組織工程人工膽管的研究進展

袁琪 徐雯 周文策

0 引言

隨著腹腔鏡技術的廣泛應用，臨床上膽管損傷的發(fā)生率有所增加[1]。國外一項對160萬例腹腔鏡膽囊切除術后患者的研究調查顯示，術后膽管損傷的發(fā)生率為0.5%[2]。針對膽管損傷后膽管狹窄的治療主要依賴于手術，但術后膽管再狹窄的發(fā)生率仍然較高，這不僅影響患者的生活質量，反復膽管狹窄也會造成患者的經濟負擔[3]，因此，降低膽管狹窄術后再次狹窄的發(fā)生率是臨床醫(yī)生面臨的一大挑戰(zhàn)。目前針對膽管損傷后膽管狹窄的手術治療方式較多，如Roux-en-Y膽管空腸吻合術、膽道內支架置入術等，但大部分手術方式或多或少都會造成十二指腸乳頭括約肌功能的喪失或減弱，術后膽管炎、膽道狹窄、膽瘺和膽管癌發(fā)生的風險也會增高[4]。研究顯示，組織工程人工膽管在動物膽管損傷修復中是安全、有效的，王敬等[5]也曾在臨床中使用自體組織修復膽管。對組織工程人工膽管的研究目的主要是在其解決膽汁通暢引流的同時可以保留十二指腸乳頭括約肌的正常功能，或者盡量減少十二指腸乳頭括約肌功能的損傷，進而提升患者預后，提高患者遠期的生活質量。本文通過對組織工程人工膽管的研究進展進行總結與分析，為臨床醫(yī)生及研究者提供參考。

1 組織工程人工膽管及其主要特征

組織工程人工膽管是利用工程學和生命科學的原理與技術，在正確認識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結構與功能關系的基礎上，研究開發(fā)用于修復、替代人體膽管損傷后的生物替代物[6]。其良好的生物相容性、機械性能、生物降解性及利于組織生長的多孔結構等優(yōu)勢在臨床應用中存在巨大潛力。

2 組織工程人工膽管發(fā)展現狀

隨著組織工程學技術和組織工程材料的不斷發(fā)展，人工膽管的研究也出現了飛速的進步，但在臨床的發(fā)展較為滯后。其發(fā)展經歷了自體組織人工膽管、異體組織脫細胞人工膽管、不可吸收復合人工膽管、可吸收復合人工膽管、生物3D打印可吸收人工膽管幾個階段。

2.1 自體組織人工膽管

自體血管修復膽道用于動物實驗的有豬頸靜脈、鼠股動脈，但需膽道支架支撐，否則易出現狹窄。Biglari 等[7]將自體大隱靜脈聯合膽道支架修復膽管缺損應用于臨床，術后8個月移除膽道支架，術后1年復查患者一般狀況良好。Crema等[8]使用人自體帶有血管蒂的空腸段修復膽道，術后未出現膽瘺等并發(fā)癥，術后3年復查患者膽道膽汁引流良好。目前應用于臨床的包括帶蒂的圓韌帶、大網膜及臍血管。在外科手術中，使用大網膜作為自體移植物來封閉、修補或加固組織已得到廣泛應用，其支持和粘附局部組織的能力取決于豐富的血液供應、血管生成活性和高濃度的組織因子[9]。此外，動物實驗研究表明，在組織重建中使用帶蒂網膜瓣既有抗炎作用，又可促進組織生成[10]，但自體組織的大小、薄厚和取材的復雜性影響了其在臨床的發(fā)展和應用[11]。自體組織人工膽管因具有良好的生物相容性、抗微生物活性、無免疫原性，且自身含多種生長因子的優(yōu)勢已應用于臨床中，但大部分集中于對膽道缺損較小的修復。盡管有自體大隱靜脈、空腸段修復膽管的臨床報道，但因觀察周期較短，還需進一步臨床試驗的驗證。

