生物礦化膠原在骨缺損治療中的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀

孫守野 李少榮 崔宇韜 許航 王靖瑋 陳沖 王雁冰 彭傳剛

0 引言

天然骨組織是一個(gè)具有多層次結(jié)構(gòu)的復(fù)雜生物礦化系統(tǒng)，其基本單位是礦化膠原(mineralized collagen，MC)，是由有序的膠原和羥基磷灰石(hydroxylapatite，HA)組成[1-2]。自然界中，膠原蛋白的種類十分豐富，在脊椎動(dòng)物中有20多種，其中，人體內(nèi)主要是Ⅰ型膠原蛋白(typeⅠcollagen，ColⅠ)。膠原蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成后，被分泌出細(xì)胞外，再經(jīng)歷礦化過程，以特定結(jié)構(gòu)分布在骨基質(zhì)中[3-4]。MC是各種結(jié)締組織如骨、軟骨、肌腱等的組成部分，在人體中發(fā)揮重要作用[5]。

細(xì)胞外骨基質(zhì)含有60%～70%的礦物成分，20%～30%的膠原纖維，10%～20%的水，其中礦物成分主要是納米級羥基磷灰石晶體[6]。骨基質(zhì)包括有機(jī)質(zhì)和無機(jī)質(zhì)。骨基質(zhì)的有機(jī)成分主要為骨膠原，骨膠原中 90%為ColⅠ[1]。ColⅠ不僅是骨骼彈性和韌性的主要構(gòu)筑者，也是骨鹽賴以棲息的場所，其代謝狀況可以直接反映整體骨代謝的概貌。無機(jī)質(zhì)主要為以鈣鹽為主的礦物，對膠原起礦化作用。體外合成MC正是模仿骨基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這相比其他材料可以更好地促進(jìn)成骨過程，并且不會(huì)產(chǎn)生局部反應(yīng)[7]。

臨床上骨缺損的發(fā)生率正在增加，形成骨缺損的原因有很多，如嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤、全身性疾病等[8-9]。目前，骨缺損的治療方法主要包括局部處理聯(lián)合自體或者異體骨移植。這兩種方法各有利弊，自體骨移植受到移植骨的大小的限制，同時(shí)還會(huì)在供區(qū)留下創(chuàng)傷；異體骨移植則會(huì)產(chǎn)生一些免疫排斥反應(yīng)或者局部血管炎癥反應(yīng)[10]。骨組織工程是一種生物技術(shù)和材料工程相結(jié)合的新型骨缺損治療途徑，具有副作用小，治療效果較好的優(yōu)點(diǎn)，在臨床治療方面具有巨大的潛力。MC有良好的生物相容性，作為移植物不僅有一定的力學(xué)強(qiáng)度并且安全性較高，所以直接應(yīng)用MC或者M(jìn)C聯(lián)合藥物、3D打印支架等不同策略，在骨缺損治療領(lǐng)域是一種有巨大潛力的方案[11-13]。

本文從MC的概念、機(jī)制、結(jié)構(gòu)、應(yīng)用等方面進(jìn)行介紹，其中重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了MC在骨缺損修復(fù)中的研究和應(yīng)用現(xiàn)狀。

1 生物礦化膠原的礦化機(jī)制

膠原的礦化，是指在天然骨組織中HA結(jié)晶以片狀形式結(jié)合于膠原纖維間隙中。這是促進(jìn)骨組織生長的重要因素之一。MC不是簡單地將HA加入膠原中，這樣產(chǎn)生的膠原僅表面摻有HA，真正的內(nèi)部間隙中卻含量很少[14]。真正的MC是把HA結(jié)晶結(jié)合在膠原纖維內(nèi)部，這不僅可以增強(qiáng)膠原纖維的機(jī)械強(qiáng)度，有利于承擔(dān)骨組織負(fù)重，充分的礦物還可以起到促進(jìn)骨組織分化和骨生長的作用[15-16]。

