植物染色體倍性鑒定方法及其在桑樹研究中的應(yīng)用

陸曉媚 林強(qiáng) 唐燕梅 曾燕蓉 劉丹 李韜 朱光書 張朝華 邱長玉

(廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站， 南寧 530007)

植物染色體是遺傳物質(zhì)的載體，開展染色體倍性鑒定是植物種質(zhì)資源評價的重要內(nèi)容之一，明確植物染色體的倍性有助于創(chuàng)新植物種質(zhì)材料及開展多倍體育種，同時鑒別植物倍性水平還對研究其系統(tǒng)進(jìn)化、物種起源模式等具有重要的意義。本文在綜述國內(nèi)外關(guān)于植物染色體倍性鑒定方法的基礎(chǔ)上，概述其在桑樹種質(zhì)資源及多倍體育種上的應(yīng)用，同時針對各種鑒定方法存在的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)展開相應(yīng)的分析與討論，以期為發(fā)掘更多的優(yōu)異桑樹種質(zhì)資源服務(wù)于桑樹產(chǎn)業(yè)提供理論參考。

1 植物染色體倍性鑒定方法

植物倍性水平鑒定分直接和間接鑒定兩大類方法[1]。直接鑒定方法又稱染色體計(jì)數(shù)法；間接鑒定方法中常用的有植物形態(tài)指標(biāo)鑒定法、細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法、流式細(xì)胞術(shù)鑒定法、分子標(biāo)記鑒定法、同工酶鑒定法和生理生化指標(biāo)鑒定法等[1-2]。

1.1 直接鑒定法

染色體計(jì)數(shù)法是一種最直接且準(zhǔn)確的鑒定方法，制片材料大多選擇細(xì)胞旺盛分裂期的組織，取材部位可以是根尖、莖尖和幼葉，染色體制片方法有常規(guī)壓片法、酸解去壁法、去壁低滲壓片法、改良去壁低滲法。1987年以前，染色體計(jì)數(shù)多采用比較古老的壓片法，隨后陳瑞陽等[3]首創(chuàng)并推廣了去壁低滲壓片法，并成功應(yīng)用于水稻、玉米、大豆、甘蔗、甘薯、黃瓜、棉花、菠蘿、柿子、黃楊、桑樹、吊蘭等37科105種植物的染色體倍性鑒定，之后該方法又進(jìn)一步改良并廣泛應(yīng)用于植物染色體倍性鑒定。

1.2 間接鑒定法

1.2.1 植物形態(tài)指標(biāo)鑒定法

楊清淮[4]分析認(rèn)為，植物根、莖、葉、花等的生物量隨植物特定細(xì)胞染色體倍性的增加呈現(xiàn)正相關(guān)系數(shù)。植物形態(tài)指標(biāo)鑒定是根據(jù)多倍體在整個生長周期內(nèi)的外部形態(tài)特征如株高、莖粗、葉間距、葉片大小、葉片厚度、發(fā)條能力、生長勢、種子形態(tài)、花粉大小、花器官大小、果實(shí)大小等外部形態(tài)特征，初步判斷植物是否為多倍性。植物形態(tài)指標(biāo)鑒定可在苗期進(jìn)行觀察，所以是能在早期初步判斷植物多倍體的一種簡便、快速又直觀的鑒定方法。該方法已經(jīng)應(yīng)用于植物如燈盞花[5]、大白菜[6]、南瓜[7]、黑麥[8]、蝴蝶蘭[9]等的倍性初步篩選。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法