2.2 異體組織脫細胞人工膽管

Struecke等[12]通過將脫細胞的同種異體動脈血管進行自體膽管細胞的再細胞化后對實驗動物進行膽管修復，實驗動物在研究階段均存活，未出現嚴重的膽瘺或腹膜炎等并發(fā)癥，且觀察到植入物組織周圍有新生血管生成。Chakhunashvili等[13]的研究使用脫細胞人臍動脈三維支架對兔膽管進行修復，移植物與實驗動物組織融合良好。也有同種異體/異種異體脫細胞輸尿管進行膽管修復的文獻報道[14]。脫細胞人工膽管制備的關鍵在于脫細胞技術的選擇，任何一種脫細胞方法都會對細胞外基質(extracellular matrix，ECM)造成損傷。脫細胞方法包括物理法、化學試劑和酶3種方式。

2.2.1 物理法

(1) 凍融：可使組織細胞胞內形成冰晶，細胞因胞液鹽濃度增加而破碎，凍融對ECM的力學性能和結構影響甚微，但反復凍融后細胞內容物可繼續(xù)存在[15]。(2) 壓力法：在高壓力負荷下，細胞膜會出現變形破裂，細胞可被機械壓力有效破壞，避免了使用化學試劑導致的支架內毒物殘留，機械壓力對ECM的作用較小，因此是常使用的方法。(3) 機械攪拌和超聲：機械攪拌貫穿于整個脫細胞過程，通常借助磁力攪拌托盤或搖振器實現，機械攪拌益于化學物質與組織充分滲入組織內部，是脫細胞常用的輔助手段。對于脫細胞過程中的超聲波輸出功率等相關參數仍缺乏具體報道。物理法是廣泛采用的脫細胞方法，但單純使用物理法效果欠佳，需聯合使用其他方法[16]。

2.2.2 化學試劑

(1) 低滲或高滲溶液：多采用低滲高滲循環(huán)處理以徹底清除細胞，但為了ECM的高效制備需聯合其他化學方法。(2) 酸和堿：可有效溶解胞質成分、清除核酸物質，但會影響ECM的結構及功能，需謹慎使用[17]。(3) 非離子去垢劑：通過破壞DNA-蛋白質、脂質-脂質、脂質-蛋白質之間的連接而起到脫細胞的作用，對蛋白質-蛋白質連接之間的作用較小，常用于制作脫細胞血管支架。(4) 離子去垢劑：可有效溶解細胞膜，將DNA從蛋白質中分離出來，但容易破壞ECM。(5) 兩性離子去垢劑：需與離子去垢劑聯合使用以減少對ECM的破壞。(6) 醇類：通過細胞脫水溶解達到脫細胞的目的，但易使蛋白質沉積從而破壞ECM的亞顯微結構[18]。(7) 螯合劑：通過破壞細胞對ECM的粘附起到協(xié)助脫細胞的作用。

2.2.3 酶

(1) 胰蛋白酶：需與螯合劑聯合使用提高脫細胞效率。(2) 核酸酶：主要用于處理脫細胞后殘留的核酸，因對ECM作用的研究較少需要進一步研究。脫細胞組織可以提供具有特殊結構的支架，其保留了可以促進組織重建的生物活性物質如膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白[19-20]，但脫細胞過程中蛋白質和膠原纖維等成分的部分丟失會引起脫細胞組織力學性能的下降而導致三維結構發(fā)生變化，也會導致脫細胞組織的生物活性降低[21]，術后可能會導致感染等并發(fā)癥[22-23]。異體組織脫細胞人工膽管僅用于動物實驗，其在取材方面有優(yōu)勢，且具有良好的生物相容性，但其在臨床可能帶來的風險尚未可知，同時異體組織也存在倫理等諸多問題。