膠原纖維在骨生長過程中起促進(jìn)HA成核和晶體生長的作用[17]。在膠原纖維與HA結(jié)合部位的羧基與鈣離子具有協(xié)調(diào)作用。此外，羰基也是ColⅠ生物礦化的成核位點(diǎn)。在溶液中，羧基和羰基中的氧原子可以與Ca2+配對，成為非均相成核的核心，然后晶體成核形成無機(jī)礦物[18-19]。關(guān)于膠原的礦化機(jī)制，目前主要有兩種觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為MC是在骨形成過程中產(chǎn)生的，由聚合物誘導(dǎo)的液體前體形成，此過程稱為聚合物誘導(dǎo)的液體前體過程(polymer-induced liquid-precursor，PILP)。在此過程中，無定形液體相的形成預(yù)示著HA的產(chǎn)生。此過程中產(chǎn)生的HA通過毛細(xì)血管作用卷入膠原原纖維的納米間隙和溝槽中，促進(jìn)MC的產(chǎn)生。無定形液態(tài)前體隨后固化并且在水分子丟失后結(jié)晶為更穩(wěn)定的熱力學(xué)相，這表示納米級別HA結(jié)晶成功嵌入膠原原纖維內(nèi)部。

另一種觀點(diǎn)認(rèn)為膠原的礦化是通過自組裝方法完成的。所謂自組裝是指HA晶體有序地結(jié)合在膠原纖維的成核位點(diǎn)上。膠原纖維上存在羧基與羰基集團(tuán)，是HA礦化的結(jié)合位點(diǎn)，具體是指鈣離子的結(jié)合部位。當(dāng)HA中鈣離子與膠原結(jié)合后，膠原纖維進(jìn)一步組裝成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)，成為了進(jìn)一步礦化的模版[20]。礦化過程中蛋白的構(gòu)象改變，使膠原纖維不溶于水，同時(shí)具有一定的力學(xué)強(qiáng)度。HA沿著膠原纖維長軸進(jìn)行生長，逐漸在膠原內(nèi)部分布均勻[21]。

與其他礦物相比，生物礦化膠原具有獨(dú)特的特性。首先，它們的高度有序結(jié)構(gòu)導(dǎo)致生物礦化膠原具有較高的強(qiáng)度和斷裂韌性。其次，這些礦化膠原與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用。最后，在生物新陳代謝過程中沉積的礦物實(shí)際上構(gòu)成了無機(jī)/有機(jī)復(fù)合材料的一部分，其有機(jī)成分在生物礦物的形成中起著骨架的作用。

2 生物礦化膠原的合成方法

Bradt等[22]報(bào)道了一種比較簡單的礦化方法。他們通過使用磷酸鈣鹽與ColⅠ在聚天冬氨酸的促進(jìn)下進(jìn)行礦化，將氯化鈣與磷酸二氫鈉等磷酸鹽與膠原和聚天冬氨酸混合，慢慢進(jìn)行膠原纖維的礦化過程。當(dāng)鈣離子在9.0 mmol/L、磷酸離子在5.4 mmol/L的濃度時(shí)是ColⅠ進(jìn)行礦化過程最適宜的離子濃度。在沒有聚天冬氨酸的情況下，磷酸鈣結(jié)晶在膠原纖維上的結(jié)合是不均勻的，并且不牢固。聚天冬氨酸可以使結(jié)合在膠原纖維上不穩(wěn)定的磷酸鈣結(jié)晶更穩(wěn)定，有利于加強(qiáng)MC的穩(wěn)定性，并且減少礦化所需要的時(shí)間。礦化成功后膠原呈均勻的乳白色，且力學(xué)強(qiáng)度得到較大提升[23-24]。

Maas等[25]制造了由兩個(gè)半U(xiǎn)形管和兩管中間的納米多孔膜組成的U形管裝置。在合成之前將原料分成兩組，分別填充到納米孔膜的兩側(cè)，一組為含Ca2+的酸性膠原溶液，另一組為含Na2HPO4和NaOH的堿性溶液。通過將含有Ca2+的膠原蛋白壓過膜，從而在膠原纖維上發(fā)生礦化過程。

Ficai等[26]以膠原凝膠和HA前驅(qū)體為原料，在37℃、pH=9的條件下進(jìn)行自組裝合成，采用體外礦化方法風(fēng)干，制備了Col/HA復(fù)合材料。這是一種簡單可行的方法來制備定向Col/HA納米復(fù)合材料，該材料的平均聚合度為97.46%。

