大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)在STR 遺傳標(biāo)記檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

陶瑞旸，董新宇，陳安琪，呂葉輝，張素華，李成濤

1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；2.上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海201318

從Sanger測(cè)序到焦磷酸測(cè)序，快速DNA 測(cè)序方法的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)展，隨著人們對(duì)低成本、高通量測(cè)序需求的與日俱增，大規(guī)模平行測(cè)序（massively parallel sequencing，MPS）技術(shù)，也被稱為下一代測(cè)序或二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)，在迅速發(fā)展的同時(shí)，其在測(cè)序速度、測(cè)序通量和讀取長(zhǎng)度方面均取得了巨大進(jìn)步[1]?，F(xiàn)今，MPS 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷、微生物組學(xué)和農(nóng)業(yè)基因組學(xué)等諸多研究領(lǐng)域，成為不可或缺的檢測(cè)方法[2-5]。在法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域，MPS 技術(shù)也從十年前的“嶄露頭角”到目前的“略有所成”。隨著越來越多的法醫(yī)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室引入MPS 平臺(tái)，應(yīng)用MPS技術(shù)檢測(cè)法醫(yī)學(xué)相關(guān)遺傳標(biāo)記、解決法醫(yī)科學(xué)問題的研究顯著增長(zhǎng)。正如在其他科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，MPS 技術(shù)可檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入/缺失（insertion/deletion，InDel）等分子遺傳標(biāo)記，同時(shí)也適用于法醫(yī)學(xué)經(jīng)典遺傳標(biāo)記，如線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）控制區(qū)和短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）的檢測(cè)，更為線粒體全基因組測(cè)序、微單體型檢測(cè)等新型法醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了支持。2019 年9 月，在捷克布拉格召開的第28 屆國際法醫(yī)遺傳學(xué)大會(huì)所討論的法醫(yī)遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)，如遺傳標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)、表型推斷、混合樣本檢測(cè)、犯罪現(xiàn)場(chǎng)體液斑鑒定等，均有MPS技術(shù)的參與[6]。

STR 在法醫(yī)遺傳學(xué)中有著不可撼動(dòng)的地位，雖然目前毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）技術(shù)檢測(cè)STR 仍是法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是MPS 技術(shù)用于分析STR 的優(yōu)勢(shì)也吸引了法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域?qū)W者們的廣泛關(guān)注。MPS 平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)之一在于能夠在單個(gè)工作流程實(shí)現(xiàn)數(shù)百甚至數(shù)千種不同的DNA 遺傳標(biāo)記的并行檢測(cè)，另外，其還能確定序列水平的遺傳變異。與傳統(tǒng)的CE 平臺(tái)相比，使用MPS 技術(shù)分析STR 標(biāo)記主要有以下幾大優(yōu)勢(shì)：（1）可同時(shí)檢測(cè)的STR基因座數(shù)量增加；（2）可識(shí)別CE 平臺(tái)無法識(shí)別的STR等位基因序列多態(tài)性，提高STR 基因座的多態(tài)性，從而提高STR 基因座用于個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的系統(tǒng)效能；（3）可并行檢測(cè)多個(gè)DNA 樣本。然而，在全球范圍法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室日常工作中實(shí)現(xiàn)MPS 技術(shù)的普及之前，我們?nèi)孕杳鎸?duì)很多挑戰(zhàn)?？上驳氖牵澜缍鄠€(gè)法醫(yī)DNA 科學(xué)學(xué)會(huì)、工作組，各種跨國研究項(xiàng)目以及提供MPS 技術(shù)的行業(yè)，正在采取多項(xiàng)舉措來應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，對(duì)包括MPS 技術(shù)運(yùn)行成本較高，數(shù)據(jù)龐大、分析困難，缺乏統(tǒng)一的命名和報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)，以及與現(xiàn)有CESTR 數(shù)據(jù)庫相兼容等問題逐步提出建議，同時(shí)促進(jìn)各國實(shí)驗(yàn)室之間的交流，共同發(fā)展。

本文擬概述用于法醫(yī)遺傳學(xué)STR 分子標(biāo)記檢測(cè)的主流MPS 平臺(tái)和原理，回顧MPS 技術(shù)用于STR 檢測(cè)的策略和現(xiàn)狀，介紹針對(duì)STR 標(biāo)記的商品化MPS 檢測(cè)體系及其性能評(píng)估，應(yīng)用廣泛的MPS-STR 數(shù)據(jù)分析工具以及基于MPS-STR 的群體學(xué)調(diào)查研究，總結(jié)現(xiàn)階段世界范圍內(nèi)多個(gè)國際項(xiàng)目、法醫(yī)工作組等為促進(jìn)MPS 技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的各種舉措，討論將MPS技術(shù)應(yīng)用于STR 檢測(cè)所面臨的難題和建議，相信隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，MPS 技術(shù)在法醫(yī)遺傳學(xué)實(shí)踐中將發(fā)揮更大的作用。

1 法醫(yī)遺傳學(xué)常用的MPS 檢測(cè)平臺(tái)

2005 年瑞士Roche 公司推出的454 測(cè)序儀以焦磷酸測(cè)序原理為基礎(chǔ)，開啟了高通量測(cè)序的新紀(jì)元。由于其讀長(zhǎng)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性高，454 測(cè)序儀也是最早用于檢測(cè)法醫(yī)學(xué)STR 標(biāo)記的MPS平臺(tái)[7-8]（2016年停止生產(chǎn)）。目前法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的主要為美國Thermo Fisher Scientific 公司和Illumina 公司提供的測(cè)序平臺(tái)。