多倍體植株通常表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、氣孔大、保衛(wèi)細(xì)胞大、葉綠體量多等。細(xì)胞學(xué)鑒定數(shù)據(jù)是染色體倍數(shù)鑒定的間接指標(biāo)，通過觀察植物氣孔大小、密度、面積以及保衛(wèi)細(xì)胞大小、密度和保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)目、花粉粒形態(tài)、葉片解剖特征等方法來輔助判斷植株的倍性。目前，氣孔大小、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目等細(xì)胞學(xué)形態(tài)性狀被作為多倍體鑒定的指標(biāo)，已經(jīng)在紫花宿目[10]、蘋果[11]、梨[11]、葡萄[12]、西瓜[13]、何首烏[14]、月季[15]、橡膠[16]、黑麥[8]等多種植物上得到了研究和應(yīng)用。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定法

流式細(xì)胞術(shù)是通過檢測植物大量細(xì)胞分裂期間G1期的DNA含量從而獲取細(xì)胞倍性水平的方法，具有操作簡單、檢測速度快、準(zhǔn)確性高、所需樣品量少的優(yōu)點(diǎn)。流式細(xì)胞術(shù)可以檢測的植物樣品來源較廣，但新鮮的材料仍是最好的選擇，如新鮮的嫩葉、愈傷組織和具有生長活力的原生質(zhì)體；也可以選取冷凍和干燥后的材料，如冷凍后的嫩葉、干種子標(biāo)本和經(jīng)二氧化硅干燥處理后的材料等[17]。該項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物多倍體、非整倍體、正?；虍惓＜?xì)胞研究領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)與分析。目前，流式細(xì)胞術(shù)在多種植物染色體加倍或染色體倍性異常的檢測方面均有報道，例如黑麥[18]、香蕉[19]、黃花苜蓿[20]、野生薔薇[21]、棗[22]、桑樹[23]、紫薇屬[24]、油茶[25]、甜菜[26]、火龍果[27]、馬鈴薯[28]等。

1.2.4 分子標(biāo)記鑒定法

分子標(biāo)記鑒定法是利用簡單重復(fù)序列(SSR)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、熒光原位雜交(FISH)和基因組原位雜交(GISH)等分子檢測手段開展植物倍性鑒定[24]。分子標(biāo)記鑒定是一種初步判斷植物倍性的手段，該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物的倍性鑒定。李偉強(qiáng)等[29]利用9對SSR引物檢測448份美洲黑楊種質(zhì)材料的倍性，通過統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增位點(diǎn)的等位基因數(shù)目，初步篩選出多倍體材料，再對篩選的多倍體材料采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定，最后得出SSR分子標(biāo)記可應(yīng)用于美洲黑楊種質(zhì)資源多倍體的初步篩選，再結(jié)合流式細(xì)胞儀可進(jìn)行大批量快速檢測美洲黑楊種質(zhì)材料倍性的結(jié)論。

1.2.5 同工酶鑒定法

同工酶如過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、酯酶(EST)是普遍存在于植物中的酶類。通過對農(nóng)作物如小麥[30]、玉米[30]、番茄[30]、蘿卜[31,32]、蘋果[33]、不結(jié)球白菜[34]等的研究認(rèn)為，同工酶蛋白的表達(dá)與其基因組倍性呈正相關(guān)；而甘藍(lán)的POD同工酶活性隨其倍性的增加而減弱[30]。目前，通過不同倍性同工酶譜帶的比較，對多倍體與二倍體植株的判定具有指導(dǎo)意義。

1.2.6 生理生化指標(biāo)鑒定法

植物倍性鑒定方法除了能從染色體水平和植株外觀形態(tài)、細(xì)胞學(xué)水平、分子水平、同工酶檢測分析入手之外，還可以從生理生化指標(biāo)入手，即對生理生化指標(biāo)的測定也可以作為初步判斷植物倍性的技術(shù)手段。不同倍性植物的含水量、滲透壓力、呼吸和蒸騰作用特點(diǎn)、組織代謝物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)含量等是不相同的，因此，檢測植株的生理生化指標(biāo)，如可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)的含量，抗氧化酶活性如SOD、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性以及葉綠素含量等指標(biāo)，可以作為輔助判斷植株倍性的依據(jù)之一[34-36]。

