外泌體microRNA 在心血管疾病中的研究進展及其法醫(yī)學應用前景

馬曉楠，路陸，黃琰潼，岑昌謙，蘇楓元，施翌，曹志鵬

1.中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院 遼寧省法醫(yī)學生物證據重點實驗室，遼寧 沈陽 110122；2.中國醫(yī)科大學臨床三系，遼寧 沈陽 110122；3.南通市海門區(qū)公安局，江蘇 南通226100

外泌體是來源于多種細胞（如平滑肌細胞、內皮細胞、干細胞等）的納米級雙層膜囊泡，廣泛存在于血液、尿液及唾液等體液中。外泌體內含有蛋白質、微小RNA（microRNA，miRNA）、DNA 等，其中miRNA 是一類長度為21～25 nt 且高度保守的非編碼小RNA，由真核細胞自身產生，屬于內源性非編碼單鏈RNA，在器官形成、表觀調控等方面起到重要作用。近年來，外泌體miRNA 在生物體生長發(fā)育、細胞增殖分化、疾病發(fā)生發(fā)展中的作用被大量研究，其在心血管疾病的預測、治療、預后中的價值被廣泛證實。

心臟性猝死是法醫(yī)學鑒定工作中的重要內容，但在實際鑒定中，缺乏典型形態(tài)學改變的心臟性猝死成為法醫(yī)學鑒定的難題之一。有研究[1]表明，心臟性猝死者心肌組織中一些miRNA 呈特異性表達。因此，本文就外泌體miRNA 的生物學特征及其與心血管疾病的關系以及在法醫(yī)學中的應用前景進行綜述，以期為臨床心血管疾病的治療及心臟性猝死的法醫(yī)學鑒定提供參考。

1 外泌體miRNA 的生物學特征

1.1 外泌體miRNA 的形成

外泌體的形成經歷一系列復雜的細胞內分泌過程，主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，多囊泡體可與細胞膜融合形成外泌體釋放到細胞外[2]。

miRNA 由相關基因在細胞核內經歷轉錄、剪接、修飾等過程并經轉運蛋白運送至細胞質，在胞質中與外泌體靶向結合成為外泌體miRNA，然而其具體機制尚不明確，可能與類泛素化的不均一核糖核蛋白A2/B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，hnRNP A2/B1）有關，hnRNP A2/B1 可識別并結合不同miRNA 表面的特異性序列，控制其與外泌體的靶向結合[3]。

1.2 外泌體miRNA 的特性

在生理刺激或病理狀態(tài)下，多種活性細胞可分泌直徑為30～100 nm 的外泌體，內含蛋白質、miRNA、DNA 等[4]。外泌體miRNA 具有以下特性：（1）高度穩(wěn)定性。外泌體具有雙層脂膜結構，具有高度的生物學穩(wěn)定性，可抵御低溫冷藏和酶的降解[5]。（2）組織特異性。外泌體可來源于多種活性細胞，不同來源的外泌體因其表面標志物的不同具有組織特異性[6]，可通過分析miRNA 表達譜鑒定外泌體來源細胞。（3）細胞病理生理狀態(tài)的指示性。由于外泌體miRNA 一般在細胞缺氧、壞死等特殊病理生理狀態(tài)下產生，且外泌體內容物的成分與其分泌細胞的病理生理狀態(tài)密切相關，因而具有診斷價值[7]。除此之外，納米級的外泌體因其天然無毒、易獲取且可穿過生物屏障等特性成為理想的藥物和基因運載體。

1.3 外泌體miRNA 的效應機制

外泌體廣泛存在于血液、尿液等體液中，可通過膜融合、信號介導或內吞作用等方式進入靶細胞，也可釋放miRNA 等生物活性物質進入靶細胞。MONTECALVO 等[8]發(fā)現(xiàn)，外泌體通過內吞作用進入靶細胞后可釋放內容物，實現(xiàn)分泌細胞與靶細胞的信息傳遞，進而誘導靶細胞生理狀態(tài)發(fā)生相應改變。外泌體miRNA 進入靶細胞后，可與靶基因mRNA 的3′端非翻譯區(qū)結合，誘導靶RNA 降解或抑制其翻譯，從而調節(jié)靶細胞生理過程。