1.1 Ion PGMTM、Ion S5TM 系列、Ion GeneStudio S5系列測(cè)序平臺(tái)

自2010—2011 年推出第一臺(tái)半導(dǎo)體測(cè)序儀Ion PGMTM后，Thermo Fisher 公司以Ion TorrentTM技術(shù)為基礎(chǔ)不斷更新和提高其測(cè)序通量、測(cè)序速度和自動(dòng)化程度等，陸續(xù)推出Ion S5TM、Ion S5TMXL、Ion GeneStudio S5 系列測(cè)序平臺(tái)，均適用于法醫(yī)學(xué)研究。以STR 標(biāo)記靶向測(cè)序?yàn)槔?，首先通過擴(kuò)增目標(biāo)STR 片段生成DNA 文庫，并添加條碼和連接接頭以區(qū)分樣本，經(jīng)乳液PCR 對(duì)純化的DNA 文庫進(jìn)行克隆擴(kuò)增；應(yīng)用Ion TorrentTM技術(shù)對(duì)每個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行平行測(cè)序，通過結(jié)合化學(xué)試劑和半導(dǎo)體技術(shù)，將化學(xué)信號(hào)（A、C、G、T）轉(zhuǎn)換成數(shù)字信息，即將核苷酸按順序加入測(cè)序反應(yīng)中，每摻入1 個(gè)或多個(gè)核苷酸會(huì)釋放1 個(gè)或多個(gè)氫離子，該氫離子被半導(dǎo)體芯片上大規(guī)模并行的離子傳感器檢測(cè)到，輸出數(shù)字信息，實(shí)現(xiàn)高靈敏度的堿基檢測(cè)。該過程無修飾的核酸，無需化學(xué)級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)，無需熒光、化學(xué)發(fā)光或復(fù)雜的光路系統(tǒng)。一般而言，半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)的運(yùn)行時(shí)間相對(duì)較短，因?yàn)樾盘?hào)檢測(cè)為實(shí)時(shí)執(zhí)行，而非通過成像完成。但該技術(shù)由于對(duì)多聚核苷酸的檢測(cè)仍不夠完善，在檢測(cè)同一堿基連續(xù)出現(xiàn)時(shí)可能出現(xiàn)測(cè)序錯(cuò)誤[9]。

以上Ion TorrentTM半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)均支持不同通量的半導(dǎo)體芯片，以最大的靈活性幫助研究人員配置MPS 實(shí)驗(yàn)，兼容不同的測(cè)序需求。以最新的Ion GeneStudio S5 系列測(cè)序平臺(tái)為例，可根據(jù)需要選擇5 種芯片（Ion 510、520、530、540 及550）使測(cè)序數(shù)據(jù)通量范圍涵蓋500 Mb（1 張Ion 510 芯片）至50 Gb（Ion GeneStudioTMS5 Prime 系統(tǒng)聯(lián)合2 張Ion 550 芯片）[10]。此外，Ion ChefTM儀器的使用為測(cè)序之前自動(dòng)化的Ion AmpliSeqTM文庫制備和芯片加載提供了解決方案，極大簡(jiǎn)化了工作流程：手工操作時(shí)間短（15 min），節(jié)省精力和時(shí)間；每次運(yùn)行可自動(dòng)制備8 個(gè)文庫樣本或自動(dòng)加載兩張半導(dǎo)體芯片；降低手工加載芯片造成的不穩(wěn)定因素；可實(shí)現(xiàn)樣本追蹤并與Torrent Suite Software（TSS）[11]或?qū)嶒?yàn)室信息管理系統(tǒng)（laboratory information management system，LIMS）結(jié)合。

Thermo Fisher 公司的法醫(yī)學(xué)商品化試劑盒中，除Precision ID GlobalFilerTMNGS STR Panel 檢測(cè)常染色體STR（autosomal STR，A-STR）外，還包括檢測(cè)124 個(gè)SNP 的Precision ID Identity Panel[12]和165 個(gè)SNP 的Precision ID Ancestry Panel[13]，分別用于個(gè)體識(shí)別和祖源推斷，以及檢測(cè)mtDNA 控制區(qū)和全序列的Precision ID mtDNA Control Region Panel[14]和Precision ID mtDNA Whole Genome Panel[15]，均可在Ion PGMTM、Ion S5TM系列和Ion GeneStudio S5 系列測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。然而由于Ion PGMTM平臺(tái)實(shí)驗(yàn)流程較為繁瑣，手動(dòng)操作時(shí)間長(zhǎng)，已逐步淡出人們視野，Thermo Fisher 公司2017 年推出的Precision ID GlobalFilerTMNGS STR Panel v2 亦不再適用于Ion PGMTM平臺(tái)。

1.2 MiSeq FGxTM Forensic Genomics System

MiSeq FGxTMForensic Genomics System（簡(jiǎn)稱MiSeq FGx 測(cè)序平臺(tái)）是Illumina 公司專用于法醫(yī)基因組學(xué)研究的MiSeq 測(cè)序平臺(tái)，目前隸屬于美國Verogen 公司，聯(lián)合Verogen 公司的ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒與ForenSeqTMUniversal Analysis Software（USA 軟件）[16]共同完成從DNA 樣本到200 多個(gè)遺傳標(biāo)記測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出并分析的完整流程。ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒推薦的DNA輸入量為1 ng，其文庫生成包括兩步擴(kuò)增，通過第一步PCR 擴(kuò)增目標(biāo)STR 和SNP，第二步擴(kuò)增連接接頭和唯一索引。加入的接頭序列與芯片流動(dòng)池表面固定的寡核苷酸互補(bǔ)，促使文庫與流動(dòng)池結(jié)合以進(jìn)行橋式擴(kuò)增；索引用于標(biāo)記某一特定DNA 樣本，在一次運(yùn)行中可平行檢測(cè)96 個(gè)樣本。每次運(yùn)行可檢測(cè)的樣本數(shù)目由預(yù)期達(dá)到的測(cè)序深度和芯片通量共同決定，如應(yīng)用ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)芯片同時(shí)檢測(cè)80 個(gè)DNA 文庫樣本，A-STR 的平均測(cè)序深度達(dá)1 800×以上。在測(cè)序之前，將各DNA 文庫樣本混合、變性，并加載到測(cè)序試劑盒中[17]。橋式擴(kuò)增能夠以附著于流動(dòng)池表面的純化文庫為模板，產(chǎn)生數(shù)百萬的單個(gè)DNA 片段克隆簇；通過加入帶有熒光基團(tuán)的可逆終止子標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸（deoxynucleoside triphosphate，dNTP）進(jìn)行讀取，接著切割終止子以允許下一個(gè)堿基的加入，不斷循環(huán)上述過程從而完成邊合成邊測(cè)序（sequencing-by-synthesis，SBS）。每個(gè)測(cè)序循環(huán)中，4 種dNTP 均存在且濃度相同，通過自然競(jìng)爭(zhēng)，最大程度地減少錯(cuò)誤摻入的風(fēng)險(xiǎn)，有效將摻入偏差降至最低[18-19]。由于該過程中的堿基識(shí)別是通過直接測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，因此與其他MPS 方法相比，原始錯(cuò)誤率大大降低[20-22]。在測(cè)序過程中，隨著熒光信號(hào)的減弱，序列后端的堿基準(zhǔn)確性會(huì)受到一定程度影響，成為限制該測(cè)序平臺(tái)讀取長(zhǎng)度的主要原因。目前，F(xiàn)orenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒聯(lián)合MiSeq FGx 測(cè)序平臺(tái)可用于398 bp 長(zhǎng)度內(nèi)DNA文庫的測(cè)序。