2 植物倍性鑒定方法在桑樹研究方面的應(yīng)用

桑樹是家蠶的天然飼料樹種，我國作為桑樹種質(zhì)資源最為豐富的國家，具有上千年的桑樹栽培與育種歷史。已有的研究表明桑樹的倍性呈現(xiàn)多樣化，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的桑樹種質(zhì)資源包括天然單倍體、二倍體以及三倍體、四倍體、六倍體、八倍體、二十二倍體等。目前，植物染色體倍性鑒定方法在桑樹研究中的應(yīng)用，一方面是用于鑒定與評價現(xiàn)有的桑樹種質(zhì)資源，另一方面是用于誘導(dǎo)加倍的桑樹育種材料鑒定，即應(yīng)用在桑樹多倍體誘導(dǎo)及種質(zhì)材料的創(chuàng)新上。

2.1 在桑樹種質(zhì)資源鑒定與評價中的應(yīng)用

染色體倍性鑒定方法主要是應(yīng)用于對現(xiàn)有桑樹種質(zhì)資源的鑒定與評價方面。韓明齋等[37]收集來自陜西和國內(nèi)外引進(jìn)的桑樹品種資源共130份，采用直接鑒定法中的酸解壓片法觀察其倍性，鑒別出86份二倍體、20份三倍體、4份四倍體、19份六倍體和1份單體。李存禮等[38]采用形態(tài)學(xué)鑒定法，從外部形態(tài)比較了三倍體桑品種嘉陵16號和其二倍體親本品種，認(rèn)為三倍體桑品種與二倍體桑品種相比具有如下特點(diǎn)：體細(xì)胞大、植株長勢好、葉片大、葉質(zhì)優(yōu)、高產(chǎn)、高抗、生產(chǎn)效益高等。余茂德等[39]比較現(xiàn)有不同倍性即二倍體、三倍體、四倍體和六倍體桑樹品種的氣孔性狀(氣孔長、寬，氣孔口近似面積，氣孔數(shù)目)，結(jié)果表明上述多倍體的桑葉氣孔口近似面積比二倍體高出10%左右，氣孔大小與染色體倍數(shù)呈正相關(guān)，而單位葉片面積氣孔數(shù)目與染色體倍數(shù)呈負(fù)相關(guān)。黎月娟等[40]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測來自廣西壯族自治區(qū)的90份桑樹品種資源的倍性，鑒別出32份二倍體、18份三倍體、30份四倍體、10份混倍體。豐富的多倍體種質(zhì)資源為桑樹多倍體育種奠定了基礎(chǔ)。

2.2 在桑樹種質(zhì)材料創(chuàng)新上的應(yīng)用

染色體倍數(shù)性鑒定方法在桑樹種質(zhì)材料創(chuàng)新上的應(yīng)用，主要是用于鑒定誘導(dǎo)加倍的桑樹種質(zhì)材料。韓沙等[41]采用染色體壓片法和流式細(xì)胞術(shù)兩種方法檢測誘變的桑樹種質(zhì)材料，發(fā)現(xiàn)結(jié)果略有差異，即壓片法鑒定為單純四倍體的植株，采用流式細(xì)胞儀檢測其為混倍體，而且倍數(shù)性細(xì)胞比率在株系和部位間存在差異，證實(shí)了流式細(xì)胞儀可以快速且準(zhǔn)確地檢測出植株是否存在混倍體現(xiàn)象。王茜齡等[42]將人工雜交的二倍體無性系親本通過染色體加倍處理后，獲得果葉兼用的四倍體桑樹新品種嘉陵30號，該品種與其二倍體親本相比，具有葉片增大、增厚，葉肉肥厚，葉緣鋸齒加厚，枝條長，果肉肥厚，產(chǎn)果量和產(chǎn)葉量高的優(yōu)點(diǎn)。高麗霞等[43]對桂桑優(yōu)62、粵桑11號和沙2×倫109的桑種進(jìn)行染色體加倍誘導(dǎo)處理，并檢測其誘導(dǎo)前后植株的體細(xì)胞、氣孔大小和氣孔數(shù)量，結(jié)果表明多倍體的體細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞均比二倍體大，所含葉綠素增加了23%～50%，桑葉氣孔的大小隨倍數(shù)性的增加而變大，單位面積的氣孔數(shù)量隨倍數(shù)性的增加而減少。李曉雙等[44]采用流式細(xì)胞術(shù)對加倍誘導(dǎo)處理后的野生長穗桑云7進(jìn)行染色體倍性鑒定，獲得2株穩(wěn)定的十四倍體誘變植株。張有做等[45]利用RAPD技術(shù)比較不同倍性桑樹品種基因組DNA的多態(tài)性，結(jié)果表明，二倍體與經(jīng)加倍誘導(dǎo)的多倍體相比，其基因組DNA呈現(xiàn)多態(tài)性，這一研究對桑樹誘變育種具有一定的應(yīng)用價值。楊新華等[46]研究二倍體親本新一之洓頁與其誘變所得四倍體突變體的POD同工酶的酶譜，認(rèn)為同工酶可以用于判斷區(qū)分突變體和親本新一之洓頁[46]。