3 生物礦化膠原的特征與功能

當(dāng)膠原纖維發(fā)生礦化時(shí)，膠原纖維內(nèi)部的礦物晶體直接生長在膠原纖維上，而不是存在于某些中間分子上[14]。由于無機(jī)物含量的提高，MC在高溫時(shí)水的蒸發(fā)率下降，并且礦物的含量越高，越不易失水。此外，由于礦物的加入，膠原的機(jī)械強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，礦化后的膠原具有一定的韌性，有一定的抗擠壓能力和抗形變能力[27-29]。同時(shí)由于磷酸鈣結(jié)晶的結(jié)合，膠原由原本的無色透明變成了渾濁的乳白色，同磷酸鈣沉淀顏色一致[24]。

由于MC是從ColⅠ修飾得來，因此也具有促進(jìn)骨組織生長的作用。MC可以通過促進(jìn)某些與成骨相關(guān)的基因表達(dá)來達(dá)到促進(jìn)骨生長的作用，比如RUNX2、OCN、SPP1以及ENPP1等與骨組織的生長相關(guān)的基因[30-31]。此外，MC還能通過調(diào)節(jié)與骨組織生長相關(guān)的酶類或者蛋白質(zhì)來上調(diào)骨生長，這其中就包括堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等成骨因子[32]。除此之外，有研究表明，MC有調(diào)節(jié)成骨與破骨平衡的能力，通過上調(diào)成骨活動(dòng)，抑制破骨活動(dòng)，最終達(dá)到促進(jìn)骨組織生長的作用[33]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明膠原礦化后沒有改變其原來良好的生物相容性，仍然可以作為一種安全的藥物載體使用[34-35]。

研究發(fā)現(xiàn)，MC植入后可以提供穩(wěn)定性，在促進(jìn)成骨的同時(shí)自身不斷降解，不僅為骨組織生長提供了空間，還避免了假體取出以及遺留等問題[36]。較好的療效證明了MC制備的支架有潛力成為下一代合成骨移植替代品，因?yàn)槠洫?dú)特的性能使其比目前臨床醫(yī)生可用的合成替代品更接近自體組織。

4 生物礦化膠原在骨缺損治療中的應(yīng)用

理想的生物材料應(yīng)該具備以下條件:(1) 材料具有多孔結(jié)構(gòu)，利于血管和細(xì)胞的長入；(2) 良好的生物相容性；(3) 降解的速度與骨生長速度一致；(4) 同時(shí)具有骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性等[37]。目前研究的骨移植材料大多是模仿自然骨結(jié)構(gòu)，MC作為和天然骨組織結(jié)構(gòu)和組成相似的生物材料，有足夠的性能來進(jìn)行體內(nèi)組織工程的應(yīng)用，如體內(nèi)細(xì)胞的聚集、生長、分化；同時(shí)它還可以應(yīng)用在細(xì)胞外基質(zhì)，為組織再生做貢獻(xiàn)。

4.1 生物礦化膠原治療非感染性骨缺損的應(yīng)用現(xiàn)狀

隨著現(xiàn)代社會(huì)發(fā)展，臨床上骨缺損的案例愈來愈多，臨床上往往通過自體或者異體植骨來解決問題，這兩種方法都存在一定的弊端[38]。由于自體及異體骨移植存在的現(xiàn)階段難以解決的局限性，近年來MC在骨缺損的臨床治療應(yīng)用中逐漸受到關(guān)注。MC能在提供局部穩(wěn)定的同時(shí)，促進(jìn)骨組織生長，又因其自身的可降解性，并不會(huì)影響新生骨的長入。Qiu等[39]用MC結(jié)合冷壓技術(shù)制作出了一種可用于種植的人工骨假體，符合人體正常承重，強(qiáng)度可以與人類骨皮質(zhì)媲美，同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生類似于異體骨移植的免疫反應(yīng)；此外MC還能起到促進(jìn)骨生長愈合的作用。MC可以明顯促進(jìn)局部骨組織生長，可以檢測到局部與成骨相關(guān)的酶類表達(dá)增多，基因表達(dá)活性增加[35]。Chen等[40]在腰椎爆裂骨折的案例中，成功使用MC聯(lián)合椎弓根螺釘進(jìn)行治療，效果十分顯著，可以檢測到有相關(guān)促進(jìn)成骨基因的表達(dá)，局部有明顯的骨整合與恢復(fù)。Gao等[41]使用鋼板聯(lián)合MC成功治療一位股骨遠(yuǎn)端腫瘤刮除術(shù)后骨缺損的患者，通過鋼板固定股骨遠(yuǎn)端使局部穩(wěn)定，使用MC材料對骨缺損進(jìn)行填充治療，術(shù)后影像表明骨的生長良好，局部骨愈合效果達(dá)到滿意效果。