2.3 不可吸收復合人工膽管

不可吸收復合人工膽管主要有聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)貼片、聚丙烯網架增強膠原海綿假體等，目前僅用于動物實驗。PTFE人工膽管為雙層結構，在方便手術操作的同時對膽管有良好的支撐作用，且可以避免膽漏及狹窄，其內層為聚四氟乙烯材料生料管經高溫烘培、拉伸、包覆及高溫定型而制備，外層覆蓋氟橡膠以封閉表面空隙，氟橡膠的涂抹厚度會影響人工膽管的滲透性能和力學拉伸性能。PTFE具有諸多良好的特性，如耐化學腐蝕性、低摩擦系數等，作為一種惰性材料，其熱力學和化學性質非常穩(wěn)定，但粘結性能和濕潤性能差使其在人工膽管的制作過程中需通過表面改性的方法使其利于與氟橡膠復合。表面改性的方法包括低溫等離子體改性、化學還原法及離子照射等，因不破壞材料性能，低溫等離子體改性是最常用的方式,其具有易操作、加工速度快、效果良好、節(jié)能等優(yōu)點[24]。PTFE人工膽管有良好的機械強度及三維立體多孔結構，但生物相容性不夠理想，術后可能出現的感染和慢性異物反應等影響預后。此外，器官損傷是聚四氟乙烯移植物罕見、延遲出現的并發(fā)癥，聚乙烯材料會引起纖維細胞增殖反應，導致移植物和周圍組織粘連，甚至腸管穿孔[25]。盡管不可吸收復合人工膽管已經取得了一定進展，但隨著可吸收材料的創(chuàng)新與發(fā)展，不可吸收復合人工膽管已逐漸被取代。

2.4 可吸收復合人工膽管

Miyazawa等[26]將預先植入自體骨髓細胞的由聚乙醇酸纖維強化過的聚己內酯和聚乳酸聚合物制成的人工膽管對實驗動物進行膽管修復，術后6個月移植物完全溶解，切除的新膽管周圍有輕微炎癥，其形態(tài)與天然膽總管相似。Li等[27]使用堿性成纖維細胞生長因子結合膠原作為補片，以促膽管細胞再生的方式修復豬肝外膽管缺損，術后1月除部分實驗動物出現膽汁淤積并形成少許膽泥外，大部分在術后3月行膽囊膽管造影提示膽管通暢良好，未見明顯狹窄及并發(fā)癥。Zong等[28]使用結合人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cell，hMSC)的以聚己內酯為內層、多孔的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]為外層的hMSC-PCL/PLGA雙層支架修復膽管缺損，實驗發(fā)現通過灌流培養(yǎng)的細胞支架具有較高的細胞和細胞外基質積聚，且結合人骨髓間充質干細胞的支架更利于膽道的修復。用于動物實驗的有自體脂肪干細胞膜片、膠原補片、結合堿性成纖維細胞生長因子的膠原支架、由纖維素聚合甘蔗糖蜜制成的細菌纖維素膜、可吸收電紡聚羥乙基天冬酰胺-聚乳酸/聚己內酯板狀支架、電紡聚氨酯人工膽管、聚癸二酸二異丙酯支架、聚二氧六環(huán)酮可吸收生物支架等?？晌諒秃先斯つ懝芸赏ㄟ^溶液燒鑄-浸漬法、靜電紡絲法、凝膠紡絲法或幾種方法復合制造。燒鑄-浸漬法是通過將模具浸入溶解有聚合物的溶劑中，去除溶劑后獲得管狀支架，雖然方法簡便易行但可能會有有毒溶劑的殘留，其孔徑的大小和分布不易控制。靜電紡絲法通過施加高壓電流使電場力克服聚合物溶液表面張力而形成帶電射流，溶劑在射流運動的過程中不斷揮發(fā)，最終在收集器上獲得納米級的纖維，納米纖維具有好的比表面積和孔隙率，有利于細胞的黏附、生長和繁殖[29]。凝膠紡絲法不需要電場力的作用，用注射器將在水中制成溶液的聚合物擠壓出去，使溶液沉積在來回移動的轉軸上，其孔徑大小和分布可通過纏繞方法的不同和后處理來實現，如空氣干燥和冷凍干燥等。合成聚合物在生物醫(yī)學應用面臨的主要問題是生物相容性的普遍缺乏，生物相容性取決于組織反應的范圍和生物環(huán)境，而不是任何材料的給定屬性[30]，與炎癥反應和纖維包裹密切相關。膠原蛋白被大量應用于組織工程，因具有一定的機械強度和優(yōu)異的生物相容性，且膠原支架有利于組織結構再生和功能重建，滲透到膠原支架中的自體細胞會分泌膠原酶降解膠原膜以便產生完整的細胞外基質從而加速其增殖和分化，最后形成天然組織。