目前MiSeq FGx 測(cè)序平臺(tái)上另有商品化試劑盒ForenSeqTMmtDNA Whole Genome 試劑盒[23]和ForenSeqTMmtDNA Control Region試劑盒[24]分別用于檢測(cè)線粒體DNA 全序列和控制區(qū)。此外，美國Promega公司基于MiSeq 測(cè)序平臺(tái)（美國Illumina 公司）推出其PowerSeqTM系列MPS 試劑盒[25]，用于檢測(cè)法醫(yī)學(xué)常用STR 基因座和（或）線粒體DNA 控制區(qū)。HiSeq X、HiSeq 2500 和NextSeq 500 測(cè)序平臺(tái)（美國Illumina公司）也應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)研究，包括進(jìn)行全基因組測(cè)序以甄別同卵雙生子[26]、獲取單個(gè)細(xì)胞DNA 的法醫(yī)學(xué)遺傳信息[27]、獲得遺骸的基因組全測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行家系搜索[27]，也用于檢測(cè)新型法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記[28]及開展法醫(yī)微生物學(xué)研究[29]等。此外，由華大基因推出的國產(chǎn)測(cè)序 儀 如DNBSEQ-T7、MGISEQ-2000 和MGISEQ-200等以DNA 納米球測(cè)序技術(shù)（DNBSEQTM）為核心，性能良好，數(shù)據(jù)輸出準(zhǔn)確性高，目前主要應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，今后或可應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

2 應(yīng)用MPS 技術(shù)檢測(cè)STR 的研究現(xiàn)狀

2.1 商品化STR 檢測(cè)體系及其性能評(píng)估

2013年，Thermo Fisher公司推出了基于Ion PGMTM測(cè)序平臺(tái)的第一個(gè)STR 檢測(cè)體系Ion TorrentTMHID STR 10-plex[30]。應(yīng)用Ion AmpliSeqTM技術(shù)構(gòu)建DNA文庫，半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)進(jìn)行正反向測(cè)序并使用TSS 中的插件分析序列數(shù)據(jù)。該體系與Ion PGMTM測(cè)序平臺(tái)的結(jié)合為MPS-STR 檢測(cè)提供了從PCR 到數(shù)據(jù)分析的首個(gè)集成化解決方案，能夠同時(shí)檢測(cè)CSF1PO、D16S539、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、TH01、TPOX、vWA和Amelogenin10 個(gè)遺傳標(biāo)記。隨后，仍基于Ion PGMTM測(cè)序平臺(tái)，Early Access STR Kit v1[31]和Precision ID GlobalFilerTMNGS STR Panel[32]于2015 年和2016 年相繼問世，分別用于檢測(cè)24 個(gè)和30 個(gè)STR基因座。2018 年Thermo Fisher 公司推出的Precision ID GlobalFilerTMNGS STR Panel v2 能夠同時(shí)檢測(cè)20 個(gè)擴(kuò)展聯(lián)合DNA 檢索系統(tǒng)（combined DNA index system，CODIS）核心STR基因座、11個(gè)non-CODIS STR基因座以及4 個(gè)性別相關(guān)遺傳標(biāo)記。筆者所在的實(shí)驗(yàn)室對(duì)該體系進(jìn)行了初步驗(yàn)證研究[33]，包括其重復(fù)性、結(jié)果一致性、靈敏度、stutter 比例、基因座均衡性、混合物檢測(cè)等。結(jié)果證實(shí)：除Penta D的平均覆蓋深度較低（377×）外，其余基因座均表現(xiàn)良好，平均覆蓋深度為3 946×，可獲得可靠、一致性結(jié)果；當(dāng)DNA 輸入量≥62.5 pg 時(shí)，使用該體系可獲得完整的STR 分型圖譜；混合物中次要貢獻(xiàn)者比例大于25%時(shí)，可獲得其完整STR 分型；該體系可用于血痕、指甲、毛發(fā)等常見法醫(yī)學(xué)檢材的檢測(cè)；使用該體系對(duì)50 個(gè)無關(guān)個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，成功獲得序列多態(tài)性等位基因及STR 側(cè)翼區(qū)域序列變異信息等。此外，該體系文庫構(gòu)建和芯片加載步驟均可在自動(dòng)化操作平臺(tái)Ion ChefTM上進(jìn)行，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程自動(dòng)化程度高，人工處理時(shí)間顯著縮短，有助于該體系在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用。2019 年，Thermo Fisher 公司發(fā)布了將Precision ID STR 和SNP體系（共324 個(gè)遺傳標(biāo)記）共同檢測(cè)的MPS 實(shí)驗(yàn)流程[34]，結(jié)果證實(shí)，當(dāng)DNA 輸入量為1 ng、使用1 張Ion 530 芯片檢測(cè)12 個(gè)參考樣本時(shí)，可獲得完整、準(zhǔn)確的測(cè)序結(jié)果，該共檢測(cè)流程仍需進(jìn)一步研究以驗(yàn)證其性能。

2014 年，基于MiSeq 測(cè)序平臺(tái)，美國Promega 公司推出其MPS-STR 體系的第一個(gè)版本[35]，涵蓋全部13 個(gè)CODIS STR基因座、4 個(gè)non-CODIS STR 基因座以及Amelogenin遺傳標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上，又陸續(xù)推出PowerSeqTMAuto System、PowerSeqTMAuto/Y System和PowerSeqTMAuto/Mito/Y System[25]。其中PowerSeqTMAuto System包括22 個(gè)A-STR基因座、2個(gè)性別相關(guān)遺傳標(biāo)記（Amelogenin和DYS391），評(píng)估實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可輸出穩(wěn)定的一致性結(jié)果，使用62 pg 單一來源DNA 可獲得完整基因型結(jié)果，混合物中次要貢獻(xiàn)者比例大于5%時(shí)可檢測(cè)到其部分基因分型，且該體系成功應(yīng)用于模擬法醫(yī)學(xué)案例樣本的檢測(cè)[36]。2017 年P(guān)romega 公司推出的Auto/Y System，不僅在前者基礎(chǔ)上新加入22 個(gè)Y 染色體STR（Y-chromosome STR，Y-STR）基因座，還對(duì)樣本處理過程進(jìn)行了優(yōu)化，用于減少污染概率或人為失誤事件，提高了實(shí)驗(yàn)效率，同時(shí)亦能保證測(cè)序覆蓋率、結(jié)果一致性、靈敏度等原始數(shù)據(jù)質(zhì)量[37]。而Auto/Mito/Y Panel[25]則 將Auto/Y System 與覆蓋線粒體控制區(qū)的10 個(gè)亞區(qū)（F109、F220、F317、F402、F15989、F16094、F16197、F16363、F16450 和F16533）進(jìn)行結(jié)合，目前未見其他實(shí)驗(yàn)室評(píng)估結(jié)果。