MC不僅可以單獨(dú)使用，還能聯(lián)合某些假體或者支架使用。比如使用3D打印支架負(fù)載MC填充在缺損部位，支架可以提供足夠的力學(xué)強(qiáng)度，膠原能夠起到骨誘導(dǎo)和骨整合作用。Zhang等[42]使用3D打印鈦支架聯(lián)合纖維內(nèi)MC治療臨界性股骨缺損，在缺損部位證實(shí)了有關(guān)骨生長和血管生成的基因的表達(dá)有明顯增加，相關(guān)的細(xì)胞因子分泌量增多，在臨界性缺損部位有較好的骨長入，表明MC具有較好的骨誘導(dǎo)作用。隨著3D打印技術(shù)的蓬勃發(fā)展，MC與3D支架聯(lián)合應(yīng)用于臨床治療骨缺損有良好的前景。

Wang等[43]證實(shí)，多孔MC支架可以有效模擬體內(nèi)骨基質(zhì)微環(huán)境，使成骨細(xì)胞有效發(fā)育生長。Wang等[43]使用納米HA在體外模擬骨結(jié)構(gòu)，三維結(jié)構(gòu)的多孔MC支架可以為細(xì)胞生長提供空間場所，有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖黏附以及血管結(jié)構(gòu)的長入，同時(shí)也為營養(yǎng)物質(zhì)的輸送提供了通道。通過將BMSCs種植于多孔MC支架內(nèi)，形成細(xì)胞支架復(fù)合體，這使得BMSCs細(xì)胞更好地發(fā)育為骨細(xì)胞，達(dá)到局部骨缺損治療的目的。作為一種良好的載體，MC還可以搭載血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VGEF)，從而達(dá)到促進(jìn)血管長入的目的。

Huang等[36]使用MC移植物對髖臼或者股骨假體松動(dòng)合并髖臼或者股骨缺損患者進(jìn)行治療，使得髖關(guān)節(jié)功能恢復(fù)并且沒有產(chǎn)生類似于異體骨移植的副反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，MC植入后可以提供良好的穩(wěn)定性，在促進(jìn)成骨的同時(shí)自身不斷降解，不僅為骨組織生長提供了空間，還避免了假體取出以及遺留等問題，較好的療效證明MC是一種具有較大潛力的移植材料。

4.2 生物礦化膠原治療感染骨缺損的應(yīng)用現(xiàn)狀

臨床上伴有細(xì)菌感染的骨缺損相當(dāng)常見，嚴(yán)重影響骨愈合。這種骨缺損的最好治療方法就是先控制感染，再促進(jìn)骨缺損愈合[44]。作為一種良好的生物負(fù)載材料，MC可以通過聯(lián)合抗菌多肽或者抗生素控制感染，同時(shí)MC還可以促進(jìn)缺損部位的愈合。He等[45]使用MC聯(lián)合抗菌多肽對感染性骨缺損進(jìn)行治療，結(jié)果表明MC降解后釋放出抗菌多肽足以起到殺菌作用，并且可以保持長時(shí)間的緩釋，可以觀察到有緩慢的骨生長過程。

