基因變異類型，有可能是Badh2基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的其他變異類型或者是Badh2基因尚未發(fā)現(xiàn)的新等位基因類型，也有可能是新的香味基因，有待進一步研究。