2016 年，CHURCHILL 等[38]對(duì)測(cè)試版ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)估，該試劑盒可基于MiSeq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)63 個(gè)STR 基因座、95 個(gè)常染色體身份信息SNP（identity informative SNP，iiSNP）進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，另外可選擇檢測(cè)其他56 個(gè)祖先信息SNP（ancestry informative SNP，aiSNP）及22 個(gè)表型信息SNP（phenotype informative SNP，piSNP）。結(jié)果表明，該測(cè)試版試劑盒能夠產(chǎn)生可靠且可重復(fù)的測(cè)序結(jié)果，以1 ng DNA 獲得完整分型圖譜，可解析次要貢獻(xiàn)者占5%及以上的混合樣本，并且具有檢測(cè)疑難檢材的能力；僅個(gè)別基因座表現(xiàn)欠佳，該試劑盒可成為法醫(yī)學(xué)DNA 分型的有效工具。隨后，通過改進(jìn)并剔除不佳基因座，商品化試劑盒ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒的引物混合液A 中最終包含58 個(gè)STR基因座［27 個(gè)A-STR、7個(gè)X染色體STR（Xchromosome STR，X-STR）、24個(gè)Y-STR］和94個(gè)iiSNP，引物混合液B 另包含56 個(gè)aiSNP 及22 個(gè)piSNP。GUO等[39]針對(duì)該試劑盒的研究發(fā)現(xiàn)：獲得完整STR 基因座分型圖譜需輸入DNA 不低于100 pg，而對(duì)于SNP，DNA 輸入量需不低于200 pg；次要貢獻(xiàn)者占5%及以上的樣本可被識(shí)別為混合物，占10%以上可獲得次要貢獻(xiàn)者的完整基因分型；該試劑盒可耐受一定濃度的PCR 抑制劑，如≤200 μmol/L 血紅素和≤50 μg/mL 腐殖酸，亦適用于法醫(yī)學(xué)案例樣本和一定程度的降解樣本（≥200 bp 的降解樣品中可獲得56%以上STR 分型結(jié)果和88%以上SNP分型結(jié)果）。總體而言，經(jīng)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室及法醫(yī)研究者的驗(yàn)證和評(píng)估，F(xiàn)orenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒與MiSeq FGx 測(cè)序平臺(tái)和UAS軟件結(jié)合的工作流程性能良好、表現(xiàn)穩(wěn)定、結(jié)果可靠、重復(fù)性好且所得信息量豐富，可滿足法醫(yī)遺傳學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定等應(yīng)用要求[40-43]。

除商業(yè)化MPS-STR 檢測(cè)體系外，一些國內(nèi)外法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室亦自主構(gòu)建了包含常用STR 標(biāo)記的MPS 體系。如基于Ion PGMTM測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)10 個(gè)A-STR[44]和13 個(gè)Y-STR[45]的體系，基于MiSeq 系列測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)23 個(gè)A-STR[46]和23 個(gè)Y-STR[47]的體系等，這些體系所得結(jié)果與CE 分型結(jié)果相比均具有高度一致性。KIM 等[46]構(gòu)建的體系中，擴(kuò)增子長(zhǎng)度短于常用商業(yè)化MPS-STR 及CE-STR 體系，該特性有助于提高降解DNA 分型的成功率；該體系采用與ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒中類似的文庫標(biāo)記方法，與adapter 連接方法相比，可縮短實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間。這些自主研發(fā)體系目前主要用于群體遺傳學(xué)研究。

2.2 MPS-STR 數(shù)據(jù)分析軟件

一般而言，MPS-STR 測(cè)序數(shù)據(jù)分析主要包括3 個(gè)步驟：獲得原始數(shù)據(jù)，與參考基因組對(duì)比，檢出等位基因。大多數(shù)法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室使用2.1 節(jié)提及的公司提供的相應(yīng)分析軟件進(jìn)行MPS-STR 數(shù)據(jù)分析，如Thermo Fisher公司的TSS[11]和Converge 軟 件[48]，Illumina 公司的UAS軟件[16]。這些軟件可顯示包括質(zhì)量控制參數(shù)、測(cè)序讀長(zhǎng)及序列對(duì)比等在內(nèi)的基本信息，并提供測(cè)序數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)輸出文件，如BAM 文件（基因數(shù)據(jù)分析中通用的比對(duì)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)格式）或FASTQ 文件（保存生物序列及其測(cè)序質(zhì)量得分信息的數(shù)據(jù)格式），可用于其他數(shù)據(jù)分析流程或軟件。

Converge 軟件可用于分析來自Precision ID GlobalFilerTMNGS STR Panel v2、Precision ID mtDNA Control Region Panel、Precision ID mtDNA Whole Genome Panel、Precision ID Identity Panel、Precision ID Ancestry Panel 以及其他定制的Ion AmpliSeqTMSNP系統(tǒng)的MPS 數(shù)據(jù)。分析STR 時(shí)，其結(jié)果包括STR 等位基因檢出、基因分型、側(cè)翼區(qū)域SNP 信息（附圖1A）以及亞型雜合基因型（具有相同片段長(zhǎng)度但顯示不同序列的等位基因）的信息。通過與CE 平臺(tái)常用的GeneMapperTMID-X軟件（美國Applied Biosystems 公司）相似的界面，操作者可使用熟悉的等位基因、offladder（OL）峰等指標(biāo)，并根據(jù)需要修改預(yù)配置的分析設(shè)置。此外，Converge 軟件通過將NGS 數(shù)據(jù)分析模塊與“案例管理”應(yīng)用程序一起使用，可簡(jiǎn)化NGS 和CE配置文件的比較；Converge 軟件的親緣/親子關(guān)系模塊可與GeneMapperTMID-X軟件集成在一起，幫助實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化親子關(guān)系和其他親緣關(guān)系分析，并進(jìn)行遺傳似然率（likelihood ratio，LR）計(jì)算。該軟件可進(jìn)行額外配置以滿足特定的實(shí)驗(yàn)室工作流程、標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（standard operating procedure，SOP）和分析參數(shù)，還可使用內(nèi)置于Converge 軟件的插件，將其集成到現(xiàn)有的LIMS 中，提高法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)處理效率。