3 各種倍性鑒定方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

3.1 直接鑒定法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

染色體計(jì)數(shù)法簡單而準(zhǔn)確，不過在其實(shí)際應(yīng)用時優(yōu)劣皆有之。例如，用酸解一步法檢測桑樹染色體倍性雖然操作步驟簡單、流程少，但采用該方法不僅十分依賴于操作者的技術(shù)水平，對材料的敲擊力度要求均勻，而且需要在眾多細(xì)胞中找到染色體均勻、分散性良好的細(xì)胞，也不免費(fèi)時費(fèi)力，另外如細(xì)胞存在重疊情況會導(dǎo)致結(jié)果的不確定以及樣品載玻片不能長時間保存等。隨后王茜齡[47]開發(fā)的改良去壁低滲火焰干燥法雖然應(yīng)用廣泛，而且可以長時間保存染色體載玻片，但是其預(yù)處理、固定、低滲、酶解、染色等操作步驟仍較復(fù)雜且所花費(fèi)時間較長，同樣對實(shí)際操作者的技術(shù)水平要求高，檢測效率較低，不適合進(jìn)行大樣本檢測。

采用染色體計(jì)數(shù)法進(jìn)行倍性鑒定，制備的樣品是桑樹有絲分裂中期的染色體，不管是壓片法、酸解法，還是改良低滲去壁火焰干燥法，想要提高其制片質(zhì)量則要求有較多的染色體分裂中期細(xì)胞，因此選取桑樹材料的生長狀況和取材時間是關(guān)鍵的因素[48]。通常選取生長季節(jié)的桑樹頂芽或頂端即將展開的嫩芽作為材料，且同一天不同時間段取材制片獲得的染色體有絲分裂中期分裂相多少也有區(qū)別。林強(qiáng)等[49]開發(fā)了一種直接酸解去壁法，并比較了當(dāng)?shù)?—11月份以及一天中各取樣時間獲得材料的制片鏡檢效果，結(jié)果表明，3—5月份每天的8:00—9:30、16:00—17:00，以及8-9月份每天的6:00—9:00、14:00—19:00取樣獲得桑樹材料的染色體有絲分裂中期分裂相最多。

3.2 植株與細(xì)胞形態(tài)學(xué)指標(biāo)及分子標(biāo)記等鑒定方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

