組織工程人工膽管的研究進(jìn)展

袁琪 徐雯 周文策

0 引言

隨著腹腔鏡技術(shù)的廣泛應(yīng)用，臨床上膽管損傷的發(fā)生率有所增加[1]。國外一項對160萬例腹腔鏡膽囊切除術(shù)后患者的研究調(diào)查顯示，術(shù)后膽管損傷的發(fā)生率為0.5%[2]。針對膽管損傷后膽管狹窄的治療主要依賴于手術(shù)，但術(shù)后膽管再狹窄的發(fā)生率仍然較高，這不僅影響患者的生活質(zhì)量，反復(fù)膽管狹窄也會造成患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]，因此，降低膽管狹窄術(shù)后再次狹窄的發(fā)生率是臨床醫(yī)生面臨的一大挑戰(zhàn)。目前針對膽管損傷后膽管狹窄的手術(shù)治療方式較多，如Roux-en-Y膽管空腸吻合術(shù)、膽道內(nèi)支架置入術(shù)等，但大部分手術(shù)方式或多或少都會造成十二指腸乳頭括約肌功能的喪失或減弱，術(shù)后膽管炎、膽道狹窄、膽瘺和膽管癌發(fā)生的風(fēng)險也會增高[4]。研究顯示，組織工程人工膽管在動物膽管損傷修復(fù)中是安全、有效的，王敬等[5]也曾在臨床中使用自體組織修復(fù)膽管。對組織工程人工膽管的研究目的主要是在其解決膽汁通暢引流的同時可以保留十二指腸乳頭括約肌的正常功能，或者盡量減少十二指腸乳頭括約肌功能的損傷，進(jìn)而提升患者預(yù)后，提高患者遠(yuǎn)期的生活質(zhì)量。本文通過對組織工程人工膽管的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)與分析，為臨床醫(yī)生及研究者提供參考。

1 組織工程人工膽管及其主要特征

組織工程人工膽管是利用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究開發(fā)用于修復(fù)、替代人體膽管損傷后的生物替代物[6]。其良好的生物相容性、機(jī)械性能、生物降解性及利于組織生長的多孔結(jié)構(gòu)等優(yōu)勢在臨床應(yīng)用中存在巨大潛力。

2 組織工程人工膽管發(fā)展現(xiàn)狀

隨著組織工程學(xué)技術(shù)和組織工程材料的不斷發(fā)展，人工膽管的研究也出現(xiàn)了飛速的進(jìn)步，但在臨床的發(fā)展較為滯后。其發(fā)展經(jīng)歷了自體組織人工膽管、異體組織脫細(xì)胞人工膽管、不可吸收復(fù)合人工膽管、可吸收復(fù)合人工膽管、生物3D打印可吸收人工膽管幾個階段。

2.1 自體組織人工膽管

自體血管修復(fù)膽道用于動物實驗的有豬頸靜脈、鼠股動脈，但需膽道支架支撐，否則易出現(xiàn)狹窄。Biglari 等[7]將自體大隱靜脈聯(lián)合膽道支架修復(fù)膽管缺損應(yīng)用于臨床，術(shù)后8個月移除膽道支架，術(shù)后1年復(fù)查患者一般狀況良好。Crema等[8]使用人自體帶有血管蒂的空腸段修復(fù)膽道，術(shù)后未出現(xiàn)膽瘺等并發(fā)癥，術(shù)后3年復(fù)查患者膽道膽汁引流良好。目前應(yīng)用于臨床的包括帶蒂的圓韌帶、大網(wǎng)膜及臍血管。在外科手術(shù)中，使用大網(wǎng)膜作為自體移植物來封閉、修補或加固組織已得到廣泛應(yīng)用，其支持和粘附局部組織的能力取決于豐富的血液供應(yīng)、血管生成活性和高濃度的組織因子[9]。此外，動物實驗研究表明，在組織重建中使用帶蒂網(wǎng)膜瓣既有抗炎作用，又可促進(jìn)組織生成[10]，但自體組織的大小、薄厚和取材的復(fù)雜性影響了其在臨床的發(fā)展和應(yīng)用[11]。自體組織人工膽管因具有良好的生物相容性、抗微生物活性、無免疫原性，且自身含多種生長因子的優(yōu)勢已應(yīng)用于臨床中，但大部分集中于對膽道缺損較小的修復(fù)。盡管有自體大隱靜脈、空腸段修復(fù)膽管的臨床報道，但因觀察周期較短，還需進(jìn)一步臨床試驗的驗證。