UAS 軟件安裝在一個(gè)獨(dú)立的服務(wù)器上，從測(cè)序運(yùn)行設(shè)置到樣本數(shù)據(jù)進(jìn)入最終的數(shù)據(jù)分析和報(bào)告生成階段，控制整個(gè)測(cè)序流程，能夠?qū)\(yùn)行指標(biāo)和樣本質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估，實(shí)現(xiàn)同時(shí)針對(duì)200 多個(gè)法醫(yī)學(xué)相關(guān)STR 和SNP 進(jìn)行最終數(shù)據(jù)分析，包括多重基因座分離、序列比對(duì)、等位基因檢出、基因分型和報(bào)告輸出。此外，UAS 軟件具有靈敏的質(zhì)量控制指標(biāo)、自動(dòng)樣本比較及群體參數(shù)統(tǒng)計(jì)的功能，有助于進(jìn)行數(shù)據(jù)審查和其他下游分析，還可依據(jù)世界主要人種的群體數(shù)據(jù)，以主成分分析（principal component analysis，PCA）圖的方式呈現(xiàn)基于aiSNP 的祖源推斷結(jié)果等。然而該軟件有兩個(gè)主要的缺點(diǎn)：（1）以具體堿基序列輸出STR 結(jié)果（如ATCGATCG），而非重復(fù)結(jié)構(gòu)和重復(fù)次數(shù)（如[ATCT]2），難以統(tǒng)計(jì)；（2）界面未顯示STR 側(cè)翼區(qū)域信息，雖可導(dǎo)出側(cè)翼區(qū)域報(bào)告，但針對(duì)序列變異只顯示不同顏色而不輸出變異的位置、rs 編號(hào)等信息（附圖1B），這對(duì)于復(fù)雜親緣關(guān)系和混合物的分析十分重要。

Converge 軟件和UAS 軟件僅用于分析其特定的MPS-STR 體系，若法醫(yī)工作者自主構(gòu)建MPS-STR 體系，則可使用STRinNGS、STRait Razor 及FDSTools 等工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中，STRinNGS 的更新版本STRinNGS v2.0 是一個(gè)集成的python 腳本，其Docker鏡像或zip 文件可供下載使用[49]。STRinNGS v2.0 用于預(yù)測(cè)基因型的指標(biāo)涉及測(cè)序深度、背景噪聲、側(cè)翼區(qū)域長(zhǎng)度以及側(cè)翼區(qū)域中的堿基錯(cuò)配、基因座平衡和雜合子均衡性等。其結(jié)果表中，另以“Warning flags”突出顯示可疑基因型或未被識(shí)別為等位基因（或噪聲）的可疑序列，提示可能需手動(dòng)分析。STRinNGS v2.0分析STR 及側(cè)翼區(qū)域，根據(jù)STRidER 數(shù)據(jù)庫最新指南（https://strider.online/nomenclature）命名等位基因，包括側(cè)翼區(qū)域的變異。此外，STRinNGS v2.0 還可生成可直接上傳STRidER 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)文件格式，提高工作效率。附表1 總結(jié)了近年來用于MPS-STR 數(shù)據(jù)分析的軟件[50-60]。

2.3 基于MPS-STR 的群體遺傳學(xué)調(diào)查

國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)（International Society for Forensic Genetics，ISFG）DNA委員會(huì)于2016年發(fā)布了法醫(yī)學(xué)MPS-STR 序列結(jié)構(gòu)指南[61]，后更新于2018 年[62]。2017 年，F(xiàn)orensic Science International：Genetics期刊就MPS 產(chǎn)生的群體遺傳學(xué)STR 數(shù)據(jù)作出建議[63]，包括：（1）最少需50 例無關(guān)個(gè)體數(shù)據(jù)；（2）需上傳含有序列全部信息的FASTA 格式文件，依據(jù)ISFG 最新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行命名；（3）不允許等位基因漏檢（dropout）；（4）需提交STRidER 數(shù)據(jù)庫（https://strider.online/）得到質(zhì)量控制結(jié)果等。

美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）與美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）聯(lián)合啟動(dòng)了STR 測(cè)序計(jì)劃（STRSeq[64]，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/380127），研究和儲(chǔ)存基于序列特異性的STR 等位基因，用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別。STRSeq 項(xiàng)目中的初始數(shù)據(jù)來自4 個(gè)國際實(shí)驗(yàn)室4 612 個(gè)個(gè)體［NIST（n=1 786）、倫敦國王學(xué)院（n=1 043）、北得克薩斯州大學(xué)健康科學(xué)中心（n=839）和圣地亞哥德孔波斯特拉大學(xué)（n=944）］的靶向測(cè)序所觀察到的等位基因匯總。STRSeq 數(shù)據(jù)在NCBI 中擁有與GenBank 記錄穩(wěn)定鏈接的STR 序列目錄，每個(gè)等位基因包含STR 重復(fù)區(qū)域完整序列、STR 重復(fù)區(qū)域的位置、側(cè)翼區(qū)域堿基突變的位置和rs 編號(hào)（來自dbSNP 數(shù)據(jù)庫）、測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量、相應(yīng)的長(zhǎng)度特異性等位基因等。這些數(shù)據(jù)經(jīng)NCBI 中的BioProject 管理分為A-STR、備用A-STR、Y-STR 和X-STR，可通過瀏覽器搜索、BLAST 搜索或ftp 下載訪問。STRSeq 項(xiàng)目為進(jìn)行MPS-STR 人群樣本研究的實(shí)驗(yàn)室提供了新觀察到序列特異性等位基因的上傳和交流途徑。

其中，圣地亞哥德孔波斯特拉大學(xué)的PHILLIPS等[65]應(yīng)用ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒和MiSeq FGx 測(cè)序平臺(tái)對(duì)人類多態(tài)性研究中心（Centre d’Etude du Polymorphisme Humain，CEPH）的人類基因組多樣性計(jì)劃（Human Genome Diversity Project，HGDP）中944 個(gè)個(gè)體進(jìn)行了測(cè)序研究，這批樣本來自世界范圍內(nèi)51 個(gè)不同人群。該研究詳細(xì)報(bào)告了ForenSeqTMDNA Signature Prep試劑盒中58個(gè)STR基因座內(nèi)部的序列變異；依據(jù)人類參考基因組GRCh38進(jìn)行STR 重復(fù)區(qū)域結(jié)構(gòu)標(biāo)識(shí)，對(duì)其輸出的20 個(gè)STR基因座，需先獲得其反向互補(bǔ)序列并重新對(duì)比參考基因組；序列特異性所帶來的等位基因數(shù)目和雜合基因型數(shù)目的增長(zhǎng)特別表現(xiàn)在D12S391、D21S11、D2S1338、D3S1138、D9S1122、DXS10135、DYS389Ⅰ/Ⅱ和DYF387S1基因座。由于少數(shù)特殊的序列變異僅發(fā)生在個(gè)別樣本中，就HGDP-CEPH 中的樣本量而言，無法對(duì)該低頻率STR 等位基因作出可靠判斷，因此，仍建議擴(kuò)大MPS 平臺(tái)檢測(cè)STR 的樣本量規(guī)模。此外，PHILLIPS 等也指出：該檢測(cè)體系包含1 個(gè)高度多態(tài)性STR 基因座SE33，但UAS 軟件并不輸出其測(cè)序結(jié)果；DYS460和DYS461均包含在檢測(cè)體系中，但只輸出DYS460的結(jié)果；建議輸出一些位于側(cè)翼區(qū)域多態(tài)性較高的SNP（如rs4847015、rs25768、rs16887642、rs11642858），并注意與特定STR 等位基因連鎖遺傳的側(cè)翼SNP 等。