2.5 生物3D打印可吸收人工膽管

生物3D打印技術(three-dimensional printing，3D printing)是以計算機三維模型為基礎，制造人工植入支架、組織器官和醫(yī)療輔具等生物醫(yī)學用品的3D打印技術。近年來在動物實驗膽管修復中的應用逐漸增多。Yan等[31]將小鼠膽管細胞、硫醇化明膠與既具有納米結構又具有生物活性的多肽兩親性分子混合物進行充分混合經退熱后運用壓力輔助生物打印進行3D支架打印，使用雙功能的馬來酰亞胺共軛聚乙二醇對支架進行二次交聯增加穩(wěn)定性，通過實驗發(fā)現在生物墨水中加入層粘連蛋白兩親肽對膽管細胞的成熟及形成功能膽管都有很好的促進作用，使支架既具有納米結構特征又具有生物活性。Xiang等[32]的研究將制作好的PLGA支架與甲基丙烯酸明膠(gelatin methacrylate，GelMA)/IKVAV層粘連蛋白肽/超小超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxid，USPIO)的支架進行交聯制成PLGA/GelMA/IKVAV/USPIO復合管狀支架，結果發(fā)現支架在保持良好柔韌性的同時還兼顧了支撐性和促膽管細胞生長的特性，并且具有良好的細胞密度，因具有多孔結構，其力學穩(wěn)定性也得到了提升，實驗將可顯影材料運用在支架中便于分析術前術后支架的特征，但USPIO對細胞的毒性作用不容忽視，是否可應用于臨床仍需進一步驗證與研究[31-32]。Hamada等[33]使用異體豬的成纖維細胞溶液通過生物3D打印技術制作無支架的成纖維細胞管，得到了較好的效果。與傳統(tǒng)人工膽管制造技術相比，3D打印人工膽管不需要預制模具，也不需要在鍛造過程中去除大量材料和使用復雜的鍛造技術，其具有更優(yōu)化的結構、節(jié)約材料和能源等特點。制作生物3D打印可吸收人工膽管的關鍵在于對組織細胞的3D構建能力，因此打印生物材料支架結構和形貌的方式有著至關重要的作用。因成纖維細胞成活率較高，噴墨打印廣泛應用于生物實體打印[34]。噴墨生物打印只能分配氣泡小于10 mPa·s的生物墨水[35]，具有高度通用性的壓力輔助生物打印比較適合組織工程人工膽管的制造。然而，生物墨水的制備也具有挑戰(zhàn)性，如其在培養(yǎng)基中的不溶性及結構穩(wěn)定性，此外還要求其具有與組織細胞相同的降解率及促細胞生長及無毒特性。生物3D打印人工膽管的發(fā)展給予了臨床和相關研究者更多的期待，未來必將是疾病治療中的一件利器。

3 展望

膽管損傷后膽管狹窄是臨床膽道疾病治療面臨的一大難題。近年來隨著組織工程技術的發(fā)展，其作為一種先進的技術，具有制造類似于生物結構的分層結構[36]、滿足組織替換和器官移植的需求等的優(yōu)勢，逐漸為臨床上疾病的治療提供了新的選擇[37-38]。盡管組織工程人工膽管在臨床醫(yī)療方面仍然存在許多爭議如支架降解后的安全性以及異物反應等問題，但隨著科技的發(fā)展、技術的創(chuàng)新和臨床的不斷探索，相信未來在臨床上組織工程人工膽管將會成為膽管損傷后膽道狹窄治療的一大突破和新的治療方式。