2 外泌體miRNA 與心血管疾病

2.1 外泌體miRNA 與動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是引起腦梗死、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等疾病的主要原因，其過程與內皮細胞功能障礙、平滑肌細胞的遷移及增生等有關。而外泌體miRNA 可以通過調控上述過程影響動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。ZHENG 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，富含微小RNA-155（miR-155）的外泌體可作用于內皮細胞，通過下調緊密連接蛋白的表達抑制內皮細胞增殖遷移，最終促進動脈粥樣硬化進程。FANG等[10]通過對成年豬動脈miR-10 基因位點的處理，詮釋了外泌體miR-10 參與動脈粥樣硬化內皮細胞促炎表型的調控。TAN 等[11]通過小鼠動脈血栓形成模型發(fā)現(xiàn)，來自血小板的外泌體miR-223 可抑制血管平滑肌細胞增殖遷移，從而抑制動脈粥樣硬化進程。HERGENREIDER 等[12]在小鼠動脈血栓模型中發(fā)現(xiàn)，富含miR-143 和miR-145 的外泌體可導致平滑肌細胞表型改變，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，減少動脈粥樣硬化面積。此外，通過調節(jié)特定外泌體的表達，如上調外泌體miRNA-146a[13]或抑制外泌體miRNA-302a[14]的表達，不僅可以減輕炎癥反應，而且可以縮小動脈粥樣硬化范圍。因此，外泌體miRNA 在動脈粥樣硬化的進展過程中有著重要作用，這為臨床研究動脈粥樣硬化的治療提供了新思路。

2.2 外泌體miRNA 與缺血性心臟病

缺血性心臟病是由多種因素引起的心臟血液灌注不足及供氧減少造成的，心肌持續(xù)缺血會導致心肌細胞局部的不可逆性壞死，病情兇險且病死率高。近年來，大量研究已經證實外泌體miRNA 在缺血性心臟病的預測、診斷及預后方面具有重要作用。BOSTJANCIC 等[15]在心肌梗死（myocardial infarction，MI）的患者及動物模型中發(fā)現(xiàn)，外泌體源性miR-1、miR-133a、miR-208a 以及miR-499-5p 在外周循環(huán)中顯著升高，而在小鼠心肌梗死模型的缺血心肌中表達明顯降低，提示缺血的心肌組織會將特異性外泌體miRNA 釋放到外周循環(huán)中，因此，其可作為預測心肌梗死的生物標志物。研究[16]證實，檢測外周循環(huán)中心肌源性miRNA 的水平（如miR-208a、miR-208b、miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-126、miR-199a 等）對于急性心肌梗死的診斷有極高的價值。除血液樣本外，心肌梗死患者及動物的尿液中外泌體miR-1、miR-208 也明顯升高[17]，這意味著與血液檢查相比，尿液檢查作為無創(chuàng)性診斷方法，在心肌梗死診斷中可能具有更大的價值[18]。除診斷及預測價值外，外泌體miRNA也與心肌梗死的預后具有相關性[19-20]。RIBEIRORODRIGUES等[21]發(fā)現(xiàn)，缺血心肌細胞中的外泌體miR-143 和miR-222 可以促進內皮細胞增殖和血管形成。SUN 等[22]通過大鼠心肌缺血模型發(fā)現(xiàn)，缺血和缺氧條件下外泌體miR-486-5p 可抑制心肌細胞凋亡，這為外泌體源性miRNA 在臨床治療心肌缺血方面提供了新思路。雖然具體機制有待研究，但這為外泌體miRNA 在心肌梗死后心肌修復與血管生成治療中的應用提供了理論支持。

2.3 外泌體miRNA 與心律失常

心律失常是心臟活動的起源和（或）傳導障礙導致心臟搏動的頻率和（或）節(jié)律異常。WANG 等[23]發(fā)現(xiàn)，多種外泌體miRNA 在持續(xù)性心房顫動和竇性心律患者血漿中存在差異性表達，其中miR-483-5p、miR-142-5p 與心房顫動相關，顯示了外泌體miRNA在心房顫動診斷與預后中的巨大潛力。MUN 等[24]則進一步證實了這些差異表達的miRNA 與心房顫動相關的信號傳導、氧化應激和纖維化等過程有關。然而，血清miRNA 在心律失常中的變化仍存在爭議，這可能與發(fā)病類型、個體異質性等有關[25]。