Lian等[44]以MC為主體負(fù)載萬古霉素，驗(yàn)證材料的抑菌性與相容性，證實(shí)了礦化膠原不會(huì)影響抗生素的抑菌作用，同時(shí)萬古霉素也不會(huì)影響MC的生物相容性和可降解性。萬古霉素作為一種強(qiáng)力的抗生素，能夠有效地在骨缺損局部發(fā)揮殺菌作用，在感染減輕后有利于骨整合的進(jìn)行。Lu等[46]使用一種金屬-有機(jī)骨架負(fù)載MC，再聯(lián)合一種具有抗菌的藥物柚皮苷對伴有感染的骨缺損進(jìn)行治療。通過金屬-有機(jī)骨架與MC達(dá)到對于柚皮苷的緩慢釋放作用，還能提供局部的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示柚皮苷能抑制感染并且聯(lián)合MC促進(jìn)骨整合，能達(dá)到良好的治療效果。

4.3 生物礦化膠原在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀

在口腔領(lǐng)域的治療中，往往是使用填充物或者假體進(jìn)行局部填充治療或者自體、異體移植物治療，近些年來組織工程學(xué)為口腔疾病提供了廣闊的前景[47-49]。相比于其他部位移植物，口腔內(nèi)移植物的要求較高，其中牙槽骨的填充物不僅要求有較強(qiáng)的愈合能力，還要求有一定的力學(xué)強(qiáng)度、耐磨損及穩(wěn)定性。一種用特定孔隙率的MC材料應(yīng)用于犬牙槽骨缺損的治療，治療結(jié)果較好[50]。此外還有MC聯(lián)合鎂鈣合金復(fù)合支架的成功應(yīng)用，也證實(shí)了MC的良好臨床效果[51]。MC良好的成骨能力可以促進(jìn)牙槽骨的愈合，也能提供局部的穩(wěn)定性，在口腔領(lǐng)域具有一定的潛力。

4.4 生物礦化膠原治療顱骨缺損的應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來，顱骨缺損的發(fā)生率也不斷增高。顱骨缺損在臨床治療上也可以采用MC的方法，Tiffany等[52-54]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新型負(fù)載鋅的功能化MC支架在動(dòng)物顱骨缺損模型上取得了較好的治療效果。顱骨與面部骨骼無需太多負(fù)重，MC擁有一定的韌性，足以承受局部壓力。同時(shí)，MC也是良好的載體，可以融合諸多利于顱骨修復(fù)的藥物[55]。一種聯(lián)合糖胺聚糖的MC的新型支架，被證實(shí)可以治療顱骨缺損。據(jù)分析，支架通過調(diào)節(jié)BMP通路，通過上調(diào)BMP的合成來促進(jìn)骨缺損愈合[55-56]。此外，Liu等[57]使用一種新型亞纖維納米結(jié)構(gòu)的MC材料成功治療鼠下頜骨缺損，發(fā)現(xiàn)MC能夠促進(jìn)BMSCs細(xì)胞的生長、黏附和分化，可以明顯促進(jìn)下頜骨缺損部位的愈合。研究組發(fā)現(xiàn)使用MC治療取得了良好的效果，同時(shí)MC聯(lián)合治療藥物的方法相比其他方法更安全并且不受區(qū)域限制，具有一定的應(yīng)用潛力。

5 總結(jié)與展望

MC自身具有促進(jìn)骨組織生長的能力，可以單獨(dú)作為一種促進(jìn)成骨的藥物使用。此外，MC還可以作為骨組織工程的藥物載體，通過聯(lián)合一些促進(jìn)骨生長的藥物，來增加成骨能力。同時(shí)，MC的體內(nèi)降解過程還可以達(dá)到藥物緩慢釋放的效果，不會(huì)引起局部過高的藥物濃度積累。ColⅠ在礦化后本身的韌性得到了極大的提升，在一些局部應(yīng)力小的部位可以承擔(dān)全部應(yīng)力；在類似四肢這種局部應(yīng)力較大的部位，MC可以聯(lián)合3D打印支架使用，足以承受較大的局部應(yīng)力。

雖然MC在治療骨缺損中有許多的優(yōu)勢之處，但是還有一些未克服的問題，比如MC的適宜濃度等問題。不過隨著骨組織工程的逐漸發(fā)展，MC在骨缺損修復(fù)愈合方面的巨大優(yōu)勢可以得到實(shí)現(xiàn)，可以豐富臨床治療的方法，成為未來臨床治療骨缺損的方案之一，造福于人類社會(huì)。