2.2 異體組織脫細(xì)胞人工膽管

Struecke等[12]通過將脫細(xì)胞的同種異體動脈血管進(jìn)行自體膽管細(xì)胞的再細(xì)胞化后對實驗動物進(jìn)行膽管修復(fù)，實驗動物在研究階段均存活，未出現(xiàn)嚴(yán)重的膽瘺或腹膜炎等并發(fā)癥，且觀察到植入物組織周圍有新生血管生成。Chakhunashvili等[13]的研究使用脫細(xì)胞人臍動脈三維支架對兔膽管進(jìn)行修復(fù)，移植物與實驗動物組織融合良好。也有同種異體/異種異體脫細(xì)胞輸尿管進(jìn)行膽管修復(fù)的文獻(xiàn)報道[14]。脫細(xì)胞人工膽管制備的關(guān)鍵在于脫細(xì)胞技術(shù)的選擇，任何一種脫細(xì)胞方法都會對細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)造成損傷。脫細(xì)胞方法包括物理法、化學(xué)試劑和酶3種方式。

2.2.1 物理法

(1) 凍融：可使組織細(xì)胞胞內(nèi)形成冰晶，細(xì)胞因胞液鹽濃度增加而破碎，凍融對ECM的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)影響甚微，但反復(fù)凍融后細(xì)胞內(nèi)容物可繼續(xù)存在[15]。(2) 壓力法：在高壓力負(fù)荷下，細(xì)胞膜會出現(xiàn)變形破裂，細(xì)胞可被機(jī)械壓力有效破壞，避免了使用化學(xué)試劑導(dǎo)致的支架內(nèi)毒物殘留，機(jī)械壓力對ECM的作用較小，因此是常使用的方法。(3) 機(jī)械攪拌和超聲：機(jī)械攪拌貫穿于整個脫細(xì)胞過程，通常借助磁力攪拌托盤或搖振器實現(xiàn)，機(jī)械攪拌益于化學(xué)物質(zhì)與組織充分滲入組織內(nèi)部，是脫細(xì)胞常用的輔助手段。對于脫細(xì)胞過程中的超聲波輸出功率等相關(guān)參數(shù)仍缺乏具體報道。物理法是廣泛采用的脫細(xì)胞方法，但單純使用物理法效果欠佳，需聯(lián)合使用其他方法[16]。

2.2.2 化學(xué)試劑

(1) 低滲或高滲溶液：多采用低滲高滲循環(huán)處理以徹底清除細(xì)胞，但為了ECM的高效制備需聯(lián)合其他化學(xué)方法。(2) 酸和堿：可有效溶解胞質(zhì)成分、清除核酸物質(zhì)，但會影響ECM的結(jié)構(gòu)及功能，需謹(jǐn)慎使用[17]。(3) 非離子去垢劑：通過破壞DNA-蛋白質(zhì)、脂質(zhì)-脂質(zhì)、脂質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的連接而起到脫細(xì)胞的作用，對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)連接之間的作用較小，常用于制作脫細(xì)胞血管支架。(4) 離子去垢劑：可有效溶解細(xì)胞膜，將DNA從蛋白質(zhì)中分離出來，但容易破壞ECM。(5) 兩性離子去垢劑：需與離子去垢劑聯(lián)合使用以減少對ECM的破壞。(6) 醇類：通過細(xì)胞脫水溶解達(dá)到脫細(xì)胞的目的，但易使蛋白質(zhì)沉積從而破壞ECM的亞顯微結(jié)構(gòu)[18]。(7) 螯合劑：通過破壞細(xì)胞對ECM的粘附起到協(xié)助脫細(xì)胞的作用。

2.2.3 酶

(1) 胰蛋白酶：需與螯合劑聯(lián)合使用提高脫細(xì)胞效率。(2) 核酸酶：主要用于處理脫細(xì)胞后殘留的核酸，因?qū)CM作用的研究較少需要進(jìn)一步研究。脫細(xì)胞組織可以提供具有特殊結(jié)構(gòu)的支架，其保留了可以促進(jìn)組織重建的生物活性物質(zhì)如膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白[19-20]，但脫細(xì)胞過程中蛋白質(zhì)和膠原纖維等成分的部分丟失會引起脫細(xì)胞組織力學(xué)性能的下降而導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，也會導(dǎo)致脫細(xì)胞組織的生物活性降低[21]，術(shù)后可能會導(dǎo)致感染等并發(fā)癥[22-23]。異體組織脫細(xì)胞人工膽管僅用于動物實驗，其在取材方面有優(yōu)勢，且具有良好的生物相容性，但其在臨床可能帶來的風(fēng)險尚未可知，同時異體組織也存在倫理等諸多問題。