附表2 總結(jié)了近年來國內(nèi)外學(xué)者基于MPS-STR數(shù)據(jù)所展開的群體遺傳學(xué)調(diào)查研究[32-33，42，44-47，66-86]，在世界不同人群中檢測(cè)得到大量新的STR序列多態(tài)性等位基因（STR 重復(fù)區(qū)域內(nèi)和側(cè)翼區(qū)域的變異），可顯著提高這些法醫(yī)相關(guān)STR 基因座的識(shí)別能力和系統(tǒng)效能，對(duì)各群體中個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定等法醫(yī)學(xué)應(yīng)用具有重要意義。眾所周知，CE技術(shù)檢測(cè)STR標(biāo)記自20世紀(jì)90年代以來開始應(yīng)用于法醫(yī)日常工作[87]，經(jīng)過30年的積累，世界不同人群幾乎均有相應(yīng)的CE-STR 群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，我國數(shù)據(jù)庫中亦儲(chǔ)存有大量CE-STR 數(shù)據(jù)可應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐。MPS 技術(shù)自2010 年用于法醫(yī)STR檢測(cè)，其成熟應(yīng)用需要時(shí)間和實(shí)踐，只要越來越多的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用MPS 技術(shù)檢測(cè)DNA 樣本，收集MPSSTR 數(shù)據(jù)，就能逐漸建立起信息量更為豐富的MPSSTR 數(shù)據(jù)庫。

3 MPS-STR 命名建議

將MPS 技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐，需實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)和共享，就每個(gè)STR 基因座的等位基因命名和注釋而言，需采用國際化的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化框架。所用命名法一方面應(yīng)與各國家DNA 數(shù)據(jù)庫和人群調(diào)查數(shù)據(jù)庫中使用的基于CE 平臺(tái)的STR 命名法相兼容，另一方面應(yīng)包括MPS 所檢測(cè)到的所有STR 相關(guān)序列變異（STR重復(fù)區(qū)和側(cè)翼區(qū)），并允許不同法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室和數(shù)據(jù)庫之間互相檢索和查閱。就MPS-STR 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化命名，ISFG 的DNA 委員會(huì)從序列信息、與參考基因組的對(duì)比和等位基因注釋3 個(gè)不同水平提出了初步建議：

（1）進(jìn)行MPS 分析時(shí)應(yīng)輸出STR 序列，并將其以文本形式保存于數(shù)據(jù)庫中，以獲得最大程度的有效信息。

（2）應(yīng)用DNA 正鏈進(jìn)行序列與參考基因組的比對(duì)。

（3）參考基因組GRCh38 或GRCh37 的選擇對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化STR 命名至關(guān)重要。目前，建議使用新版本GRCh38 進(jìn)行序列比對(duì)、定義STR 重復(fù)區(qū)域及輸出堿基變異（如SNP）。

（4）對(duì)于目前以DNA 反鏈定義STR 重復(fù)區(qū)域的基因座，需要重新以正鏈定義，嚴(yán)格明確其起止位置基因組坐標(biāo)。

（5）今后可能會(huì)采用更簡(jiǎn)易的MPS-STR 命名系統(tǒng)以達(dá)到溝通和數(shù)據(jù)交流的目的，為確保當(dāng)前MPSSTR 數(shù)據(jù)能為將來所用，現(xiàn)階段依然建議采用全面、完整的命名法?；赟TR 序列信息將其命名為CE 中相應(yīng)的依據(jù)片段長(zhǎng)度的、描述重復(fù)次數(shù)的命名，即與CE 片段長(zhǎng)度命名法相兼容，同時(shí)記錄STR 序列信息，包括側(cè)翼序列及其起止位置基因組坐標(biāo)，如D13S317[CE12]-Chr13-GRCh38 82148025-82148068 [TATC]1282148001-A；82148069-T。

（6）使等位基因頻率數(shù)據(jù)庫保持更新，以充分發(fā)揮MPS-STR 數(shù)據(jù)帶來的更高的識(shí)別能力。

（7）未來法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的MPS-STR 多重檢測(cè)體系應(yīng)保留現(xiàn)有遺傳標(biāo)記以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)接，同時(shí)依據(jù)群體學(xué)、分子生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)研究者與生物公司之間的數(shù)據(jù)共享進(jìn)行更多遺傳標(biāo)記的篩選。

（8）仍需努力確立統(tǒng)一的命名標(biāo)準(zhǔn)體系，實(shí)現(xiàn)全球人口數(shù)據(jù)庫的兼容性。

ISFG DNA 委員會(huì)在2016 年的法醫(yī)學(xué)MPS-STR命名規(guī)則[61]中特別提到，以DNA 反鏈進(jìn)行基因組序列比對(duì)的23 個(gè)STR 基因座，轉(zhuǎn)換為正鏈后，其中17 個(gè)存在潛在移碼現(xiàn)象，并以D19S433、DYS389Ⅰ/Ⅱ和DYS385a/b基因座為例，詳述了該情況。目前MPS 數(shù)據(jù)分析軟件，如Converge v2.0，即應(yīng)用該23 個(gè)STR 的反鏈進(jìn)行對(duì)比，以保持與CE-STR 的長(zhǎng)度分析結(jié)果相兼容。文中另以D18S51、D13S317和D19S433為例，說明了MPS 生成的詳細(xì)序列信息在某些情況下也為描述既定的STR 重復(fù)基序帶來了潛在困難。此外，文中還提供了法醫(yī)學(xué)常用35 個(gè)A-STR、29 個(gè)Y-STR 和7 個(gè)X-STR 的STR 重復(fù)區(qū)及側(cè)翼區(qū)（上、下游各50 bp）人類基因組參考序列（正鏈，GRCh37 和GRCh38 坐標(biāo)）等信息。2018 年，PHILLIPS 等[62]對(duì)2016 年的版本[61]進(jìn)行了修訂和擴(kuò)展，現(xiàn)共包括71 個(gè)A-STR、48 個(gè)Y-STR 和14 個(gè)X-STR 的上述信息及各自上、下游100 bp 的側(cè)翼序列。目前，該STR 序列結(jié)構(gòu)文件作為法醫(yī)遺傳學(xué)中進(jìn)行MPS-STR 分析的最新參考標(biāo)準(zhǔn)，可在STRider 網(wǎng)站（https://strider.online/nomenclature）下載使用。