植株形態(tài)指標(biāo)鑒定法是一種較為直接、直觀且粗放的篩選桑樹多倍體的方法，但受操作者個人主觀因素影響較大，且只能大概區(qū)分其是否為多倍體，不能精確得出其具體的倍數(shù)性，準(zhǔn)確性不高，因此該方法目前只能作為一個初步判斷方法。細(xì)胞學(xué)形態(tài)是一個間接性鑒定染色體的指標(biāo)，不同品種其細(xì)胞學(xué)形態(tài)指標(biāo)略有差異，很難作為獨(dú)立的方法檢測未知桑樹材料的染色體數(shù)目，而且操作步驟相對復(fù)雜。分子標(biāo)記鑒定法如SSR標(biāo)記也只能通過雜合的等位基因位點(diǎn)來初步判斷出植株的倍性，而等位基因位點(diǎn)為純合時，則無法判斷[50]。同工酶鑒定法、生理生化指標(biāo)鑒定法也僅僅是可以作為輔助判斷桑樹倍性的方法使用。

3.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

與染色體計(jì)數(shù)的方法相比較，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行植物的倍性鑒定雖然具有測定核DNA含量樣品處理簡單，測量精確、快速，所需材料少，適合大批量篩查等優(yōu)點(diǎn)[51]，但在實(shí)際應(yīng)用中還有許多問題需要解決。如需要找到合適的標(biāo)準(zhǔn)樣品，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的染色體倍性作對照才能確定檢測樣品的染色體倍性，且樣品制備、染色等均會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響，因此同樣對操作者的技術(shù)水平要求較高，并且儀器操作也相對復(fù)雜。另外，該技術(shù)不易鑒別非整倍體。總之，流式細(xì)胞術(shù)鑒定法雖然快速準(zhǔn)確，但仍然存在著有一定的局限性。

桑樹中普遍存在混倍體的現(xiàn)象?；毂扼w是指同一生物個體或組織中有不同倍性或不同數(shù)目染色體細(xì)胞，它既可存在于植株的局部，如某個芽、某片葉，一段莖或一段根中，也可能存在于整株植株[52]?；毂扼w的產(chǎn)生通常與外界條件的變化(如驟然低溫、射線影響等)有關(guān)，因此它既可以是天然形成的，也可以經(jīng)人工誘導(dǎo)產(chǎn)生?；毂扼w在桑樹育種材料的挖掘與新品種選育上的應(yīng)用是極為普遍的。目前，已有直接利用混倍體育成優(yōu)良桑樹新品種的報道，如魯誘1號[53]，也有通過對混倍體進(jìn)行無性分離，利用個體優(yōu)勢育成優(yōu)良桑樹新品種的，如陜桑305[54]。采用染色體計(jì)數(shù)法鑒定桑樹材料是否為混倍體，具有一定難度，而流式細(xì)胞術(shù)是針對混倍體行之有效的鑒定方法，能準(zhǔn)確且快速鑒定出材料是否為混倍體。因此，流式細(xì)胞術(shù)在桑樹倍性鑒定上具有其他鑒定技術(shù)無法比擬、不可替代的優(yōu)勢，相信隨著該技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)一步完善，制備流程和染色劑的改進(jìn)等，流式細(xì)胞術(shù)用于桑樹倍性的檢測結(jié)果會更加精確。

3.4 倍性鑒定方法的選取原則

綜上分析認(rèn)為，選擇植物倍性鑒定方法的原則是：盡早篩選、低破壞性、高準(zhǔn)確性和簡單快捷[55]。鑒于桑樹屬于染色體較小且數(shù)目較多的植物，制片難度較大，為確保檢測結(jié)果可靠和準(zhǔn)確，針對目前的各種鑒定方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，在實(shí)際操作中可采用先簡單后繁瑣的鑒定方法，必要時采用多種技術(shù)相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定?？傊?，快速而準(zhǔn)確地鑒定出桑樹染色體的倍性，能為桑樹種質(zhì)資源的遺傳學(xué)評價及合理保護(hù)和高效開發(fā)利用打下良好基礎(chǔ)，更是可為桑樹多倍體育種提供優(yōu)異的種質(zhì)材料，從而有效地節(jié)約育種成本及加快育種進(jìn)程。