2.3 不可吸收復(fù)合人工膽管

不可吸收復(fù)合人工膽管主要有聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)貼片、聚丙烯網(wǎng)架增強(qiáng)膠原海綿假體等，目前僅用于動物實驗。PTFE人工膽管為雙層結(jié)構(gòu)，在方便手術(shù)操作的同時對膽管有良好的支撐作用，且可以避免膽漏及狹窄，其內(nèi)層為聚四氟乙烯材料生料管經(jīng)高溫烘培、拉伸、包覆及高溫定型而制備，外層覆蓋氟橡膠以封閉表面空隙，氟橡膠的涂抹厚度會影響人工膽管的滲透性能和力學(xué)拉伸性能。PTFE具有諸多良好的特性，如耐化學(xué)腐蝕性、低摩擦系數(shù)等，作為一種惰性材料，其熱力學(xué)和化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，但粘結(jié)性能和濕潤性能差使其在人工膽管的制作過程中需通過表面改性的方法使其利于與氟橡膠復(fù)合。表面改性的方法包括低溫等離子體改性、化學(xué)還原法及離子照射等，因不破壞材料性能，低溫等離子體改性是最常用的方式,其具有易操作、加工速度快、效果良好、節(jié)能等優(yōu)點[24]。PTFE人工膽管有良好的機(jī)械強(qiáng)度及三維立體多孔結(jié)構(gòu)，但生物相容性不夠理想，術(shù)后可能出現(xiàn)的感染和慢性異物反應(yīng)等影響預(yù)后。此外，器官損傷是聚四氟乙烯移植物罕見、延遲出現(xiàn)的并發(fā)癥，聚乙烯材料會引起纖維細(xì)胞增殖反應(yīng)，導(dǎo)致移植物和周圍組織粘連，甚至腸管穿孔[25]。盡管不可吸收復(fù)合人工膽管已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但隨著可吸收材料的創(chuàng)新與發(fā)展，不可吸收復(fù)合人工膽管已逐漸被取代。

2.4 可吸收復(fù)合人工膽管

Miyazawa等[26]將預(yù)先植入自體骨髓細(xì)胞的由聚乙醇酸纖維強(qiáng)化過的聚己內(nèi)酯和聚乳酸聚合物制成的人工膽管對實驗動物進(jìn)行膽管修復(fù)，術(shù)后6個月移植物完全溶解，切除的新膽管周圍有輕微炎癥，其形態(tài)與天然膽總管相似。Li等[27]使用堿性成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合膠原作為補片，以促膽管細(xì)胞再生的方式修復(fù)豬肝外膽管缺損，術(shù)后1月除部分實驗動物出現(xiàn)膽汁淤積并形成少許膽泥外，大部分在術(shù)后3月行膽囊膽管造影提示膽管通暢良好，未見明顯狹窄及并發(fā)癥。Zong等[28]使用結(jié)合人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cell，hMSC)的以聚己內(nèi)酯為內(nèi)層、多孔的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]為外層的hMSC-PCL/PLGA雙層支架修復(fù)膽管缺損，實驗發(fā)現(xiàn)通過灌流培養(yǎng)的細(xì)胞支架具有較高的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)積聚，且結(jié)合人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的支架更利于膽道的修復(fù)。用于動物實驗的有自體脂肪干細(xì)胞膜片、膠原補片、結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子的膠原支架、由纖維素聚合甘蔗糖蜜制成的細(xì)菌纖維素膜、可吸收電紡聚羥乙基天冬酰胺-聚乳酸/聚己內(nèi)酯板狀支架、電紡聚氨酯人工膽管、聚癸二酸二異丙酯支架、聚二氧六環(huán)酮可吸收生物支架等?？晌諒?fù)合人工膽管可通過溶液燒鑄-浸漬法、靜電紡絲法、凝膠紡絲法或幾種方法復(fù)合制造。燒鑄-浸漬法是通過將模具浸入溶解有聚合物的溶劑中，去除溶劑后獲得管狀支架，雖然方法簡便易行但可能會有有毒溶劑的殘留，其孔徑的大小和分布不易控制。靜電紡絲法通過施加高壓電流使電場力克服聚合物溶液表面張力而形成帶電射流，溶劑在射流運動的過程中不斷揮發(fā)，最終在收集器上獲得納米級的纖維，納米纖維具有好的比表面積和孔隙率，有利于細(xì)胞的黏附、生長和繁殖[29]。凝膠紡絲法不需要電場力的作用，用注射器將在水中制成溶液的聚合物擠壓出去，使溶液沉積在來回移動的轉(zhuǎn)軸上，其孔徑大小和分布可通過纏繞方法的不同和后處理來實現(xiàn)，如空氣干燥和冷凍干燥等。合成聚合物在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用面臨的主要問題是生物相容性的普遍缺乏，生物相容性取決于組織反應(yīng)的范圍和生物環(huán)境，而不是任何材料的給定屬性[30]，與炎癥反應(yīng)和纖維包裹密切相關(guān)。膠原蛋白被大量應(yīng)用于組織工程，因具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和優(yōu)異的生物相容性，且膠原支架有利于組織結(jié)構(gòu)再生和功能重建，滲透到膠原支架中的自體細(xì)胞會分泌膠原酶降解膠原膜以便產(chǎn)生完整的細(xì)胞外基質(zhì)從而加速其增殖和分化，最后形成天然組織。