4 MPS-STR 數(shù)據(jù)保存

STR 標(biāo)記的CE 基因分型文件主要包括樣本編號(hào)、基因座名稱和基因分型，也可添加峰高、所用STR試劑盒等額外信息。針對(duì)CE-STR 的等位基因，全球公認(rèn)且統(tǒng)一為基于長(zhǎng)度多態(tài)性進(jìn)行命名，各法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室及STR 試劑盒生產(chǎn)公司均以此為標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于MPSSTR，盡管ISFG DNA 委員會(huì)的專家學(xué)者提出了一些建議和舉措[61-62]，但仍未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序平臺(tái)和命名準(zhǔn)則。鑒于世界范圍內(nèi)大多數(shù)國家仍在發(fā)展擴(kuò)大其國家STR 數(shù)據(jù)庫（主要為CE 數(shù)據(jù)），上述ISFG 建議使用的既與CE 命名相兼容又可收集所有序列變異的MPS-STR 命名法有利于STR 數(shù)據(jù)庫的檢索及法醫(yī)學(xué)報(bào)告中MPS-STR 數(shù)據(jù)的應(yīng)用。然而由于堿基序列的多樣性，即使采用標(biāo)準(zhǔn)化的命名法，僅用較簡(jiǎn)短的文本字符來描述MPS 所識(shí)別的所有STR 序列多態(tài)性等位基因仍然非常困難。

YOUNG 等[88]認(rèn)為，基于ISFG 發(fā)布的MPS-STR 相關(guān)命名格式雖然滿足了序列特異性標(biāo)記的要求，但對(duì)于軟件識(shí)別或數(shù)據(jù)庫保存來說該格式長(zhǎng)度過長(zhǎng)，于是提出了序列標(biāo)識(shí)符（sequence identifier，SID）編碼法來解決這個(gè)問題，該方法使用哈希函數(shù)SHA-256 將DNA 序列轉(zhuǎn)換為54 或55 個(gè)字母的SID，生成用于標(biāo)識(shí)單一來源或案例樣本STR 序列的唯一短標(biāo)簽。根據(jù)具體應(yīng)用，某樣本STR 基因座的序列特異性等位基因可僅用2～3 個(gè)SID 字符進(jìn)行標(biāo)記（如“6TK”表示TH01[CE6]-Chr11-GRCh38-2171088-2171115[AATG]6），從而使記錄格式緊湊。SID 標(biāo)簽亦可用于識(shí)別和過濾非等位基因序列（如stutter），并且具有區(qū)分等位基因與非等位基因序列的能力。該編碼法還適用于接受任何字符值（而非數(shù)字值）的軟件進(jìn)行下游混合物分析，如與ArmedXpert 軟件中MixtureAce 插件的聯(lián)合應(yīng)用。

JUST 等[89]建議使用最長(zhǎng)不間斷延伸（longest uninterrupted stretch，LUS）的方法表示STR 重復(fù)區(qū)域內(nèi)的序列變異，有利于NGS 分型結(jié)果在概率解釋中的分析應(yīng)用，避免了進(jìn)行字符串搜索所帶來的算法復(fù)雜性。LUS 指STR 重復(fù)區(qū)域中連續(xù)相同的重復(fù)基序最多的重復(fù)次數(shù)，聯(lián)合命名由基因座名稱、基于長(zhǎng)度的等位基因和LUS（以粗體表示）組成，如D12S39120_12 表示D12S391基因座上[AGAT]12[AGAC]7AGAT等位基因。然而一些基因座的多個(gè)等位基因可能具有相同的代號(hào)，如上述D12S39120_12 也可表示[AGAT]12[AGAC]8。通過將其命名擴(kuò)展到二級(jí)或三級(jí)參考區(qū)域，該聯(lián)合命名法可表示80%以上MPS-STR的等位基因。但該方法在少數(shù)基因座上無法區(qū)分等位基因，以D21S11為例，該基因座上存在5 個(gè)常見基序的變異（以粗體n表示）[TCTA]n[TCTG]n[TCTA]nTA[TCTA]nTCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]n。LUS命名等位基因的方法保持了先前基于重復(fù)基序的命名法，因此能夠與現(xiàn)有STR 數(shù)據(jù)庫相兼容，且LUS 的長(zhǎng)度本身保持一致，不會(huì)因NGS 體系或分析軟件的不同而改變。此外，當(dāng)分析軟件（如LRmix Studio v2.1.3）不要求等位基因只能為整數(shù)時(shí)，可應(yīng)用LUS 法標(biāo)識(shí)等位基因，其包含的序列信息有助于對(duì)樣本（單一或混合來源）STR 分型結(jié)果的解釋。GILL 教授亦將LUS 等位基因命名法應(yīng)用于EuroForMix 軟件[90]，證實(shí)了該方法的適用性[91]。雖然該方法無法表示STR 側(cè)翼區(qū)域的堿基變異，但很大程度上彌補(bǔ)了目前基于STR 長(zhǎng)度的概率解釋系統(tǒng)的不足，促進(jìn)了MPS 技術(shù)在法醫(yī)遺傳學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用。

DNASeqEx 項(xiàng)目提出了將Nomenclature Authority（NOMAUT）系統(tǒng)用于STR 數(shù)據(jù)庫的保存和對(duì)接[92]，該系統(tǒng)是一個(gè)在線存儲(chǔ)庫，建立在已知的序列變異STR基因分型結(jié)果上，可較為便捷且安全地輸入新增數(shù)據(jù)。已知序列變異的STR 結(jié)果和其對(duì)應(yīng)的CE-STR 結(jié)果形成目錄，可進(jìn)行序列特異性等位基因的查詢；允許用戶上傳序列，以小寫字母表示數(shù)據(jù)庫中新的序列特異性等位基因（如D1S165611+a），若為數(shù)據(jù)庫中已有等位基因則轉(zhuǎn)換為大寫字母（如D1S165611+A），經(jīng)確定后納入系統(tǒng)目錄中保存，完成系統(tǒng)的自我更新。為確保其可靠性和實(shí)用性，NOMAUT 被構(gòu)建為一種網(wǎng)頁服務(wù)，而非本地軟件，并允許各MPS-STR 數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)NOMAUT 數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)用，另外，其也可離線使用，但需保證數(shù)據(jù)庫定期更新。NOMAUT 系統(tǒng)將來可作為STR 序列等位基因的集中存儲(chǔ)庫，從而在世界范圍內(nèi)保證MPS-STR 數(shù)據(jù)的一致性、穩(wěn)定性和高質(zhì)量。