2.4 外泌體miRNA 與心肌病

心肌病是心肌結構或功能異常的一組異質性心肌疾病，表現(xiàn)為心室異常的肥厚或擴張。VANDERGRIFF等[26]報道，在擴張性心臟病的小鼠模型中，心臟干細胞可高表達外泌體miR-22、miR-24、miR-146、miR-210，減少心肌細胞凋亡，為臨床改善擴張型心肌病患者的心功能提供了可能。WANG 等[27]將糖尿病大鼠的心肌細胞與內皮細胞共孵育，發(fā)現(xiàn)其心肌細胞過表達的外泌體miR-320 影響了內皮細胞的功能，進而影響了心肌細胞的內在保護機制，而敲除miR-320 后結果與之相反，提示miR-320 可能參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。但目前針對外泌體miRNA 與心肌病的研究尚少。

2.5 外泌體miRNA 與心力衰竭

心力衰竭是由多種疾病如冠心病、高血壓等導致心室泵血功能下降的綜合征，是心血管疾病的終末階段，其風險預測與早期識別成為臨床治療的重點和難點。MATSUMOTO 等[28]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，心肌細胞外泌體來源miR-34a、miR-194 在急性心肌梗死后心力衰竭的早期階段明顯上升，且含量與代償期心力衰竭左心室的舒張功能明顯相關。在臨床研究中，WU等[29]發(fā)現(xiàn)擴張型心肌病-急性心力衰竭患者血清外泌體miRNA（miR-92b-5p）含量增加，提示了外泌體miRNA 可以作為擴張型心肌病-急性心力衰竭的診斷標志物。

除診斷價值外，外泌體miRNA 可參與心力衰竭的病理變化，有利于心功能的恢復。BARILE 等[30]通過將心肌梗死后心力衰竭早期患者來源的心臟祖細胞（cardiac progenitor cell，CPC）體外作用于人臍靜脈內皮細胞，發(fā)現(xiàn)CPC 可高表達外泌體miR-132 和miR-210，分別與促進血管內皮細胞增殖分化和抑制心肌細胞凋亡相關。TIAN 等[31]發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心力衰竭患者的心肌細胞可釋放外泌體miR-27a 進入靶細胞，介導心臟重塑。因此，外泌體miRNA 在心力衰竭患者的心功能恢復中具有巨大的潛在價值。

3 外泌體miRNA 在法醫(yī)學中的應用前景

近年來，miRNA 在法醫(yī)學中的應用已被大量報道[32-33]，其作為各種體液（如唾液、血液、精液等）中的標志物在死因分析和死亡時間推斷等方面的重要價值被不斷證實[34]。miRNA 在法醫(yī)學中具有極大的應用優(yōu)勢[34-38]：（1）分子量小，不易受理化因素影響而降解；（2）穩(wěn)定性好，可耐受死后變化或腐敗的影響；（3）結構保守性高，無需鑒別其剪接變體或拼接異構體；（4）靈敏度高，組織特異性強，可通過分析miRNA表達譜進行月經血、精液、唾液等體液來源及器官組織種類的鑒定；（5）細胞外分泌，可分泌到體液中并遠隔發(fā)揮作用；（6）檢材易獲取，不依賴于心肌組織檢材。近年來，有許多法醫(yī)學研究報道m(xù)iRNA 可以用于心血管疾病導致死亡的診斷[39]。然而，目前關于外泌體miRNA 在法醫(yī)學鑒定中的應用還局限于初步探索階段。研究表明，心包液[40]、腦脊液[41]等生物檢材中也含有外泌體，且因其在法醫(yī)學鑒定中相較于臨床上更易獲取的優(yōu)勢，其法醫(yī)學應用價值被不斷研究。此外，外泌體的分離和鑒定目前尚不穩(wěn)定[42]，尤其是對于存在一定程度腐敗的法醫(yī)學檢材的穩(wěn)定性問題也有待進一步確定。

鑒于上述外泌體及miRNA 的優(yōu)勢，筆者認為：高度穩(wěn)定性和組織特異性的外泌體miRNA 在死因分析、體液鑒定等方面體現(xiàn)出巨大的應用潛力，且隨著技術升級和模型優(yōu)化，其靈敏度、特異性等優(yōu)勢可為法醫(yī)學鑒定尤其是具有一定死后變化尸體的法醫(yī)學鑒定提供參考依據，進一步探索外泌體miRNA 在心血管疾病中的價值，也可為心臟性猝死的法醫(yī)學鑒定提供客觀依據。