2.5 生物3D打印可吸收人工膽管

生物3D打印技術(shù)(three-dimensional printing，3D printing)是以計算機(jī)三維模型為基礎(chǔ)，制造人工植入支架、組織器官和醫(yī)療輔具等生物醫(yī)學(xué)用品的3D打印技術(shù)。近年來在動物實驗?zāi)懝苄迯?fù)中的應(yīng)用逐漸增多。Yan等[31]將小鼠膽管細(xì)胞、硫醇化明膠與既具有納米結(jié)構(gòu)又具有生物活性的多肽兩親性分子混合物進(jìn)行充分混合經(jīng)退熱后運用壓力輔助生物打印進(jìn)行3D支架打印，使用雙功能的馬來酰亞胺共軛聚乙二醇對支架進(jìn)行二次交聯(lián)增加穩(wěn)定性，通過實驗發(fā)現(xiàn)在生物墨水中加入層粘連蛋白兩親肽對膽管細(xì)胞的成熟及形成功能膽管都有很好的促進(jìn)作用，使支架既具有納米結(jié)構(gòu)特征又具有生物活性。Xiang等[32]的研究將制作好的PLGA支架與甲基丙烯酸明膠(gelatin methacrylate，GelMA)/IKVAV層粘連蛋白肽/超小超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxid，USPIO)的支架進(jìn)行交聯(lián)制成PLGA/GelMA/IKVAV/USPIO復(fù)合管狀支架，結(jié)果發(fā)現(xiàn)支架在保持良好柔韌性的同時還兼顧了支撐性和促膽管細(xì)胞生長的特性，并且具有良好的細(xì)胞密度，因具有多孔結(jié)構(gòu)，其力學(xué)穩(wěn)定性也得到了提升，實驗將可顯影材料運用在支架中便于分析術(shù)前術(shù)后支架的特征，但USPIO對細(xì)胞的毒性作用不容忽視，是否可應(yīng)用于臨床仍需進(jìn)一步驗證與研究[31-32]。Hamada等[33]使用異體豬的成纖維細(xì)胞溶液通過生物3D打印技術(shù)制作無支架的成纖維細(xì)胞管，得到了較好的效果。與傳統(tǒng)人工膽管制造技術(shù)相比，3D打印人工膽管不需要預(yù)制模具，也不需要在鍛造過程中去除大量材料和使用復(fù)雜的鍛造技術(shù)，其具有更優(yōu)化的結(jié)構(gòu)、節(jié)約材料和能源等特點。制作生物3D打印可吸收人工膽管的關(guān)鍵在于對組織細(xì)胞的3D構(gòu)建能力，因此打印生物材料支架結(jié)構(gòu)和形貌的方式有著至關(guān)重要的作用。因成纖維細(xì)胞成活率較高，噴墨打印廣泛應(yīng)用于生物實體打印[34]。噴墨生物打印只能分配氣泡小于10 mPa·s的生物墨水[35]，具有高度通用性的壓力輔助生物打印比較適合組織工程人工膽管的制造。然而，生物墨水的制備也具有挑戰(zhàn)性，如其在培養(yǎng)基中的不溶性及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，此外還要求其具有與組織細(xì)胞相同的降解率及促細(xì)胞生長及無毒特性。生物3D打印人工膽管的發(fā)展給予了臨床和相關(guān)研究者更多的期待，未來必將是疾病治療中的一件利器。

3 展望

膽管損傷后膽管狹窄是臨床膽道疾病治療面臨的一大難題。近年來隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，其作為一種先進(jìn)的技術(shù)，具有制造類似于生物結(jié)構(gòu)的分層結(jié)構(gòu)[36]、滿足組織替換和器官移植的需求等的優(yōu)勢，逐漸為臨床上疾病的治療提供了新的選擇[37-38]。盡管組織工程人工膽管在臨床醫(yī)療方面仍然存在許多爭議如支架降解后的安全性以及異物反應(yīng)等問題，但隨著科技的發(fā)展、技術(shù)的創(chuàng)新和臨床的不斷探索，相信未來在臨床上組織工程人工膽管將會成為膽管損傷后膽道狹窄治療的一大突破和新的治療方式。