KNIJFF 教授提出，可以考慮應(yīng)用類似人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）系統(tǒng)的等位基因編碼系統(tǒng)[93]命名MPS-STR，其優(yōu)點(diǎn)是STR 序列多態(tài)性等位基因可以重新編碼為很短的等位基因代號(hào)，方便機(jī)器對(duì)比和儲(chǔ)存，如上文提到的SID 編碼。但同時(shí)，法醫(yī)工作者需要很長(zhǎng)時(shí)間去識(shí)別這些編碼，且編碼的應(yīng)用使MPS-STR 數(shù)據(jù)失去了與CE-STR 命名的直接關(guān)聯(lián)，也無法直接觀察到序列變異。其實(shí)，簡(jiǎn)化STR 序列信息并不是必需的，用較長(zhǎng)而完整的文本字符儲(chǔ)存等位基因不失為一種方法。總之，我們依然期待早日能夠達(dá)成一個(gè)信息全面、實(shí)用的法醫(yī)MPSSTR 統(tǒng)一命名系統(tǒng)，以避免模棱兩可、不準(zhǔn)確、不一致的等位基因命名，甚至可自動(dòng)命名基于序列特異性的MPS-STR等位基因，從而便于法醫(yī)學(xué)工作者進(jìn)行MPSSTR 數(shù)據(jù)的有序儲(chǔ)存、搜索和更新。

5 存在的問題及前景展望

在MPS 技術(shù)替代CE 成為常規(guī)的法醫(yī)遺傳學(xué)檢測(cè)工具之前，我們?nèi)杂泻芏喙ぷ饕?，主要涉及完備的使用指南、?guī)范，以期為所有可能的技術(shù)問題、結(jié)果解釋和報(bào)告內(nèi)容提供參照標(biāo)準(zhǔn)。此外，還需解決諸多實(shí)際問題，包括如何將MPS 檢測(cè)的STR 序列多態(tài)性等位基因（包括側(cè)翼區(qū)域的遺傳變異）與各國現(xiàn)有STR 數(shù)據(jù)庫相兼容等。與CE 技術(shù)相比，不同的MPS 檢測(cè)平臺(tái)、分析軟件無疑會(huì)產(chǎn)生更多的問題，使得制定統(tǒng)一、完備的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)變得更加復(fù)雜。目前主要涉及以下問題：

（1）基于MPS 技術(shù)的STR 等位基因應(yīng)確立統(tǒng)一命名方式，命名需盡量能夠觀察到遺傳變異的全部信息而無需回溯原始測(cè)序數(shù)據(jù)。

（2）對(duì)MPS 相關(guān)運(yùn)行參數(shù)的建議，包括目標(biāo)靶點(diǎn)的最低測(cè)序深度、堿基識(shí)別正確率、堿基識(shí)別質(zhì)量等。

（3）對(duì)于法醫(yī)學(xué)中不同類型樣本獲得可靠STR 等位基因所需的最低測(cè)序深度的建議，如分別針對(duì)構(gòu)建數(shù)據(jù)庫的參考樣本、單一來源樣本或犯罪現(xiàn)場(chǎng)混合樣本的建議。

（4）有關(guān)非目標(biāo)靶點(diǎn)的測(cè)序讀數(shù)、測(cè)序產(chǎn)生的錯(cuò)誤讀數(shù)等的建議，包括用于標(biāo)記樣本的barcode 和index 的讀數(shù)等。

（5）關(guān)于所使用MPS 技術(shù)的建議。reads 1 和reads 2 分別進(jìn)行正、反向測(cè)序，存在STR 重復(fù)序列結(jié)構(gòu)難以組裝和比對(duì)的問題；只使用正向測(cè)序結(jié)果，其長(zhǎng)度取決于MPS 平臺(tái)，存在能否檢測(cè)PCR-STR 擴(kuò)增子的全長(zhǎng)等問題。

（6）關(guān)于存儲(chǔ)MPS 所得結(jié)果的格式的建議。

（7）針對(duì)MPS-STR 分析軟件提出要求。之前開發(fā)的軟件，多采用與CE-STR 結(jié)果相匹配的命名方式，建議調(diào)整為基于MPS 技術(shù)的新等位基因命名法；至少應(yīng)輸出“（6）關(guān)于存儲(chǔ)MPS 所得結(jié)果的格式的建議”中的格式。

迄今為止，法醫(yī)學(xué)研究者們?cè)趹?yīng)用MPS 技術(shù)檢測(cè)STR 標(biāo)記方面已然取得了階段性成果。針對(duì)不同生物公司開發(fā)的用于檢測(cè)不同STR 標(biāo)記的商品化MPS-STR 體系（或STR 聯(lián)合SNP 檢測(cè)體系）進(jìn)行了充分的驗(yàn)證研究，結(jié)果說明這些體系靈敏性高，能夠得到可重復(fù)、可靠的結(jié)果，證實(shí)了MPS-STR 檢測(cè)能夠達(dá)到法醫(yī)DNA 工作的要求。研究中幾乎都進(jìn)行了MPSSTR 數(shù)據(jù)與CE-STR 數(shù)據(jù)的一致性對(duì)比，有助于MPSSTR 數(shù)據(jù)與現(xiàn)在CE-STR 數(shù)據(jù)庫的對(duì)接。MPS-STR數(shù)據(jù)分析是研究工作中的一大難題，除了商品化分析軟件，也涌現(xiàn)出很多優(yōu)秀的可用于自主構(gòu)建MPSSTR 體系的數(shù)據(jù)分析軟件和方法，這將在很大程度上促進(jìn)MPS-STR 研究的發(fā)展。近年來基于MPS-STR數(shù)據(jù)的群體學(xué)調(diào)查研究表明，相對(duì)于常規(guī)的CE 檢測(cè)，MPS 技術(shù)提高了STR 標(biāo)記的多態(tài)信息含量和雜合度，檢測(cè)到大量新的序列特異性等位基因，提高了STR 體系的系統(tǒng)效能，這不僅有利于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定，也為混合物的檢測(cè)和解析提供了新的機(jī)會(huì)。此外，在MPS 檢測(cè)中使用較短的擴(kuò)增子有助于法醫(yī)工作中降解檢材和微量檢材的檢測(cè)。ISFG和其他法醫(yī)學(xué)組織為MPS-STR 命名方法、數(shù)據(jù)儲(chǔ)存、與CE-STR 數(shù)據(jù)庫對(duì)接等問題做出了努力，STRSeq[64]和DNASeqEx[92]等合作項(xiàng)目促進(jìn)了法醫(yī)工作者的交流。盡管針對(duì)上述待解決問題，我們?nèi)匀蝗狈ψ銐蚯铱煽康慕?jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)，然而世界范圍內(nèi)越來越多的法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開始關(guān)注并開展MPS 技術(shù)的研究，期待法醫(yī)工作者堅(jiān)持不懈，共同推動(dòng)MPS 技術(shù)在STR 標(biāo)記基因分型方面的應(yīng)用與發(fā)展。